轉(zhuǎn)基因玉米das-40278-9品系特異定量pcr精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法。本發(fā)明采用設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列DAS-40278-9event-F、下游引物序列DAS-40278-9event-R、熒光探針序列DAS-40278-9event-P、DAS-40278-9品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明主要建立了一種高擴(kuò)增效率、高準(zhǔn)確度的Taqman定量PCR檢測(cè)技術(shù)，適用于國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)、進(jìn)出境口岸轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢驗(yàn)、企業(yè)內(nèi)部進(jìn)口原材料含轉(zhuǎn)基因DAS-40278-9品系生物成分檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]國(guó)際上很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國(guó)尚無(wú)具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值。為了打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時(shí)彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系，更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法已成為必要。
[0003]目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9的檢測(cè)技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法和標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)關(guān)于擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)(基因序列)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針，
`[0007]上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’-GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’ ；
[0008]下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’ ；
[0009]熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3，。
[0010]轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0011](I)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
[0012]上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’ -GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’
[0013]下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’
[0014]熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3’ ；
[0015](2)制備DAS-40278-9品系的DNA稀釋液；
[0016](3)配制PCR反應(yīng)體系；
[0017](4)定量 PCR 檢測(cè)。
[0018]進(jìn)一步地，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為ΙΟμπιοΙ/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/ μ I。
[0019]再進(jìn)一步地，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3 μ I的DNA稀釋液加入到20 μ I反應(yīng)體系中，所述20 μ I的反應(yīng)體系包括以下組分:[0020]
【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針，其特征在于， 上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’ -GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’ ； 下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’ ； 熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3，。
2.轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，DAS-40278-9event-F:5’ -GTCCAGCACGAACCATTGAGT-3’ 下游引物序列，DAS-40278-9event-R:5’ -TTCATTGTATTCTGGCTTTGCTG-3’ 熒光探針序列，DAS-40278-9event-P:5’ -FAM-CAACAGCACCGTACCTTGAAGCGGAAT-TAMRA-3，； (2)制備DAS-40278-9品系的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應(yīng)體系； (4)定量PCR檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到20μ1反應(yīng)體系中，所述2θμ?的反應(yīng)體系包括以下組分: Taqman Master mix (2X )10M-1上游引物1ul下游引物1ul 熒光探針0.5μ1 DNA稀釋液3.0ul水4.5μ1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-40278-9品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，60°C退火60s，45個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103820566SQ201410094053
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】尹全, 宋君, 雷紹榮, 郭靈安, 劉勇, 王東, 張富麗, 劉文娟, 常麗娟 申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心