專利名稱：同步檢測10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的試劑盒、及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn) 基因食品檢測技術領域，具體涉及實時熒光RCA技術同步檢測10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的試劑盒、及其在檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系中的應用。
背景技術：
隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品已逐步進入普通百姓的生活。由于轉(zhuǎn)基因食品所具有的潛在非安全性，為保護廣大消費者的權益，滿足其選擇權和知情權以及出于國際貿(mào)易的需要，轉(zhuǎn)基因食品的檢測越來越引起各國政府和有關食品監(jiān)督機構的重視。目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法分為兩大類I、免疫學檢測法免疫學檢測法是從蛋白質(zhì)水平對轉(zhuǎn)基因食品進行檢測，即對外源蛋白質(zhì)的測定?？蓪⑵浞譃閃estern雜交、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、試紙條法和快速檢測試劑盒法。免疫學檢測法，其基本原理是通過抗原(antigen)抗體(antibody)之間的特異性反應來實現(xiàn)的。這種方法的不足在于第一，由于抗原抗體反應的專一性，因此一種試劑盒只針對一特定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，無法高通量、快速的檢測具有多種混合成分的食品樣品；第二，加工過的轉(zhuǎn)基因食品中的蛋白質(zhì)抗原性很容易破壞，從而影響檢測結(jié)果的準確性；第三，有些轉(zhuǎn)基因食品不表達蛋白質(zhì)或表達量很低或很大時，則無法進行檢測。2、PCR 檢測法PCR檢測法是目前轉(zhuǎn)基因存在的檢測方法中最為成熟的，它具有靈敏度高、特異性強、可準確定量等優(yōu)點?，F(xiàn)階段常用的PCR技術有定性PCR，定量競爭性PCR和實時熒光定量PCR，PCR-ELISA，巢式擴增PCR和復合擴增PCR。但該項技術的檢測結(jié)果也有可能與實際不相符合，會出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，即檢測物質(zhì)本身含有轉(zhuǎn)基因物而未被檢出，或是本身沒有轉(zhuǎn)基因物質(zhì)，而檢出有轉(zhuǎn)基因成份。目前，由于我國的轉(zhuǎn)基因玉米涉及到的品系種類較多，靶標、序列結(jié)構各不相同，若單一品系逐個檢測則存在著檢測成本高、操作繁瑣的問題。為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，通過研究，解決了鎖式通用探針和特異引物分子設計與篩選的難題，設計、篩選了實時熒光-滾環(huán)擴增(RCA)技術檢測中的鎖式通用探針和特異引物分子，設計、驗證了鎖式探針的兩臂特異序列。首次探索了鎖式探針RCA技術與實時熒光PCR技術相結(jié)合，建立了實時熒光PCR-鎖式通用探針滾環(huán)擴增(RCA)JP :實時熒光RCA，同步檢測10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的高通量、特異性、準確性、高靈敏的檢測技術，填補了國內(nèi)外空白。

發(fā)明內(nèi)容
本研究的目的在于提供一種基于滾環(huán)擴增技術檢測轉(zhuǎn)基因物種的方法。該方法應用一種鎖式探針，包括以下3個部分5’端Tl和3’端T2為檢測臂，與靶標序列互補結(jié)合，可在連接酶作用下使探針環(huán)化；Pl和P2為滾環(huán)擴增的通用引物區(qū)，實現(xiàn)環(huán)狀鎖式探針的級聯(lián)擴增；5’端和3’端之間的與檢測無關的連接序列，或用于基因芯片的Zip區(qū)，實現(xiàn)探針與基因芯片上固體支持物的特異結(jié)合，鎖式探針的結(jié)構如圖4所示如果體系中存在檢測的靶序列，鎖式探針的兩個檢測臂就能與靶序列結(jié)合，在連接酶的作用下其兩個末端被連接起來，形成環(huán)化的鎖式探針，由于鎖式探針和靶序列的雜交會產(chǎn)生較為穩(wěn)定的拓撲結(jié)構，因而也保證了環(huán)化探針的穩(wěn)定性。環(huán)化的鎖式探針可以通過通用引物進行擴增，實現(xiàn)檢測信號的放大以及多元檢測。如果體系中不存在需要檢測的靶序列，線形鎖式探針就不會被連接酶連接形成環(huán)化的鎖式探針，也就不會被通用引物擴增。鎖式探針獨特的設計，滿足了專化性檢測的需要，而且可以結(jié)合多種擴增方式及檢測標記物，適應多種檢測平臺。本發(fā)明的目的檢測未知樣品中，是否含有所述的10種轉(zhuǎn)基因玉米的品系中的一種或多種，即抗蟲和耐除草劑玉米Btll、抗蟲和耐除草劑玉米Btl76、抗蟲和耐除草劑玉 米TC1507、抗蟲玉米M0N810、抗蟲玉米M0N863、耐除草劑玉米GA21、耐除草劑玉米NK603、耐除草劑玉米T25、抗蟲玉米CBH351、抗蟲玉米M0N89034 ；發(fā)明方案①搜集上述10種轉(zhuǎn)基因玉米的品系的特異性基因序列，并且設計了 10對鎖式探針，人工合成并備用。②對樣品提基因組一消化基因組一與鎖式探針連接一利用通用引物放大檢測信號一Roche Lightcycler 480II檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析一給出結(jié)論。通過滾環(huán)擴增技術與待檢測樣品中的靶標序列互補結(jié)合，在連接酶作用下使探針環(huán)化；進一步通過滾環(huán)擴增的通用引物區(qū)，實現(xiàn)環(huán)狀鎖式探針的級聯(lián)擴增。本發(fā)明的技術方案有以下幾方面本發(fā)明的一方面在于，公開一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，包括鎖式探針序列SEQ ID NO :1 10中至少一種。本發(fā)明的另一方面在于，公開一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，包括鎖式探針序列SEQ ID NO : I 10中至少一種以及SEQ ID NO :11 12中至少一種。所述的SEQ ID NO:1Γ12可以+作為陽性對照，因此陽性對照可以選擇某一個或兩個聯(lián)合使用。本發(fā)明的另一方面在于，公開一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，包括十種鎖式探針序列SEQ ID NO Γ10以及可以作為陽性對照的SEQ ID NO Γ 2中的至少一種。本發(fā)明的另一方面在于，公開一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其包括鎖式探針序列 SEQ ID NO Γ 2ο根據(jù)待測樣品中可能存在哪些轉(zhuǎn)基因玉米品系的品種，選擇相應的鎖式探針制成試劑盒，用以檢測待測樣品中是否含有相應的玉米品種。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一、二個技術方案，本領域技術人員可以制備出多種檢測某一種或某幾種轉(zhuǎn)基因玉米品系的試劑盒，也可以根據(jù)本發(fā)明的第三、四個技術方案制備一種能夠同時檢測十種轉(zhuǎn)基因玉米品系的試劑盒，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術確定，并通過配置或商業(yè)途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據(jù)實施例中所列條件做參考依據(jù)進行調(diào)整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現(xiàn)有技術中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。通常試劑盒的使用過程中，引物和探針的終濃度可依照實施例確定出經(jīng)驗值，有必要時，也可進行多濃度測試，以確定最佳的添加量。
DNA模板的添加量因不同種類的DNA模板的溶液中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板添加量。本發(fā)明的另一方面在于，公開一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其中，除了包括前幾個技術方案中所示的鎖式探針之外，還包括通用引物SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 140
設計通用引物的目的是使得環(huán) 化的鎖式探針通過通用引物進行擴增，實現(xiàn)檢測信號的放大以及多元檢測。例如可以參考實施例中的方法——通過實時熒光PCR反應，控制反應條件，并實時監(jiān)測熔解曲線，通過熔解曲線判斷PCR擴增的特異性，判斷反應產(chǎn)物的條帶數(shù)目。也可以根據(jù)熔解溫度(熔解曲線)區(qū)分不同的擴增片段，以達到檢測不同種轉(zhuǎn)基因玉米品系的作用。本發(fā)明的另一方面在于，公開一種實時熒光RCA同步檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系的方法，其操作步驟包括①將轉(zhuǎn)基因玉米品系的干燥種子研磨成粉末，然后分別提取基因組DNA ；其中，上述步驟①中，提取基因組DNA的方法為本領域技術人員的常規(guī)操作，具體過程如下稱取50mg樣品用于DNA提??；加入150 μ L超純水、350 μ L CTAB緩沖液、10 μ L20mg/ml蛋白酶K, 65°C孵育3h ；14, OOOrpm離心5min后，取上清液，加入5 μ L的IOOmg/ml的RNaseA，65°C孵育15min ;加入260 μ LAP2緩沖液，在冰上孵育5min ;以后的步驟按照Qiagen DNeasy Plant Minikit說明書中步驟10開始的后續(xù)步驟操作。其中，上述CTAB 緩沖液20g/L CTAB; I. 4M NaCl; O. IM Tris-HCl; 20mM EDTA0②基因組DNA的消化取步驟①獲得的基因組DNA，于37°C過夜消化；再95°C加熱IOmin使酶失活；其中，消化反應的體系為1500ng步驟①獲得的基因組DNA，10 μ L的I ΧΝΕΒ4緩沖液，終濃度為O. 33U/ μ L的SmaI，終濃度為O. 33U/ μ L的NheI，終濃度為O. 33U/ μ L的EcoRI，終濃度為O. I μ g/ μ L的BSA，蒸餾水補充終體積為30 μ L ;③取4 μ L上述步驟①得到的消化液(相當于含200ng基因組DNA)用于連接，具體反應體系如下2 μ L 的 I XTaq DNA 連接緩沖液(NEB，New England Biolabs 公司)，I μ L 的 IUTaq DNA連接酶(NEB)，25ρΜ的各鎖式探針I(yè) μ L，用蒸餾水補充終體積為10 μ L ;其中，所述的鎖式探針為SEQ ID NO Γ 2中至少一種；鎖式探針能夠與特異性的靶序列結(jié)合，進行特異性的環(huán)化，形成鎖式探針結(jié)構。操作步驟③的時候，加入與待檢測玉米品種相對應的鎖式探針，檢測的結(jié)果為陽性，說明待測樣品中含有與鎖式探針相對應的玉米品種，當待檢玉米樣品是盲樣的時候，本領域技術人員也可以根據(jù)此原則，靈活選用相應的鎖式探針，進行測試。鎖式探針的環(huán)化反應條件940C 5min;再于 95°C 30s, 65°C 5min，進行 30 個循環(huán)；⑤進行實時熒光PCR反應反應體系步驟④所得的產(chǎn)物5 μ L ;通用引物SEQ ID NO : 13和SEQ ID NO :14分別200ηΜ;其余反應所需試劑的使用方法則為本領域技術人員能夠掌握的常規(guī)技術，可以參考試劑盒中所附試劑及說明書進行；
反應條件95°C，3min;再于95°C，10s;60°C，15s;72°C 20s ;進行 40 個循環(huán)；最后 95 °C 5min。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是
本發(fā)明首次探索了鎖式探針RCA技術與實時熒光PCR技術相結(jié)合，建立了實時熒光PCR-鎖式通用探針滾環(huán)擴增(RCA)JP :實時熒光RCA法，可以同步檢測最多10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的高通量、特異性、準確性、高靈敏的檢測技術，鎖式探針獨特的設計，滿足了?；詸z測的需要，而且可以結(jié)合多種擴增方式及檢測標記物，適應多種檢測平臺，填補了國內(nèi)外空白。


圖I :將連接后的鎖式探針經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中IizSSIIb鎖式探針(SEQ ID NO 12)與M0N89034基因組DNA結(jié)合結(jié)果(陽性對照)；條帶清晰；2: Btl I鎖式探針(SEQ ID NO :1)與Btll基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；3:Btl76鎖式探針(SEQ ID NO 2)與Btl76基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；4:TC1507鎖式探針(SEQ ID NO 3)與TC1507基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；5:M0N810鎖式探針(SEQ ID NO 4)與M0N810基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；6:M0N863鎖式探針(SEQ ID NO 5)與M0N863基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；7:GA21鎖式探針(SEQ ID NO 6)與GA21基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；8:NK603鎖式探針(SEQ ID NO 7)與NK603基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；9:T25鎖式探針(SEQ ID NO 8)與Τ25基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；10:CBH351鎖式探針(SEQ ID NO 9)與CBH351基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；11:M0N89034鎖式探針(SEQ ID NO : 10)與M0N89034基因組DNA結(jié)合結(jié)果；條帶清晰；12:Zein鎖式探針(SEQ ID NO 11)與M0N89034基因組DNA結(jié)合結(jié)果(陽性對照)；條帶清晰；13:M0N89034基因組DNA，未與任何鎖式探針結(jié)合；無條帶；Marker λ-Hind III digest DNA Marker. (TaKaRa D3403A)；圖2 SYBR Green實時熒光PCR檢測結(jié)果；圖3 SYBR Green實時熒光熔解曲線。
圖4:鎖式探針的結(jié)構圖。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明中，涉及基因工程操作方面的實驗步驟、實驗試劑配制等方法，如無特殊說明，均為常規(guī)技術。DNA提取、和PCR反應試劑等基因工程實驗中所用試劑均由商業(yè)途徑獲得。實施例I(一)10種轉(zhuǎn)基因玉米品系外源基因信息收集與目標序列的確定通過Genbank下載目標序列信息并設計引物，具體的插入的外源基因信息引證如下，I抗蟲和耐除草劑玉米Btl 1(Insect-Resistant and Herbicide-Tolerant MaizeBtll，以下簡稱Btll)插入的外源基因信息Genbank號AY123624. I2 抗蟲和耐除草劑玉米 Btl76 (Insect-Resistant and Herbicide-TolerantMaize Btl76,以下簡稱Btl76)插入的外源基因信息Genbank號AJ878607. I3 抗蟲和耐除草劑玉米 TC1507 (Insect-Resistant and Herbicide-TolerantMaize TC1507,以下簡稱TC1507)插入的外源基因信息Genbank號AM182233. I4 抗蟲玉米 M0N810 (Insect-Resistant Maize M0N810,以下簡稱 M0N810)插入的外源基因信息Genbank號AF434709. I5 抗蟲玉米 M0N863 (Insect-Resistant Maize M0N863,以下簡稱 M0N863)插入的 外源基因信息=Genbank號⑶370780. I6 耐除草劑玉米 GA21 (Herbicide-Tolerant Maize GA21,以下簡稱 GA21)插入的外源基因信息Genbank號X63374. I7 耐除草劑玉米 NK603 (Herbicide-Tolerant Maize NK603,以下簡稱 NK603)插入的外源基因信息Genbank號X86563. 2通過Genbank下載的目標序列信息AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACTAGAGTGGAAGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGATATCCCTAGGGCGGCCGCGTTAACAAGATTACTCGAGGTCATTCAT8耐除草劑玉米T25 (Herbicide-Tolerant Maize T25,以下簡稱T25)插入的外源基因信息Genbank號GQ497217. I9 抗蟲玉米 CBH351 (Insect-Resistant Maize CBH351,以下簡稱 CBH351)插入的外源基因信息Genbank號AY346129. I10 抗蟲玉米 M0N89034(Insect_Resistant Maize M0N89034，以下簡稱 M0N89034)插入的外源基因信息Genbank號⑶574780. I(二)對10種轉(zhuǎn)基因玉米品系進行鎖式探針設計I.比對序列、尋找特異性位點及片段；首先下載所有目標序列和已知的近似種的序列，再將具有代表性的目標序列進行Blastn比對，看是否有未下載的近似種序列。利用DNAMAN軟件或其他軟件進行序列比對，必要時去除多余的其它序列，以免影響比對結(jié)果，將有特異性的位點用高亮標記，并將特異性位點左30nt，右30nt粘貼出，再次進行Blastn比對，并保存比對結(jié)果。2.特異性片段分析；對復合要求的待選片段進行分析(主要考慮GC含量及分布)。以所選特異性位點為分界，設計特異性的3’端特異性序列和5’端特異性位點。3.建立特異性的Zipcode標簽數(shù)據(jù)庫；通過DNAMAN軟件進行隨機生成序列，GC含量控制在55 60%之間，長度20nt，通過Primer 5軟件計算Tm值,并控制在6(TC 65 之間。然后對符合要求的Zipcode進行Blastn比對，并記錄比對結(jié)果，將與其它物種無明顯親緣關系的序列增加到Zipcode數(shù)據(jù)庫中。4.組裝鎖式探針利用DNAMAN軟件進行2級結(jié)構分析。鎖式探針采用手工設計，計算并檢測熔解溫度和二級結(jié)構。所有的鎖式探針都包括一個5’ -磷酸基團用于連接。目標序列位于植物基因組內(nèi)，整個鎖式探針序列經(jīng)檢測無SmaI, NheI和EcoRI限制性酶切位點(通常這些限制性內(nèi)切酶用于消化基因組DNA)。鎖式探針設計時需滿足5’端24 32nt熔解溫度在68 72°C，3’端12 15nt熔解溫度在4(T50°C。鎖式探針序列，具體信息如下LBtll對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO 1,2. Bt176對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO 2,3. TC1507對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO :3，4.M0N810對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO 4,5.M0N863對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO 5,6. GA21對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO :6，7.NK603對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO -J,8. T25對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO :8，9. CBH351對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO :9，10.M0N89034對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO 10,11. Zein對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO 11,12. zSSIIb對應的鎖式探針的基因序列為SEQ ID NO :12。其中，上述Zein (SEQ ID NO :ll)、zSSIIb (SEQ ID NO :12)是陽性對照。二者都是針對玉米內(nèi)源基因設計的檢測基因，通過對這兩個基因是否被擴增來監(jiān)控PCR反應是否正常進行，從而有效防止假陰性的結(jié)果。在下述實施例中，陰性對照選用了 M0N89034基因組DNA,不與任何鎖式探針結(jié)合。送寶生物工程(大連)有限公司人工合成。(三)實時熒光RCA技術同步檢測10種轉(zhuǎn)基因玉米品系研究I基因組DNA的提取
抗蟲和耐除草劑玉米Btll、抗蟲和耐除草劑玉米Btl76、抗蟲和耐除草劑玉米TC1507、抗蟲玉米M0N810、抗蟲玉米M0N863、耐除草劑玉米GA21、耐除草劑玉米NK603、耐除草劑玉米T25、抗蟲玉米CBH351、抗蟲玉米M0N89034 ;上述各轉(zhuǎn)基因玉米品系的陽性標準樣品，均購自 AOCS(American oil chemists’ s society)。分別將上述10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的陽性標準樣品研磨成粉末，然后按照下列操作步驟分別提取基因組DNA (參考德國Qiagen-DNeasy Plant Mini kit)稱取50mg用于DNA提取。加入150 μ L超純水和350 μ L CTAB緩沖液(20g/LCTAB; I. 4M NaCl; O. IM Tris-HCl; 20mM EDTA)，10 μ L 20mg/ml 蛋白酶 K 中，65°C孵育 3h。14, OOOrpm 離心 5min 后，取上清液，加入 5 μ L RNaseA(德國 Qiagen, 100mg/ml), 65°C孵育15min。加入 260 μ L ΑΡ2 緩沖液(德國 Qiagen-DNeasy Plant Mini kit),在冰上孵育 5min。以后的步驟參照德國Qiagen-DNeasy Plant Mini kit試劑盒說明書中步驟10開始的后續(xù)步驟未做修改。DNA 濃度米用 NanoDrop spectrophotometer (NanoDrop ND-1000)進行檢測。2基因組DNA的消化及鎖式探針連接①上述10種轉(zhuǎn)基因玉米品系分別做此實驗
分別取待測轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA各1500ng，于37°C過夜消化，再95°C加熱IOmin使酶失活；其中，消化反應的體系為1500ng基因組DNA，10 μ L的I ΧΝΕΒ4緩沖液，終濃度為O. 33U/ μ L的Smal，終濃度為O. 33U/ μ L的NheI，終濃度為O. 33U/ μ L的EcoRI，終濃度為O. I μ g/ μ L的BSA,蒸餾水補充終體積為30 μ L0 ②分別取4 μ L上述步驟①得到的消化液(約含200ng基因組DNA)用于連接，具體反應體系如下2 μ L 的 I XTaq DNA 連接緩沖液(NEB，New England Biolabs 公司)，I μ L 的 IUTaq DNA連接酶(NEB)，25ρΜ的各鎖式探針(每次連接時候，分別加入與各待檢玉米品種相對應的鎖式探針)分別取I μ L,分別用蒸餾水補充終體積為10 μ L。在ABI GeneAmp 9700Thermo Cycler 中進行環(huán)化，反應條件940C 5min;95°C 30s, 65°C 5min，進行 30 個循環(huán)。3鎖式探針環(huán)化特異性將連接后的鎖式探針各取5 μ L，于I. 5%瓊脂糖凝膠電泳上進行環(huán)化特異性分析，結(jié)果如圖I所示，結(jié)果顯示設計的10種轉(zhuǎn)基因玉米品系線性鎖式探針均能夠與特異性的靶序列結(jié)合，進行特異性的環(huán)化，形成鎖式探針結(jié)構。4Real-time PCR 檢測環(huán)化探針環(huán)化的鎖式探針可以通過通用引物進行擴增，實現(xiàn)檢測信號的放大以及多元檢測。通過人工合成的方式，合成一對通用引物，即送寶生物工程(大連)有限公司人工合成正向引物SEQ ID NO :13和反向引物SEQ ID NO :14。采用SYBR Green I X SYBR Green master mix (MCLAB)進行實時熒光 PCR 反應包括200nM的通用引物正向引物SEQ ID NO :13和反向引物SEQ ID NO 140 5 μ L鎖式探針連接混合物。SYBR Green I X SYBR Green master mix 12. 5 μ L，加 dH20 補至 23 μ L。應用 Roche Lightcycler 480II 檢測系統(tǒng)。反應條件反應條件95°C，3min;再于95°C，10s;60°C，15s;72°C 20s ;進行 40 個循環(huán)；最后95°C 5min。從55°C開始監(jiān)測熔解曲線。在常規(guī)定量PCR中經(jīng)常用到熔解曲線。當使用SYBR Green I為熒光染料時，在PCR擴增結(jié)束后通常要運行一步熔解曲線反應程序。即將PCR產(chǎn)物的溫度由低到高逐步升高，在升溫的過程中，雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA分子，原先與雙鏈結(jié)合的熒光染料分子就與DNA脫離，而不再產(chǎn)生熒光信號。因此，隨著溫度的升高，樣品的熒光信號由強轉(zhuǎn)弱，從而形成一個熒光信號隨溫度升高而減弱的熔解曲線圖，再以熒光值隨溫度的變化率為縱坐標作圖，就形成熒光變化率隨溫度變化的峰形圖，每一個樣品在該圖上呈現(xiàn)為一個峰形曲線。這個峰值所對應的特定溫度我們就稱之為該樣品的熔解溫度Tm，在該溫度下50%的雙鏈已解鏈變?yōu)閱捂湣Ｈ劢鉁囟萒m會各不相同，通常片段越長、GC含量越高的片段其熔解溫度就越高，因而每條DNA序列都有其特定的熔解曲線和熔解溫度。如果在PCR擴增中出現(xiàn)非特異的擴增，那么就會出現(xiàn)多個熔解峰/Tm。我們可以通過熔解曲線判斷PCR擴增的特異性，判斷反應產(chǎn)物的條帶數(shù)目。同理，也可以根據(jù)熔解溫度(熔解曲線)區(qū)分不同的擴增片段。
5實時熒光RCA同步檢測結(jié)果實時熒光RCA同步檢測結(jié)果如表

權利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其特征在于包括鎖式探針序列SEQ ID NOΓ10中至少一種。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其特征在于包括鎖式探針序列SEQ ID NO Γ10中至少一種以及SEQ ID NO : 11 12中至少一種。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其特征在于包括鎖式探針序列SEQ ID NO Γ10以及SEQ ID NO : 11 12中至少一種。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其特征在于包括下述鎖式探針序列SEQ ID NO Γ120
5.如權利要求廣4中任一項所述的一種轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測試劑盒，其特征在于還包括通用引物SEQ ID Ν0:13和SEQ ID NO :14。
6.一種同步檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系的方法，其操作步驟包括 ①將待測轉(zhuǎn)基因玉米品系的干燥種子研磨成粉末，分別提取基因組DNA； ②基因組DNA的消化 取步驟①獲得的基因組DNA 1500ng，于37°C過夜消化；再95°C加熱IOmin使酶失活；其中，消化反應的體系為1500ng步驟①獲得的基因組DNA，10 μ L的1ΧΝΕΒ4緩沖液，終濃度為O. 33U/ μ L的SmaI，終濃度為O. 33U/ μ L的NheI，終濃度為O. 33U/ μ L的EcoRI，終濃度為O. I μ g/ μ L的BSA,蒸餾水補充終體積為30 μ L ; ③鎖式探針連接 取步驟②獲得的產(chǎn)物4 μ L ;2 μ L的I X Taq DNA連接緩沖液，I μ L的IU Taq DNA連接酶，25ρΜ的鎖式探針I(yè) μ L，用蒸餾水補充終體積為10 μ L ;其中，所述的鎖式探針為SEQ IDNO Γ 2中至少一種； 反應條件94°C 5min;95°C 30s, 65°C 5min，進行30個循環(huán)；使其環(huán)化； ④實時熒光PCR反應 步驟③所得的產(chǎn)物5 μ L ; 通用引物 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 分別 200ηΜ ； 反應條件95V , 3min;95°C，10s; 60。。，15s; 72。。20s ；40 個循環(huán)；95°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開一種實時熒光RCA技術同步檢測10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的試劑盒、及其使用方法，屬于轉(zhuǎn)基因食品檢測技術領域，其通過鎖式探針RCA技術與實時熒光PCR技術相結(jié)合，建立了實時熒光PCR-鎖式通用探針滾環(huán)擴增(RCA)，針對10種轉(zhuǎn)基因玉米品系分別設計鎖式探針SEQ ID NO1~10，通過滾環(huán)擴增技術與待檢測樣品中的靶標序列互補結(jié)合,在連接酶作用下使探針環(huán)化;進一步通過滾環(huán)擴增的通用引物區(qū),實現(xiàn)環(huán)狀鎖式探針的級聯(lián)擴增;本發(fā)明試劑盒具有高通量、特異性、準確性、高靈敏等特點，鎖式探針獨特的設計，滿足了?；詸z測的需要，而且可以結(jié)合多種擴增方式及檢測標記物，適應多種檢測平臺，填補了國內(nèi)外空白。
文檔編號C12Q1/68GK102719533SQ20121017212
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權日2012年5月30日
發(fā)明者徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟, 趙昕 申請人:徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟, 趙昕