專利名稱：一種骨骼肌特異性MYHC-II b啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了ー種骨骼肌特異性表達(dá)基因5'調(diào)控區(qū)特異性MYHC-II b啟動(dòng)子及其在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真核生物基因表達(dá)的時(shí)間和水平嚴(yán)格按照發(fā)育順序進(jìn)行。某些特定基因表達(dá)模式的調(diào)節(jié)能夠引起轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)元件的特異性結(jié)合，成為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟，并最終導(dǎo)致基因的時(shí)間和空間表達(dá)。編碼組織特異蛋白的系列家族基因嚴(yán)格按照組織特異性和發(fā)育階段性表達(dá)，為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了很好的研究模式。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，獲得能廣泛應(yīng)用的特異性啟動(dòng)子顯得非常重要。但啟動(dòng)子的特異性由多個(gè)元件控制，在不同種類和不同發(fā)育時(shí)期起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件并不相同，調(diào)控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復(fù)雜。因此要使外源基因能夠在動(dòng)物組織中特異高效地表達(dá)，必須構(gòu)建ー個(gè)可以特異高效表達(dá)的動(dòng)物表達(dá)載體，其中啟動(dòng)子的選擇是重要的條件之一。肌球蛋白(myosin)是ー組肌肉和非肌肉細(xì)胞收縮裝置中的蛋白質(zhì)，具有ATP酶活性。重鏈的大部分是a螺旋，其頭部具有ATP酶活性，并與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，而輕鏈具有激酶活性。肌肉中的肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成単位。頭部具有ATP酶活性，屬于可與肌動(dòng)蛋白絲相互作用的馬達(dá)蛋白質(zhì)；肌球蛋白也是肌肉的主要組成蛋白質(zhì)，占肌原纖維總蛋白質(zhì)的60%。豬的骨骼肌肌球蛋白重鏈基因MYHC-I、MYHC-II a、MYHC_II b、MYHC_II x都位于12號(hào)染色體。其中MYHC-II b由38個(gè)外顯子和37個(gè)內(nèi)含子組成，編碼1937個(gè)氨基酸。通過(guò)克隆該基因啟動(dòng)子區(qū)并在體外分析其啟動(dòng)特性，利用相關(guān)序列構(gòu)建骨骼肌特異性表達(dá)載體是ー種有效的方法，但是上述的研究均還處在起步階段，對(duì)于轉(zhuǎn)基因豬的培育和品質(zhì)提高均沒(méi)有起到較好的促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌肌球蛋白重鏈基因MYHC-II b基因5'調(diào)控區(qū)具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，并利用這ー特性設(shè)計(jì)了ー種骨骼肌特異性MYHC-II b啟動(dòng)子載體，該啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因豬的培育中應(yīng)用。該啟動(dòng)子載體具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無(wú)啟動(dòng)活性，可見(jiàn)該啟動(dòng)子在骨骼肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了ー種重要的元件。本發(fā)明所提供的骨骼肌特異性表達(dá)基因5'調(diào)控區(qū)特異性啟動(dòng)子，其基因序列如Seq ID No 1 所示；除了上述的啟動(dòng)子之外，還可以是該啟動(dòng)子變體或者片段，但均具有如Seq IDNo I所不的基因序列?！白凅w”是指對(duì)豬骨骼肌MYHC-II b啟動(dòng)子Seq ID No : I序列進(jìn)行ー個(gè)或者多個(gè)堿基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失或者添加所產(chǎn)生的序列，該序列仍然表現(xiàn)出類似于Seq ID No :1DNA序列的活性?！捌巍笔侵富矩i骨骼肌MYHC-II b啟動(dòng)子Seq ID No :1序列的一個(gè)或者多個(gè)區(qū)域，其仍然類似于基本DNA序列的活性。具有上述序列的啟動(dòng)子或其變體，或者片段，具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，而在骨骼肌之外的多種細(xì)胞中均無(wú)啟動(dòng)活性，可見(jiàn)該基因啟動(dòng)子在骨骼肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，并能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬的培育中。應(yīng)用上述的啟動(dòng)子時(shí)，一般采用重組核酸序列，該序列中含有上述的啟動(dòng)子或其變體，或者片段，這樣就可以使啟動(dòng)子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)，作為分析、開(kāi)發(fā)、改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學(xué)操作技術(shù)獲得包含目的 基因的重組核酸，通過(guò)顯微注射等基因?qū)爰夹g(shù)獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。重組核酸序列中的目的基因，含有下列的至少ー種功能基因，主要包括提高肌肉品質(zhì)基因，カロ快生長(zhǎng)速度基因，抗病基因，提聞詞料報(bào)酬的基因以及生廣特定藥物的基因，這樣就可以在獲得骨骼肌特異性啟動(dòng)特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉(zhuǎn)基因豬的培育提供更多的功能性方向，増加其附加產(chǎn)值，如將去飽和脂肪酸酶基因在該啟動(dòng)子指導(dǎo)下表達(dá)可以特異性提高骨骼肌中不飽和脂肪酸的含量，提高肉品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在獲得了上述的重組核酸序列之后，還可以用其建立特殊的表達(dá)系統(tǒng)，以便更好的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因豬的培育過(guò)程中。將目的基因重組至該啟動(dòng)子下游，通過(guò)基因轉(zhuǎn)入技術(shù)使調(diào)控區(qū)與目的基因共同整合進(jìn)染色體中，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在該啟動(dòng)子作用下目的基因僅在骨骼肌中表達(dá)，在其他組織器官中不表達(dá)，降低目的基因?qū)?dòng)物的影響，提高轉(zhuǎn)基因的效果。本發(fā)明主要通過(guò)報(bào)告基因分析確定該啟動(dòng)子的啟動(dòng)特征。首先獲得無(wú)啟動(dòng)子紅色熒光蛋白載體。然后通過(guò)PCR或者基因捕獲等技術(shù)獲得骨骼肌中特異性表達(dá)的豬骨骼肌肌球蛋白重鏈II b型5'調(diào)控區(qū)，長(zhǎng)度為2. lkb，插入紅色熒光蛋白上游，得到啟動(dòng)子報(bào)告基因分析載體，將CMV啟動(dòng)子(589 bp)連入空載體中作為陽(yáng)性對(duì)照，空載體為陰性對(duì)照。質(zhì)粒去內(nèi)毒素后，轉(zhuǎn)染C2C12小鼠成肌細(xì)胞系，同時(shí)轉(zhuǎn)染H9c2大鼠心肌細(xì)胞和豬腎上皮細(xì)胞系PK15為對(duì)照，轉(zhuǎn)染24h后更換含馬血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至成肌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞分化融合，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白表達(dá)情況，分析啟動(dòng)子特性。其中之所以選擇CMV連入的空載體中作為陽(yáng)性對(duì)照，主要是因?yàn)镃MV為已知公認(rèn)的強(qiáng)啟動(dòng)子，將強(qiáng)啟動(dòng)子連入無(wú)啟動(dòng)子的載體上游可以啟動(dòng)報(bào)告基因RFP的表達(dá)，該載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，可以證明實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染技術(shù)等不存在問(wèn)題，證明明性對(duì)照無(wú)RFP表達(dá)是由于沒(méi)有啟動(dòng)子的存在，而不是其他因素造成。進(jìn)而更有力的證明連入實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后啟動(dòng)RFP的表達(dá)是因?yàn)樵搯?dòng)子的作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明選用了獨(dú)特的載體DsRed載體(商業(yè)載體全稱為pDsRed-Express2-lvector),以適應(yīng)本發(fā)明所米用的報(bào)告基因RFP(紅色突光蛋白)，同時(shí)本發(fā)明為MYHC-II b特別設(shè)計(jì)了引物、啟動(dòng)子序列以及酶切位點(diǎn)等供研究使用，均具有獨(dú)特的代表性，因此與現(xiàn)有的骨骼肌特異性啟動(dòng)子相比，本發(fā)明的技術(shù)具有明顯的不同和顯著的進(jìn)步和針對(duì)性。當(dāng)上述的啟動(dòng)子，或者重組核酸序列或者表達(dá)系統(tǒng)被應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因豬的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通過(guò)添加各種功能性基因，使得轉(zhuǎn)基因豬可以獲得更好的肌肉品質(zhì)，更高的生長(zhǎng)速度，更好的抗病性以及降低飼養(yǎng)成本，還可以在特定藥物的生產(chǎn)中得到更為廣泛的應(yīng)用，對(duì)于該領(lǐng)域的研究有著很好的參考價(jià)值。


圖I為MYHC-II bF和MYHC-11 bR引物PCR擴(kuò)增MYHC-11 b啟動(dòng)子片段電泳圖，圖中泳道I為PCR產(chǎn)物，M為MassRuler Maker ；圖2為無(wú)啟動(dòng)子的DsRed載體圖譜；圖3為轉(zhuǎn)染MYHC-II b promoter DsRed 48h小鼠C2C12細(xì)胞照片灰度圖，圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，可見(jiàn)RFP表達(dá)，MYHC-II b promoter有啟動(dòng)活性；圖4為轉(zhuǎn)染MYHC-II b promoter DsRed 48h大鼠心肌H9c2細(xì)胞照片灰度圖，圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，無(wú)RFP表達(dá)，MYHC-II b promoter無(wú)啟動(dòng)活性；圖5為轉(zhuǎn)染CMV Promoter DsRed 48h豬心細(xì)胞照片灰度圖，圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，可見(jiàn)RFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效；圖6為轉(zhuǎn)染MYHC-IIb promoter DsRed 48hPK15豬腎細(xì)胞照片灰度圖，圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，無(wú)RFP表達(dá)，MYHC-II b promoter無(wú)啟動(dòng)活性；圖7為轉(zhuǎn)染CMV Promoter DsRed 48hPK15豬腎細(xì)胞照片灰度圖，圖中左側(cè)為40倍光鏡下照片，細(xì)胞狀態(tài)良好；右側(cè)為綠光激發(fā)下照片，可見(jiàn)RFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染技術(shù)有效。
具體實(shí)施例方式在本說(shuō)明書的上下文中，除非特別指明否則本說(shuō)明書所用的任何術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)試驗(yàn)方法或按照供應(yīng)商所建議的操作說(shuō)明書進(jìn)行的。實(shí)施例I啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建基因組提取取大約克夏豬耳組織,按照TIANamp genomic DNA (天根)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行基因組DNA提取。無(wú)啟動(dòng)子的DsRed載體作為陰性對(duì)照；以DsRed為骨架用Sma I (Fermentas)酶切，回收4107bp片段，得到無(wú)啟動(dòng)子片段。將完整的CMV啟動(dòng)子正向連入該載體中，得到該載體的陽(yáng)性對(duì)照載體。將包含陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照載體的菌液按照I : 500的比例分別接種至含卡那霉素100 Ii g/ml LB培養(yǎng)基中,200rpm劇烈搖晃14h。4°C 6000g收集菌體至50ml離心管中，用于無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，具體操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)說(shuō)明書進(jìn)行,純化得到的質(zhì)粒A260/280在I. 8-1. 9之間。根據(jù)NCBI (Gene ID :100144306)設(shè)計(jì)如下引物，MYHC-II bF 基因序列如 Seq IDNo 2所示，MYHC-II bR基因序列如Seq ID No 3所示,它包含了從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游8bp到上游2090bp的范圍。
權(quán)利要求
1.ー種骨骼肌特異性MYHC-IIb啟動(dòng)子，其特征在干該啟動(dòng)子的基因序列如Seq IDNo 1所示。
2.一種重組核酸序列，其特征在干序列中包含有基因序列如Seq ID No : I所示的啟動(dòng)子或者該啟動(dòng)子的變體，或者片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所屬的重組核酸序列，其特征在于序列中還包含有至少ー種功能基因，所述功能基因包括提聞肌肉品質(zhì)基因或加快生長(zhǎng)速度基因或抗病基因或提聞詞料報(bào)酬的基因或生產(chǎn)特定藥物的基因或其組合。
4.ー種表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于包含有如權(quán)利要求2或3所述的重組核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種骨骼肌特異性MYHC-IIb啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別提供了一種骨骼肌特異性表達(dá)基因5′調(diào)控區(qū)特異性啟動(dòng)子及其在轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用，該啟動(dòng)子只在骨骼肌中具有啟動(dòng)特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無(wú)啟動(dòng)活性，可見(jiàn)該基因啟動(dòng)子只在骨骼肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，因此能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)提高豬肉的品質(zhì)提供了一種重要的元件。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102649960SQ201210171830
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者姜運(yùn)良, 季相山, 康麗, 張旭, 王鵬飛 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)