專利名稱:Hedgehog激動劑在治療肌骨骼相關障礙中的用途的制作方法
HEDGEHOG激動劑在治療肌骨骼相關障礙中的用途
背景技術:
Hedgehog(Hh)信號傳導首先是在果蠅中鑒定出來的,作為胚胎圖式形成的一個 重要的調(diào)節(jié)機制,或作為一個過程,通過該過程胚胎細胞形成有序的分化組織的空間排布 (Nusslein-Volhard等人(1980)Nature 287,795-801)。在哺乳動物細胞中,已經(jīng)鑒定出三 禾中Hedgehog基因,Sonic Hedgehog(Shh) > India Hedgehog(Ihh)禾口Desert Hedgehog(Dhh)0 Hedgehog基因編碼分泌性蛋白,其經(jīng)歷翻譯后修飾,包括N-端的自催化剪切和脂質(zhì)修飾 (棕櫚?;?以及C-端的膽固醇修飾。脂質(zhì)修飾的N-端Hedgehog蛋白觸發(fā)蛋白質(zhì)途徑的信號傳導活性,并且通過來自 信號傳導細胞的可溶性Hedgehog蛋白的發(fā)送以及應答細胞的接收引起細胞與細胞的通 信。在應答細胞中,12-通道跨膜受體Patched(Ptch)用作Hh信號傳導的負調(diào)節(jié)物,并且 7-通道跨膜蛋白SmoothenecKSmo)用作Hh信號傳導的正調(diào)節(jié)物。在靜止狀態(tài)下,游離的 Ptch(即未被Hh結合的)以亞化學計量抑制Smo誘導的途徑活性(Taipale等人(2002) Nature 418:892);但是,當結合配體Hh蛋白后,Smo的抑制被解除,并且產(chǎn)生的信號級聯(lián)放 大導致Gli轉(zhuǎn)錄因子(Glil、Gli2和Gli3)的活化和核移位。Hh信號轉(zhuǎn)錄的下游靶基因包括Wnts、TGFii以及Ptc和Glil,這些基因是正和負 調(diào)節(jié)反饋回路的基礎。數(shù)個細胞周期和增殖調(diào)節(jié)基因(例如C-myC、CyClin D和Ε)也在Hh 信號傳導的靶基因中。Shh信號傳導對于胚胎發(fā)育是至關重要的,并且特別是對于引發(fā)肌生成和肌祖細 胞擴展是必需的(Duprez,D 等人(1998)Development 125,495-505) (Cossu,G 等人(1999) Embo J 18,6867-72)。盡管知之較少,但是最近的證據(jù)表明Shh信號傳導在局部缺血或肌損 傷后的成人肌肉中重新活躍(Pola,R.等人(2003)Circulation 108,479-85) 同時,已經(jīng) 證實重組Shh蛋白(rShh)促進從小鼠和雞骨骼肌分離的肌衛(wèi)星細胞(SC)的增殖(Koleva, Μ.等人(2005)Cell Mol Life Sci 62,1863-70) (Elia,D. (2007)Biochim Biophys Acta 1773,1438-46)。SC是骨骼肌中最具特征的固有干細胞,并且它們對于骨骼肌組織的內(nèi) 在再生提供一種方法(Collins,C. A.等人(2005)Cell Cycle 4,1338-41) (Tajbakhsh, S. (2005)Exp Cell Res 306,364_72)。但是,在損傷、遺傳疾病或老化的情況中,這種再生 能力降低了。Sonic hedgehog(Shh)信號傳導對于胚胎肌發(fā)育過程中的前體細胞擴展至關 重要,并且在肌損傷后的成年人中再次活化。通常,衛(wèi)星細胞在肌膜和基底層間的肌纖維邊緣保持靜止,但是可以響應肌肉刺 激(例如鍛煉或創(chuàng)傷)而活化(Bornemann,A.等人(1999) Neuropediatrics 30,167-75)。 在人類中,認為衛(wèi)星細胞的數(shù)量和活化潛力隨著年齡的增長而降低(Sajko,S.等人(2004) J Histochem Cytochem 52,179-85)。另外,患有遺傳疾病(例如肌營養(yǎng)不良)的患者可能 遭受再生失敗,這意味著衛(wèi)星細胞更新不是無限的。這些類型的肌病最終可以用基于細胞的療法來治療,但是,增強內(nèi)源性干細胞增 殖的藥理學治療具有顯著的治療價值。Hh信號傳導途徑的激動劑被認為作為肌損傷或疾 病的治療具有治療功效,并且由此是本領域研究者的興趣點,并且是較廣泛的科學共同體。由于目前還沒有化合物能夠活化內(nèi)源性肌衛(wèi)星細胞,激動Shh的化合物(其能夠以與重組 Shh蛋白類似方法發(fā)揮作用)的鑒定對于治療肌病和肌骨骼障礙是需要的。發(fā)明概述本發(fā)明通常涉及與Hedgehog途徑相關的肌骨骼障礙的診斷和治療,所述的 障礙包括但不限于肌營養(yǎng)不良(例如迪謝納肌營養(yǎng)不良),該方法應用激動Sonic Hedgehog (shh)并且從而激動Hedgehog信號傳導途徑的藥物。所述的激動劑包括例如本發(fā) 明化合物(例如式I化合物)。本發(fā)明的方法和化合物涉及例如通過活化獨立于Shh配體 的Smo受體來激動Hedgehog信號傳導途徑,并且包括將細胞與足量的本發(fā)明化合物(例如 式I化合物)接觸以激動正常的Shh活性,拮抗正常的Ptc活性,或激動smoothened活性 (例如逆轉(zhuǎn)或控制異常的生長狀態(tài))。本發(fā)明的一個方面提供了應用化合物激動Hedgehog(配體)-非依賴性途徑活化 的可用方法。在某些實施方案中,本方法可以用于抵抗Hedgehog途徑不需要的抑制的表型 效應,例如由Hedgehog喪失功能、Ptc獲得功能或smoothened喪失功能突變引起的。例如, 本方法可以包括將細胞(體外或體內(nèi))與足量Shh激動劑、例如本發(fā)明化合物(例如式I 化合物(例如Shh-Ag))或其它小分子接觸,以激動Hedgehog-非依賴性活化途徑。本發(fā)明化合物(下面進一步描述)包括Hedgehog(例如Sonic Hedgehog)合成、 表達、產(chǎn)生、穩(wěn)定、磷酸化、細胞內(nèi)再定位和/或活性的小分子激動劑。本發(fā)明化合物包括但 不限于式I化合物。本發(fā)明提供了測定已知上調(diào)sonic hedgehog途徑的藥物是否增加初級成肌細胞 增殖(例如以PI3K/Akt-依賴方式)的方法,該方法包括⑴將藥物施用于非人類個體;和 ( )測定個體產(chǎn)生的初級成肌細胞增殖是否大于未施用藥物的個體,從而測定藥物是否增 加初級成肌細胞增殖。本發(fā)明提供了測定已知上調(diào)sonic hedgehog途徑的藥物是否促進衛(wèi)星細胞(SC) 增殖的方法,該方法包括⑴將藥物施用于非人類個體;和( )測定個體產(chǎn)生的衛(wèi)星細胞 (SC)增殖是否大于未施用藥物的個體,從而測定藥物是否促進衛(wèi)星細胞(SC)增殖。本發(fā)明進一步提供了治療肌骨骼障礙的方法,該方法通過給患者施用治療有效量 的已知激動或另外上調(diào)sonic hedgehog途徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌 細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力的藥物而實現(xiàn),其中該能力是通過下面方法來測 定的,該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的細胞增殖是否大 于未施用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了抑制肌骨骼障礙發(fā)作的方法,該方法通過給需要的個體施用 預防有效量的已知激動或另外上調(diào)sonic hedgehog途徑并且測定具有增加細胞增殖(例 如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力的藥物而實現(xiàn),其中該能力是通過下 面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用給非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的細胞 增殖的增加是否大于未施用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了組合物,該組合物包含(a)可藥用載體,和(b)已知上調(diào) sonic hedgehog途徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC) 的增殖)的能力的藥物,其中該能力是通過下面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用 于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)
5的增殖)的增加是否大于未施用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了制備品,該制備品包括其中具有已知上調(diào)sonic hedgehog途 徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力 的藥物的包裝材料,和表示藥物在抑制個體肌骨骼障礙發(fā)作中的用途的標簽,其中這種能 力是通過下面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體 產(chǎn)生的細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施 用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了制備品,該制備品包括其中具有已知上調(diào)sonic hedgehog途 徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力 的藥物的包裝材料,和表示藥物在治療個體肌骨骼障礙中的用途的標簽,其中這種能力是 通過下面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生 的細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用藥 物的個體。本發(fā)明的方法可以用于體外和/或體內(nèi)例如在形成新的或再生的肌肉組織中調(diào) 節(jié)細胞的增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)。在另一個特別的實施方 案中,將細胞與本發(fā)明化合物(例如式I化合物)接觸或?qū)⒈景l(fā)明化合物(例如式I化合 物)引入細胞中導致促進細胞增殖和肌骨骼損傷或障礙的恢復。因此,另一個特別的實施 方案提供了通過在損傷的或患病的肌細胞中應用本發(fā)明化合物(例如式I化合物)來激動 Hh途徑的方法。附圖簡述
圖1證實了 Shh-Ag治療誘導Glil表達并且促進成肌細胞和衛(wèi)星細胞的增殖。如 圖IA所示,Glil mRNA在Shh-Ag(IOyM)治療24小時后,在sonic-hedgehog敏感的萊迪希 細胞系、TM3、初級小鼠成肌細胞(PM)、C2C12成肌細胞和分離的衛(wèi)星細胞(SC)中上調(diào)。圖 表示平均值士標準差,并且相比載體處理=1來表示。< 0. 05。如圖IB所示,Shh-Ag 治療(24小時)促進了初級成肌細胞的增殖,增加了細胞周期G2/M期中細胞的百分數(shù)。PI 染色后,F(xiàn)ACS分析的實例和圖形概括均顯示。< 0. 05。如圖IC所示,用Shh-Ag治療48 小時誘導分離的SC的增殖,增加了總細胞數(shù)和BrdU摻入細胞的百分數(shù)。< 0. 05。圖2A描述了 LY29002 (1 μ Μ)、磷脂酰肌醇3_激酶/Akt途徑抑制劑對Shh-Ag誘導 的成肌細胞增殖的封閉作用。圖2Β顯示了 Shh-Ag或重組sonic hedgehog蛋白(rSHH)治 療(1 μ g/mL)后Glil和Cyclin Dl蛋白水平的增加完全被LY29002-介導的PI3K/AKT抑 制所封閉。數(shù)值表示相比載體=100所得到的平均光密度測定得分。*P<0.05。圖3是體內(nèi)試驗設計的圖形描述,本文進一步詳述。6至8周齡野生型(WT)、DMDmx 或WT心臟毒素損傷的小鼠(ctx-inj)接受兩個連續(xù)的雙向IM注射載體(10%DMS0/PBS) 或Shh-Ag (500 μ Μ)至脛骨前肌(TA)或腓腸肌(GA),隨后IP注射BrdU。將小鼠處死,然后 在Ctx-損傷后的3或7天收集肌肉用于免疫染色(TA)或FACS分析(GA);對于所有組n = 4。圖4證實了 Shh-Ag注射改善了心臟毒素-損傷后的再生。為了定量Shh-Ag活化 的衛(wèi)星細胞的增殖,將衛(wèi)星細胞從治療的肌肉(GA)中分離并且通過FACS分析檢測BrdU表 達。雖然衛(wèi)星細胞的總百分數(shù)用Shh-Ag治療后僅輕微增加,但是BrdU+衛(wèi)星細胞的百分數(shù)則幾乎翻倍(由4. 8增至10. 6% )。圖表示細胞占整個單細胞制劑的平均百分數(shù)士標準 差。*P < 0. 05。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)由Shh、patched (ptc), gli和/或smoothened調(diào)節(jié)的 信號轉(zhuǎn)導途徑可以被小分子調(diào)節(jié)、至少部分調(diào)節(jié)。雖然不希望結合任何特別理論,通過細 胞_表面聯(lián)合體(例如復合物)的改變來活化patched-smoothened途徑可以是一種機制, 這些藥物通過這種機制發(fā)揮作用。Hh途徑被認為是通過patched和smoothened的聯(lián)合體(例如蛋白質(zhì)復合物的形 式)來負調(diào)節(jié)的,這種聯(lián)合體被hedgehog與patched的結合所破壞。因此,這些藥物活化 hedgehog途徑的能力可以歸因于這些分子與patched或smoothened的相互作用或結合的 能力,從而破壞smoothened與patched的聯(lián)合,或者至少促進那些蛋白質(zhì)活化hedgehog、 Ptc和/或smoothened-介導的信號轉(zhuǎn)導途徑的能力。該作用模式(例如smoothened-依 賴性途徑的調(diào)節(jié))區(qū)別于通過直接活化cAMP途徑(例如通過與PKA、腺苷酸環(huán)化酶、cAMP 磷酸二酯酶等結合或相互作用)來調(diào)節(jié)hedgehog途徑的化合物。在某些實施方案中,本文公開的hedgehog激動劑在hedgehog蛋白自身不存在 的情況下調(diào)節(jié)hedgehog活性,例如化合物模擬hedgehog活性,而不是僅僅補充或增加 hedgehog蛋白的活性,例如通過促進hedgehog與patched結合。這些化合物在本文指的 是hedgehog-非依賴性激動劑并且單獨可以模擬表型或由hedgehog治療產(chǎn)生的效應。在 其它實施方案中,本發(fā)明化合物增強hedgehog蛋白的活性,并且需要hedgehog蛋白的存 在或添加,以觀察表型或由hedgehog誘導產(chǎn)生的效應。這類hedgehog-依賴性激動劑可 以在包含hedgehog蛋白的治療制劑或治療中應用,或者可以用于增加由用激動劑所治療 的細胞或組織天然產(chǎn)生的hedgehog蛋白的活性。本文公開的hedgehog激動劑可以誘導 patched-smoothened復合物的解離或者破壞patched禾口 smoothened之間的相互作用,例如 通過與patched或smoothened結合,從而活化hedgehog途徑。在某些實施方案中,本發(fā)明 的組合物和方法應用作用于一種或多種靶細胞的細胞外膜的組分的化合物。在某些實施方案中,在本發(fā)明中有用的hedgehog激動劑誘導hedgehog-依賴性轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié),例如glil或PtC基因的表達。因此這類激動劑可以誘導或增加由例如hedgehog 蛋白水平的增加引起的hedgehog-依賴性途徑活化。因此,特別值得考慮的是,這些調(diào)節(jié)hedgeh0g、ptc或smoothened信號轉(zhuǎn)導活性的 小分子同樣能夠促進具有功能Ptc-smo途徑的細胞的增殖(或其它生物學效果)。在優(yōu)選 的實施方案中,該激動劑是具有分子量小于2500amu、更優(yōu)選小于1500amu并且甚至更優(yōu)選 小于750amu的有機分子,并且能夠誘導或增加至少某些hedgehog蛋白的生物學活性,特別 優(yōu)選在靶細胞內(nèi)。由hedgehog激動劑活化的hedgehog途徑可以定量化,例如通過檢測與 不存在激動劑的對照組相比,在激動劑的存在下Ptc或gli-Ι轉(zhuǎn)錄的增加。例如增加至少 5%、至少10%、至少20%或甚至至少50%可以表示hedgehog途徑被試驗化合物活化。在某些實施方案中,用于本發(fā)明的化合物、例如上面描述的具有小于約ΙΟΟΟηΜ、小 于約ΙΟΟηΜ、小于約IOnM或甚至小于約InM的誘導或增加一種或多種Hh活性(例如上調(diào) Ptc或gli表達)的EC50。示例性人Gli基因的編碼序列包括例如GenBank登錄號X07384 的Gli-I基因序列和GenBank登錄號AB007298的Gli_2基因序列。Gli或ptc表達水平可以例如通過測量mRNA水平(轉(zhuǎn)錄)或蛋白質(zhì)水平(翻譯)來測定。另一方面,本發(fā)明提供了藥物制劑,該藥物制劑包含以足量配制的作為活性成分 的hedgehog激動劑、ptc拮抗劑或smoothened激動劑。例如本文描述的,以促進體內(nèi)增殖 或其它生物學效果。本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物,包括式(I)化合物 其中,由于化合價和穩(wěn)定性允許,Ar和Ar,獨立地表示取代的或未取代的芳基或雜芳基環(huán);Y在每次出現(xiàn)時獨立地是不存在或表示-N(R)-、-0-、-S-或-Se-;X 選自-C ( = 0) -、-C ( = S) -、-S (O2) _、-S (0) _、-C ( = NCN) -、-P ( = 0) (OR)-、以 及任選被1-2個基團例如低級烷基、鏈烯基或炔基取代的亞甲基;M在每次出現(xiàn)時獨立地表示取代的或未取代的亞甲基,例如-CH2-、-CHF-、-CH0H-、 -CH(Me)-、-C( = 0)_等,或者兩個M—起表示取代的或未取代的乙烯或乙炔,其中Mj中某些 或所有出現(xiàn)的M形成環(huán)狀結構的全部或部分;R在每次出現(xiàn)時獨立地表示H或者取代的或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷 基、雜芳烷基、炔基、鏈烯基或烷基,或者兩個R —起可以例如與N形成4-至8-元環(huán);Cy'表示取代的或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基,包括多環(huán)基團;j在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至10、優(yōu)選2至7 ;并且i在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至5、優(yōu)選0至2。在某些實施方案中,M在每次出現(xiàn)時獨立地表示取代的或未取代的亞甲基,例如-C H2-、-CHF-、-CHOH-、-CH (Me) -、-C ( = 0)-等。在某些實施方案中,Ar和Ar’表示苯基環(huán),例如未取代的或者被一個或多個包含 雜原子例如0、N和S的基團取代。在某些實施方案中,Ar和Ar,中至少一個表示苯基環(huán)。 在某些實施方案中,Ar和Ar,中至少一個表示雜芳基環(huán),例如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶 基等。在某些實施方案中,Y和Ar’與Ar以間位和/或1,3_關系連接。在某些實施方案中,Y在所有位置都不存在。在其中Y存在于一個位置的實施方 案中,i優(yōu)選表示整數(shù)1-2,在相鄰的Mi中,如果i = 0將導致兩個出現(xiàn)的Y直接連接,或者
8一個出現(xiàn)的Y直接與N或NR2連接。在某些實施方案中,Cy’是取代的或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中, Cy’直接與X連接。在某些實施方案中,Cy’是取代的或未取代的二環(huán)或雜芳基環(huán),優(yōu)選 都是二環(huán)和雜芳基,例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中, Cy’是至少被取代的或未取代的芳基或雜芳基環(huán)取代的單環(huán)芳基或雜芳基環(huán),即形成二芳 基系。在某些實施方案中,Cy’包括兩個取代的或未取代的芳基或雜芳基環(huán),例如相同的或 不同的,直接通過一個或多個鍵相連,例如形成二芳基或二環(huán)系。在某些實施方案中,X選自-C ( = 0) _、-C ( = S)-和-S (O2) _。在某些實施方案中,R表示H或低級烷基,例如H或Me。在某些實施方案中,NR2表示伯胺或者分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基 取代的仲胺或叔胺,優(yōu)選伯胺或仲胺。在某些實施方案中,Ar或Ar’上的取代基選自鹵素、低級烷基、低級鏈烯基、芳 基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、?;被⑶杌?、硝基、羥基、疊氮基、磺?;嗧?(sulfoxide))、硫酸酯、磺酸酯、氨磺?;?、亞磺酰氨基、磷?;?、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p燒 基、"(CH2) p 鏈烯基、-(CH2) p 炔基、-(CH2) p 芳基、_ (CH2) p 芳烷基、-(CH2) P0H、- (CH2) p0-低級 烷基、-(CH2) p0-低級鏈烯基、-0 (CH2) nR、- (CH2) PSH、- (CH2) PS_ 低級烷基、-(CH2) PS_ 低級鏈烯 基、-S (CH2)nR, -(CH2)pN (R) 2、-(CH2)pNR-低級烷基、-(CH2)pNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR 以 及上述基團的保護形式,其中P和η在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至10、優(yōu)選0至5。如下面進一步描述的,本發(fā)明化合物可以如美國專利公布US20050070578和相關 同族專利中描述的那樣制備,將其所有內(nèi)容并入本文作為參考。在某些實施方案中,Shh-Ag是本發(fā)明化合物(例如式I化合物),如下 在本文描述中,術語“治療”包括預防性或防止性治療以及治愈性或疾病抑制性治 療,包括治療處于本發(fā)明障礙(例如肌骨骼障礙(例如肌營養(yǎng)不良))風險中的患者以及病 人。該術語進一步包括用于延遲疾病進程的治療?!耙种坪?或逆轉(zhuǎn)”例如肌骨骼障礙(例如肌營養(yǎng)不良),申請人表示消除所述的肌 骨骼障礙(例如肌營養(yǎng)不良),或者與治療前或沒有治療相比,使所述病癥嚴重程度降低。本文所用的“治愈”表示通過治療引起患者的肌骨骼障礙(例如肌營養(yǎng)不良)減 輕或其行為發(fā)作的減輕。術語“預防”或“防止”表示阻止肌骨骼障礙(例如肌營養(yǎng)不良)的發(fā)作或復發(fā)。
“治療”表示治療、防止和預防,并且特別表示給患者施用藥物或進行醫(yī)學處理,用 于預防(防止)或治愈或減輕疾病或病或病癥或甚至在患病的患者情況中的事件的發(fā)作程 度或可能性?!霸\斷”表示診斷、預后、監(jiān)測、表征、選擇患者(包括臨床試驗中的參與者),并且 鑒定處于或患有特別障礙或臨床事件或那些最可能對特別治療響應的患者,或評估或監(jiān)測 患者對特別治療的響應。“個體”或“患者”表示需要治療病癥、障礙或疾病的哺乳動物、優(yōu)選人。本文所用的“本發(fā)明化合物”包括但不限于式I化合物。本發(fā)明化合物包括本文 所列的特別列出的化合物,包括在本發(fā)明的實施例中所列的那些。本文所用的“延遲進程”表示在肌骨骼障礙(例如肌營養(yǎng)不良)的前期或早期給 患者施用本發(fā)明化合物(例如式I化合物)防止疾病進一步發(fā)展,或與沒有施用活性化合 物的疾病發(fā)展相比,延緩了疾病的發(fā)展。本文所用的“有機小分子”是分子量小于3千道爾頓并且優(yōu)選小于1. 5千道爾頓 的有機化合物(或與無機化合物(例如金屬)絡合的有機化合物)。本文所用的“報告”基因可以與術語“標志基因”互換應用,并且它是一種核酸,其 易于檢測和/或編碼易于檢測的基因產(chǎn)物,例如熒光素酶。轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)節(jié)序列,例如啟動子、增強子、終止子等,其提供了 宿主細胞中編碼基因的表達。在真核細胞中,多聚腺苷酸化信號是控制序列。“啟動子序列”是能夠結合細胞內(nèi)RNA聚合酶并且啟動下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn) 錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。對于定義本發(fā)明的目的,啟動子序列的3’端與轉(zhuǎn)錄起始位點相連,并且 向上游(5’方向)延伸,包括啟動高于背景可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)量的堿基或元 件。發(fā)現(xiàn)啟動子序列中具有轉(zhuǎn)錄起始位點(方便地例如通過核酸酶Sl作圖來定義)以及 用于RNA聚合酶結合的蛋白結合域(共有序列)。編碼序列在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列“控制之下”,當RNA聚合酶將編碼序列 轉(zhuǎn)錄成mRNA時,然后mRNA被trans-RNA剪接并且翻譯成編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。短語“可藥用”表示分子實體和組合物,當施用于人時,其是生理學可耐受的并且 通常不產(chǎn)生過敏或類似的不良反應,例如惡心、頭暈等。優(yōu)選的是,本文所用的術語“可藥 用”表示經(jīng)聯(lián)邦管理機構或州政府批準的或美國藥典或其它廣泛公認的藥典列出的,用于 動物并且更特別是用于人。術語“載體”表示稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體,化合物與其一起施用。這類藥用 載體可以是無菌液體,例如水和油,包括石油、動物、植物或合成來源的,例如花生油、大豆 油、礦物油、芝麻油等。水或水溶液、鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液優(yōu)選用作載體,特別 是用于可注射溶液劑。適合的藥用載體在E.W.Martin的“Remington,s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物學)”中有描述。本文所用的短語“治療有效量”表示足以減少至少約15%、優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選 至少90%并且最優(yōu)選阻止宿主的活性、功能和響應中的臨床上顯著的缺陷的量??蛇x擇的 是,治療有效量足以引起宿主中臨床顯著病癥/癥狀的改善?!霸噭北硎究梢杂糜谥苽渌幬锖驮\斷組合物的所有物質(zhì),或者其可以是化合物、 核酸、多肽、片段、同種型、變體,或者可以獨立用于這些目的的其它物質(zhì),所有這些符合本發(fā)明。本文所用的“類似物”表示有機小分子化合物、核苷酸、蛋白質(zhì)或多肽,其與具有 本發(fā)明所需的活性和療效的化合物、核苷酸、蛋白質(zhì)或多肽具有類似或相同的活性或功能 (例如抑制腫瘤生長),但無需包含與優(yōu)選實施方案的序列或結構類似或相同的序列或結 構?!把苌铩北硎净衔?、蛋白質(zhì)或多肽,其包含由氨基酸殘基置換、缺失或增加的引 入而改變的母體蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列,或者由核苷酸置換或缺失、增加或突變的引 入而修飾的核酸或核苷酸。衍生的核酸、核苷酸、蛋白質(zhì)或多肽與母體多肽具有類似或相同 的功能?!凹觿焙汀澳M劑”可以是增加、便于、促進或引起通過途徑的信號傳導(例如 Hh信號傳導)和/或防止蛋白質(zhì)相互作用和絡合物形成的藥物。本文所用的“肌骨骼障礙”包括骨疾病(例如代謝性骨疾病)、滑囊炎、軟骨疾病、 關節(jié)疾病、肌強直、神經(jīng)性肌強直、惡病質(zhì)和消瘦、局部缺血、波倫綜合征、肌營養(yǎng)不良(例 如迪謝納和貝克肌營養(yǎng)不良以及肢帶型肌營養(yǎng)不良)、肌骨骼畸形、肌病(例如先天性肌 病、炎性肌病、中央核性肌病、肌管性肌病和代謝性肌病(例如糖原沉積病、脂肪沉積障 礙))、骨關節(jié)炎、骨軟骨炎、成骨不全、骨髓炎、骨壞死、骨硬化、骨質(zhì)疏松癥和脊柱側(cè)凸。本 文所用的“肌骨骼障礙”還包括肌肉或骨骼損傷以及與遺傳病和/或老化相關的肌肉或骨 骼障礙。術語“烷基”表示具有1至20個碳原子的直鏈或支鏈烴基,優(yōu)選1至7個碳原子的 低級烷基。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、 異己基、庚基、4,4_ 二甲基戊基、辛基等。優(yōu)選C1-C4-烷基。如果沒有另外定義,分別與有機基團或化合物相連的術語“低級”在本文中通常定 義為具有至多并且包括7個、優(yōu)選至多并且包括4個并且有利地是一個或兩個碳原子。其 可以是直鏈或支鏈的。術語“任選取代的烷基”表示具有1至20個碳原子的未取代或取代的直鏈或支鏈 烴基,優(yōu)選1至7個碳原子的低級烷基。示例性未取代的烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、 正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4,4_ 二甲基戊基、辛基等。術語“取代的烷基”表示被一個或多個下列基團取代的烷基鹵素(例如F、Cl、Br 和I)、羥基、烷氧基、烷氧基烷氧基、芳基氧基、環(huán)烷基、烷?;?、烷酰基氧基、氨基、取代的氨 基、烷?;被?、巰基、烷基硫代、芳基硫代、烷基硫羰、烷基磺酰基、芳基磺酰基、雜芳基磺 酰基、氨基磺?;⑾趸⑶杌Ⅳ然?、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳基、芳烷氧基、胍基、雜環(huán) 基(例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基、嘧啶基)等。術語“低級烷基”表示如上述具有1至7個、優(yōu)選1至4個碳原子的那些烷基。術 語“鹵素”或“鹵代”表示氟、氯、溴和碘。術語“烷氧基”或“烷基氧基”表示烷基-0-。術語“芳基”或“芳”表示在環(huán)部分含有6至12個碳原子的碳環(huán)單環(huán)或二環(huán)芳烴, 例如苯基、萘基、四氫萘基和聯(lián)苯基,每一個可以任選被1至4個(例如1個或2個)取代 基取代,所述的取代基例如烷基、商素、三氟甲基、羥基、烷氧基、烷酰基、烷?;趸?、氨基、 取代的氨基、烷?;被?、巰基、烷基硫代、硝基、氰基、羧基、羧基烷基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、烷基硫羰、烷基磺?;被酋;取Pg語“芳烷基”表示與烷基相連的芳基,例如芐基。術語“鹵素”或“鹵代”表示氟、氯、溴和碘。術語“鹵代烷基”表示被鹵素單或多取代的烷基,例如三氟甲氧基。術語“亞烷基”表示通過單鍵連接的1至6個碳原子的直鏈橋(例如_(CH2)X-,其 中X是1至6),其可以被1至3個低級烷基取代。術語“被0、S、N-(H、烷基或芳烷基)間斷的亞烷基”表示被0、S、N-(H、烷基或芳 烷基)間斷的2至6個碳原子的直鏈,例如(亞甲基或亞乙基)氧基(亞甲基或亞乙基)、 (亞甲基或亞乙基)硫代(亞甲基或亞乙基)或者(亞甲基或亞乙基)亞氨基(亞甲基或 亞乙基)。術語“環(huán)烷基”表示3至8個碳原子的環(huán)烴基,例如環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基。術語“烷?;趸北硎就榛?C (0) -0-。術語“烷基氨基”和“二烷基氨基”分別表示(烷基)NH-和(烷基)2N-。術語“烷?;被北硎就榛?C (0) -NH-。術語“烷基硫代”表示烷基-S-。術語“烷基硫羰”表示烷基-S (0) _。術語“烷基磺酰基”表示烷基-S (0) 2_。術語“氨基甲?;北硎?C (0)-氨基或-C (0)-取代的氨基。術語“烷氧基羰基”表示烷基-O-C (0) _。術語“?;北硎就轷;?、芳酰基、雜芳?;?、芳基_烷?;?、雜芳基烷酰基等。術語“雜芳基”或“雜芳”表示芳族雜環(huán),例如單環(huán)或二環(huán)雜環(huán)芳基,例如吡咯基、吡 唑基、咪唑基、巧f唑基、噻唑基、異巧悉唑基、噻唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡 嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并,惡唑基、苯并噻吩基、喹啉基、異喹啉基、 苯并咪唑基、苯并呋喃基等,其任選被1至4個(例如1個或2個)取代基取代,所述的取代 基例如低級烷基、低級烷氧基或鹵素,所述的雜環(huán)的連接點位于雜環(huán)的碳原子上。優(yōu)選的雜 芳基殘基是1-甲基-2-吡咯基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-噻唑基、2-咪唑基、1-甲基-2-咪 唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基或2-喹啉基。術語“烷酰基”表示例如C2-C7-烷?;?,特別是C2-C5-烷?;?,例如乙?;⒈;?或新戊?;Pg語“芳烷氧基”表示與烷氧基相連的芳基。術語“芳基磺?;北硎痉蓟?SO2-。術語“芳?;北硎痉蓟?CO-。術語“羰基”是公認的表示包括可以用以下通式表示的基團
OO
I!Il
~~"-X-R11,或——X~u~'Rfll其中X是鍵或者表示氧或硫,并且R11表示氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-RS或可藥用 鹽,R’ π表示氫、烷基、鏈烯基或_ (CHH2)m-R8,其中m和R8如上面定義的。當X是氧并且R11或R’ π不是氫時,通式表示“酯”。當X是氧并且R11如上面定義的時,基團在本文表示羧 基,并且特別是當R11是氫時,通式表示“羧酸”。當X是氧并且R’n是氫時,通式表示“甲酸 酯”。通常,當上式的氧原子被硫代替時,通式表示“硫代羰基”。當X是硫并且R11或R’ n 不是氫時,通式表示“硫代酯”。當X是硫并且R11是氫時,通式表示“硫代羧酸”。當X是硫 并且R11'是氫時,通式表示“硫代甲酸酯”。另一方面,當X是鍵并且R11不是氫時,上式表 示“酮”基團。當X是鍵并且R11是氫時,上式表示“醛”基團。術語“雜環(huán)基”表示任選取代的、完全飽和的或不飽和的、芳族或非芳族環(huán)基,例如 其是4至7元單環(huán)、7至11元二環(huán)或者10至15元三環(huán)系,其在至少一個含碳原子的環(huán)上具 有至少一個雜原子。包含雜原子的雜環(huán)基團的每個環(huán)可以具有1、2或3個選自氮原子、氧 原子和硫原子的雜原子,其中氮和硫雜原子還可以任選被氧化,并且氮雜原子還可以任選 被季銨化。雜環(huán)基可以在任何雜原子和碳原子上連接。術語“雜環(huán)基”表示3-至10-元環(huán)結構、更優(yōu)選3-至7-元環(huán),其中環(huán)結構包含1 至4個雜原子。雜環(huán)還可以是多環(huán)。雜環(huán)基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色 烯、咕噸、吩5惡噻、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異巧悉唑、吡啶、批嗪、嘧啶、噠嗪、中氮茚、異吲 哚、噴哚、噴唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、1,5- 二氮雜萘、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、 咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩P惡嗪、吡咯烷、四氫呋 喃(oxolane)、四氫噻吩(thiolane)、p惡唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺例如氮雜環(huán)丁酮 和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺內(nèi)酯等。雜環(huán)可以在一個或多個位置被上述取代基取代,所述的 取代基例如商素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰氨 基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷基硫代、磺?;?、酮、醛、酯、雜環(huán) 基、芳族或雜芳族基團、_CF3、-CN等。示例性的二環(huán)雜環(huán)基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并巧悉唑基、苯并噻吩基、奎寧環(huán) 基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、中氮茚基、苯并呋喃基、色 酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、噴唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(例 如呋喃并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶基]或呋喃并[2,3-b]吡啶基)、二氫異吲 哚基、二氫喹唑啉基(例如3,4- 二氫-4-氧代-喹唑啉基)等。示例性三環(huán)雜環(huán)基包括咔唑基、苯并吲哚基(benzidolyl)、菲咯啉基、吖啶基、菲 啶基、咕噸基等。術語“雜環(huán)基”還包括取代的雜環(huán)基。取代的雜環(huán)基表示被1、2或3個下列基團 取代的雜環(huán)基(a)烷基;(b)羥基(或保護的羥基);(C)鹵素;(d)氧代(即=0);(e)氨基或取代的氨基;(f)烷氧基;(g)環(huán)烷基;(h)羧基;(i)雜環(huán)基氧基;
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(j)烷氧基羰基,例如未取代的低級烷氧基羰基;(k)氨基甲酰基、烷基氨基甲?;⒎蓟被柞;?、二烷基氨基甲?;?;(1)巰基;(m)硝基;(η)氰基;(ο)亞磺酰氨基、亞磺酰氨基烷基或亞磺酰氨基二烷基;(ρ)芳基;(q)烷基羰基氧基;(r)芳基羰基氧基;(s)芳基硫代;(t)芳基氧基;(U)烷基硫代;(V)甲?;?W)芳基烷基;或(χ)被烷基、環(huán)烷基、烷氧基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或鹵素取代的芳基。術語“雜環(huán)基氧基”表示通過氧橋連接的雜環(huán)基。術語“雜芳基”或“雜芳”表示芳族雜環(huán),例如單環(huán)或二環(huán)芳基,例如吡咯基、吡唑 基、咪唑基、1P惡唑基、異巧悉唑基、噻唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪 基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并巧憑唑基、苯并噻吩基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并呋 喃基等,其任選被例如低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代。術語“雜芳基磺酰基”表示雜芳基-SO2-。術語“雜芳?;北硎倦s芳基-CO-。術語“?;被笔枪J的并且表示可以用以下通式表示的基團 其中R9表示氫、烷基、鏈烯基、_ (CH2)m-R8,或R9與它連接的N原子一起形成環(huán)結構 中具有4至8個原子的雜環(huán);R8表示芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)或多環(huán);并且m是零或范圍 為1至8的整數(shù)。R’ n表示氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R8。術語“取代的氨基”表示被烷基、芳烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜芳 烷基單_或獨立地二取代的氨基,或者被低級亞烷基二取代的氨基,或者被被0、S、N- (H、烷 基、芳烷基)等間斷的低級亞烷基二取代的氨基。本發(fā)明的任何酸性化合物的可藥用鹽是與堿形成的鹽,即陽離子鹽,例如堿金屬 和堿土金屬鹽,例如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂以及銨鹽,例如銨、三甲基銨、二乙基銨和三_(羥基甲 基)_甲基銨鹽。類似地,如果堿性基團(例如氨基或吡啶基)組成結構的部分,那么酸加成鹽(例如無機酸、有機羧酸和有機磺酸(例如鹽酸、甲磺酸、馬來酸)的鹽)是可能的。如果堿性基團(例如吡啶基)組成結構的部分,那么本發(fā)明化合物的可藥用鹽特 別是酸加成鹽,例如無機酸、有機羧酸和有機磺酸(例如鹽酸、甲磺酸、馬來酸等)的鹽。取決于取代基的性質(zhì),本發(fā)明化合物具有一個或多個不對稱碳原子,并且因此作 為外消旋體(racernates)和其(R)和⑶對映異構體存在。所有這些都在本發(fā)明范圍內(nèi)。 優(yōu)選的是更具活性的對映異構體,其典型地指定為S-構型(在碳上是NR6R7取代基)。本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)例如通過本發(fā)明化合物(例如式I化合物)激動Hedgehog 途徑可以導致初級成肌細胞和衛(wèi)星細胞(SC)增殖的增加。本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)例如通 過本發(fā)明化合物(例如式I化合物)激動Hedgehog途徑(例如PI3K/Akt途徑)的途徑上 游可以導致初級成肌細胞和衛(wèi)星細胞(SC)增殖的增加。本發(fā)明通常涉及應用激動Sonic Hedgehog (shh)并且從而激動Hedgehog信號傳 導途徑的藥物診斷和治療與Hedgehog途徑相關的肌骨骼障礙,包括但不限于肌營養(yǎng)不良 (例如迪謝納肌營養(yǎng)不良)。所述的激動劑包括例如本發(fā)明化合物(例如式I化合物)。本 發(fā)明的方法和化合物涉及激動Hedgehog信號傳導途徑,例如通過活化Smo受體非依賴性 Shh配體;并且包括將細胞與足量的本發(fā)明化合物(例如式I化合物)接觸,以激動正常的 Shh活性,拮抗正常的Ptc活性或激動smoothened活性(例如逆轉(zhuǎn)或控制異常生長狀態(tài))。本發(fā)明的一個方面制定可利用的方法,該方法應用化合物用于激動Hedgehog(配 體)_非依賴性途徑活化。在某些實施方案中,本方法可以用于抵抗Hedgehog途徑的不需 要的抑制的表型效應,例如由Hedgehog喪失功能、Ptc獲得功能或smoothened喪失功能突 變引起的。例如,本方法可以包括將細胞(體外或體內(nèi))與足量的Shh激動劑、例如本發(fā)明 化合物(例如式I化合物(例如Shh-Ag))或其它小分子接觸,以激動Hedgehog-非依賴性 活化途徑。本發(fā)明化合物(下面進一步描述)包括Hedgehog(例如Sonic Hedgehog)合成、 表達、產(chǎn)生、穩(wěn)定、磷酸化、細胞內(nèi)再定位和/或活性的小分子激動劑。本發(fā)明化合物包括但 不限于式I化合物。本發(fā)明提供了測定已知上調(diào)sonic hedgehog途徑的藥物是否增加初級成肌細胞 增殖(例如以PI3K/Akt-依賴方式)的方法,該方法包括⑴將藥物施用于非人類個體;和 ( )測定個體產(chǎn)生的初級成肌細胞增殖是否大于未施用藥物的個體,從而測定藥物是否增 加初級成肌細胞增殖。本發(fā)明提供了測定已知上調(diào)sonic hedgehog途徑的藥物是否促進衛(wèi)星細胞(SC) 增殖的方法,該方法包括⑴將藥物施用于非人類個體;和( )測定個體產(chǎn)生的衛(wèi)星細胞 (SC)增殖是否大于未施用藥物的個體,從而測定藥物是否促進衛(wèi)星細胞(SC)增殖。測定已知上調(diào)sonic hedgehog途徑的藥物是否可以增加初級成肌細胞或衛(wèi)星細 胞增殖的方法可以包括測量Glil mRNA水平,因為Glil是Hedgehog下游轉(zhuǎn)錄因子,并且 因此是Hedgehog途徑活性的報道基因(Gli-I基因序列具有GenBank登錄號X07384,并且 Gli-2基因序列具有GenBank登錄號AB007298)。所述的測定方法可以包括Cyclin Dl (確 定的細胞周期調(diào)節(jié)劑)和Gli轉(zhuǎn)錄靶點。所述的測定方法還可以包括Pax7(轉(zhuǎn)錄因子)和 肌衛(wèi)星細胞(SC)的標志物(Seale, P.等人(2000)Cell 102,777-86) 任何上述方法(例如篩選方法)可以在體外或體內(nèi)進行。例如,所述的方法可以在培養(yǎng)的分離細胞、例如TM3細胞(已經(jīng)很好建立的Shh-敏感細胞系)以及在任何數(shù)量的 肌或肌前體細胞中進行。所述的肌或肌前體細胞可以包括初級成肌細胞(PM)、C2C12成肌 細胞和分離的衛(wèi)星細胞(SC)。進一步例如,所述的方法可以在肌病的動物模型中進行,包括 但不限于DMDtffix小鼠,,其是肌營養(yǎng)不良模型。根據(jù)本文描述的方法,肌細胞和組織可以從 所述的動物模型中獲得。本發(fā)明進一步提供了治療肌骨骼障礙的方法,該方法通過給患者施用治療有效量 的已知激動或另外上調(diào)sonic hedgehog途徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌 細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力的藥物,其中該能力是通過下面方法來測定的, 該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的細胞增殖是否大于未施 用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了抑制肌骨骼障礙發(fā)作的方法,該方法通過給需要的個體施用 預防有效量的已知激動或另外上調(diào)sonic hedgehog途徑并且測定具有增加細胞增殖(例 如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力的藥物,其中該能力是通過下面方法 來測定的,該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的細胞增殖的 增加是否大于未施用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了組合物,該組合物包含(a)可藥用載體,和(b)已知上調(diào) sonic hedgehog途徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC) 的增殖)的能力的藥物,其中該能力是通過下面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用 于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC) 的增殖)的增加是否大于未施用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了制備品,該制備品包括其中具有已知上調(diào)sonic hedgehog途 徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力 的藥物的包裝材料,和表示藥物在抑制個體肌骨骼障礙發(fā)作中的用途的標簽,其中這種能 力是通過下面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體 產(chǎn)生的細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施 用藥物的個體。本發(fā)明進一步提供了制備品,該制備品包括其中具有已知上調(diào)sonic hedgehog途 徑并且測定具有增加細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的能力 的藥物的包裝材料,和表示藥物在治療個體肌骨骼障礙中的用途的標簽,其中這種能力是 通過下面方法來測定的,該方法包括(i)將藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生 的細胞增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用藥 物的個體。本發(fā)明的方法可以用于體外和/或體內(nèi)例如在形成新的或再生的肌肉組織中調(diào) 節(jié)細胞的增殖(例如初級成肌細胞和/或衛(wèi)星細胞(SC)的增殖)。在另一個特別的實施方 案中,將細胞與本發(fā)明化合物(例如式I化合物)接觸或者將本發(fā)明化合物(例如式I化 合物)引入細胞中導致促進細胞增殖和肌骨骼損傷或障礙的恢復。因此,另一個特別的實 施方案提供了通過在損傷的或患病的肌細胞中應用本發(fā)明化合物(例如式I化合物)用于 激動Hh途徑的方法。HedRehoR 途徑
Hedgehog(Hh)信號傳導首先是在果蠅中被鑒定出來的,作為胚胎圖式形成的一 個重要的調(diào)節(jié)機制,或者作為一個過程,通過該過程胚胎細胞形成有序的分化組織的空間 排布(Nusslein-Volhard 等人(1980)Nature 287,795-801)。在脊椎動物發(fā)育過程中, Hedgehog信號傳導分子家族成員介導許多重要的短-和長-期圖式形成過程。圖式形成是 活性,通過該活性,胚胎細胞形成有序的分化組織的空間排布。通過細胞內(nèi)源譜系和細胞外 部信號傳導的相互作用,更高有機體的機體復雜性在胚胎發(fā)生過程中出現(xiàn)。從機體計劃的 早期確立到器官系統(tǒng)的圖式形成,再到組織分化過程中不同細胞類型的產(chǎn)生,誘導的相互 作用對于脊椎動物發(fā)育的胚胎圖式形成是必需的。脊椎動物的Hedgehog基因家族包括三個成員,其存在于哺乳動物中,稱為 Desert (Dhh)、Sonic(Shh)和Indian(Ihh) Hedgehog,所有這些基因編碼分泌性蛋白質(zhì)。這 些不同Hedgehog蛋白質(zhì)包括信號肽、高度保守的N-端結構域和差異較大的C-端結構域。 生物化學研究已經(jīng)表明Hh前體蛋白的自我蛋白酶解是通過內(nèi)部硫酯中間體進行的,隨后 其在親核取代中被裂解。可能是親核基團是小的親脂分子,其與N-肽的C-末端共價結合, 再將其連到細胞表面。生物學內(nèi)涵是深奧的。連接的結果是,在產(chǎn)Hedgehog的細胞表面產(chǎn) 生高局部濃度的N-端Hedgehog肽。該N-端肽對于短-和長-期Hedgehog信號傳導活性 都是必需的和足夠的。Hh信號傳導轉(zhuǎn)錄的下游靶基因包括Wnts、TGFii以及Ptc和Glil,這些基因是正 和負調(diào)節(jié)反饋回路的基礎。數(shù)個細胞周期和增殖調(diào)節(jié)基因(例如C-myC、CyClin D和Ε)也 在Hh信號傳導的靶基因中。Hedgehog基因編碼分泌性蛋白質(zhì),其經(jīng)歷翻譯后修飾,包括N-端的自催化剪切和 脂質(zhì)修飾(棕櫚?;?以及C-端的膽固醇修飾。脂質(zhì)修飾的N-端Hedgehog蛋白觸發(fā)蛋 白質(zhì)途徑的信號傳導活性,通過信號傳導細胞中可溶性Hedgehog蛋白的發(fā)送以及應答細 胞的接收產(chǎn)生細胞與細胞通信。在應答細胞中,12-通道跨膜受體Patched (Ptch)用作Hh 信號傳導的負調(diào)節(jié)物,并且7-通道跨膜蛋白Smoothened(Smo)用作Hh信號傳導的正調(diào)節(jié) 物。在靜止狀態(tài)下,游離的Ptch (即未被Hh結合的)以亞化學計量抑制Smo誘導的途徑活 性(Taipale等人(2002)Nature 418 892);但是,當結合配體Hh蛋白后,Smo的抑制被解 除,并且產(chǎn)生的信號級聯(lián)放大導致Gli轉(zhuǎn)錄因子(Glil、Gli2和Gli3)的活化和核移位。當跨膜蛋白受體Patched(Ptc)抑制Smoothened(Smo)的穩(wěn)定、磷酸化和活性時, 出現(xiàn)無活性的Hedgehog信號傳導途徑。轉(zhuǎn)錄因子Gli (Hh信號傳導的下游組分)被阻止 與細胞質(zhì)蛋白(包括融合的(Fu)和融合的抑制劑(Sufu))相互作用進入核內(nèi)。結果是, Hedgehog靶基因的轉(zhuǎn)錄活化被抑制。通過三種哺乳動物配體(Dhh、Shh或Ihh)中任何一 個與Ptc結合來引起途徑的活化。通過Hh結合的配體改變了 Smo和Ptc的相互作用,逆轉(zhuǎn)了 Smo的抑制,從而Smo從 細胞內(nèi)的內(nèi)部結構移至質(zhì)膜。Smo定位至質(zhì)膜以Hh-非依賴方式觸發(fā)Hh途徑靶基因的活化 (Zhu等人(2003)Genes Dev. 17(10) :1240)。Smo活化的級聯(lián)導致轉(zhuǎn)錄因子Gli的活化形 式易位至核內(nèi)。通過易位的核Gli引起Smo的活化激活了 Hh途徑靶基因表達,包括Wnts、 TGFβ以及Ptc和Gli自身。該過程還可以以天然的配體_非依賴方式發(fā)生,例如通過施用Shh激動化合物、重 組Shh蛋白或其它Shh模擬物。
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已知Hh信號傳導以組織特異性和劑量依賴方式調(diào)節(jié)多種生物學過程,例如細胞 增殖、分化和器官形式。在神經(jīng)管的發(fā)育中,Shh在底板中表達并且支配特別亞型的神經(jīng)元 (包括運動神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元)的分化。Hh調(diào)節(jié)神經(jīng)元祖細胞(例如小腦顆粒細胞 和神經(jīng)干細胞)的增殖。Hh信號還在正常組織穩(wěn)態(tài)和再生中發(fā)揮重要作用。在小鼠模型中,損傷后Hh途 徑在例如視網(wǎng)膜、膽管、肺、骨和前列腺組織中被活化。Hh途徑在毛囊、骨髓和中樞神經(jīng)系 統(tǒng)(CNS)的某些區(qū)域內(nèi)不斷活化,并且良性前列腺增生和濕黃斑變性中的血管形成需要 Hedgehog途徑活性。骨骼肌含有殘留的干細胞,最具特征的是肌衛(wèi)星細胞(SC),其提供一種方式用 于骨骼肌組織的固有再生。但是,在損傷、遺傳病或老化的情況中,這種再生能力被降低。 Sonic hedgehog(Shh)信號傳導對于胚胎肌肉發(fā)育過程中前體細胞的擴展是至關重要的, 并且成年肌損傷后能夠再次活化。施用和藥物組合物本發(fā)明涉及包含式I化合物的藥物組合物在治療性(和,在本發(fā)明更廣的方面,預 防性)治療肌骨骼障礙中的用途。通常,本發(fā)明化合物將以治療有效量通過本領域已知的任何有用并且可接受的 方式單獨或者與一種或多種治療劑組合施用。治療有效量很大程度上取決于疾病的嚴重 程度、個體的年齡和相對健康、所用的化合物功效和其它因素而不同。通常,以日劑量從約 0.03至2. 5mg/kg體重表明全身獲得滿意的結果。在更大的哺乳動物(例如人)中,所示的 日劑量范圍從約0. 5mg至約lOOmg,方便地例如以每天至多四次的分劑量或以緩釋形式來 施用。對于口服施用,適合的單位劑型包含約1至50mg活性成分。本發(fā)明化合物可以作為藥物組合物通過任何常規(guī)途徑來施用,特別是腸內(nèi)施用, 例如口服,例如片劑或膠囊劑形式;或非腸道施用,例如可注射溶液劑或混懸劑形式;局部 施用,例如洗劑、凝膠劑、軟膏劑或乳膏劑形式,或鼻內(nèi)或栓劑形式。包含游離形式或可藥用 鹽形式的本發(fā)明化合物以及至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可以以常規(guī)方式 通過混合、制?;虬路椒▉碇苽?。例如,口服組合物可以是片劑或明膠膠囊劑,其包含活 性成分和a)稀釋劑,例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘氨酸;b)潤 滑劑,例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣鹽和/或聚乙二醇;對于片劑還包含C) 粘合劑,例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯 吡咯烷酮;如果需要d)崩解劑,例如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽,或泡騰混合物;和/或e) 吸收劑、著色劑、矯味劑和甜味劑。可注射組合物可以是等滲水溶液或混懸液,并且栓劑可 以由脂肪乳或混懸液來制備。該組合物可以是滅菌的和/或包含佐劑,例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化齊U、 溶解促進劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。另外,它們還可以包含其它在治療上有價值的 物質(zhì)。對于透皮應用,適合的制劑包含有效量的本發(fā)明化合物和載體。載體可以包括可吸 收的可藥用溶劑,以幫助通過宿主皮膚。例如,透皮裝置是繃帶形式,包括背襯膜、包含化合 物并任選載體的儲庫,任選速率控制屏障以歷經(jīng)延長的時間周期以可控和預設的速率將化 合物遞送至宿主皮膚,并且這意味著將裝置固定在皮膚上。還可以應用基質(zhì)透皮制劑。對 于局部應用,例如施用于皮膚和眼睛,適合的制劑優(yōu)選是本領域眾所周知的水溶液劑、軟膏劑、乳膏劑或凝膠劑。這些制劑可以包含增溶劑、穩(wěn)定劑、張力增強劑、緩沖劑和防腐劑。本發(fā)明化合物可以以治療有效量與一種或多種治療劑組合施用(藥物組合)。例 如,與免疫調(diào)節(jié)劑或抗炎性物質(zhì)或其它抗腫瘤治療劑一起可以出現(xiàn)協(xié)同作用。當本發(fā)明化 合物與其它治療組合施用時,共同施用的化合物的劑量當然將取決于所用的共同藥物的類 型、所用的特別藥物、所治療的病癥等而不同。本發(fā)明還提供了藥物組合,例如藥盒,其包含a)第一種藥物,其是游離形式或可 藥用鹽形式的本文公開的本發(fā)明化合物,和b)至少一種共同藥物。該藥盒可以包含施用說 明書。本文所用的術語“共同施用”或“組合施用”等表示包括給單個患者施用所選的治 療劑,并且表示包括治療方案,其中藥物無需通過相同的施用途徑或在相同的時間點施用。本文所用的術語“藥物組合”表示通過混合或組合多于一種活性成分形成的產(chǎn)品 并且包括活性成分的固定和非固定組合。術語“固定組合”表示活性成分、例如式I化合物 和共同藥物均是以單個實體或劑量的形式同時施用于患者。術語“非固定組合”表示活性 成分、例如式I化合物和共同藥物均是以分開的實體同時、共同或沒有特定時間限制地依 次施用于患者,其中這類施用在患者機體內(nèi)提供了 2種化合物的治療有效水平。后者還應 用于聯(lián)合療法,例如施用3種或更多種活性成分。制備本發(fā)明化合物的方法本發(fā)明化合物可以制備成可藥用酸加成鹽,通過將化合物的游離堿形式與可藥用 無機或有機酸反應??蛇x擇的是,本發(fā)明化合物的可藥用堿加成鹽可以通過將化合物的游 離酸形式與可藥用無機或有機堿反應來制備??蛇x擇的是,本發(fā)明化合物的鹽形式可以應用原料或中間體的鹽來制備。本發(fā)明化合物的游離酸或游離堿形式可以分別從相應的堿加成鹽或酸加成鹽形 式來制備。例如可以將酸加成鹽形式的本發(fā)明化合物通過用適合的堿(例如氫氧化銨溶 液、氫氧化鈉等)處理而轉(zhuǎn)化為相應的游離堿。堿加成鹽形式的本發(fā)明化合物可以通過用 適合的酸(例如鹽酸等)處理而轉(zhuǎn)化為相應的游離酸。本發(fā)明化合物的前藥衍生物可以通過本領域普通技術人員已知的方法來制 備(例如,進一步的詳細描述參見Saulnier等人,(1994),Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,第 4 卷,第 1985 頁)。本發(fā)明化合物的保護的衍生物可以通過本領域普通技術人員已知的方法來制 備。可應用于保護基的產(chǎn)生和去除的技術的詳細描述可以參見T.W.Greene,“Protecting Groups in Organic Chemistry (有機化學中的保護基),,,第 3 版,John Wiley and Sons, Inc. ,1999。本發(fā)明化合物可以方便地制備成或在本發(fā)明的方法中形式溶劑化物(例如水合 物)。本發(fā)明化合物的水合物可以應用有機溶劑(例如二氧芑、四氫呋喃或甲醇)從水/有 機溶劑混合物中通過重結晶來方便地制備。本發(fā)明化合物可以制備成它們各自的立體異構體,通過將化合物的外消旋混合物 與旋光活性拆分劑反應,以形成非對映異構體化合物對,分離非對映異構體并且回收旋光 純對映異構體。對映異構體的拆分可以應用本發(fā)明化合物的共價非對映異構體衍生物來進 行,優(yōu)選可分離的復合物(例如結晶非對映異構體鹽)。非對映異構體具有不同的物理性質(zhì)(例如熔點、沸點、溶解度、反應性等),并且可以容易地利用這些不同性來分離。非對映 異構體可以通過色譜法、或優(yōu)選通過基于溶解度差異的分離/拆分技術來分離。然后通過 任何不會引起外消旋化的實用方法來回收旋光純的對映異構體和拆分劑??捎糜趶南?化合物中拆分化合物的立體異構體的技術的更詳細的描述可以參見Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. ffilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions (對映異構體、消方寵 體和拆分),” John Wiley And Sons, Inc.,1981。
實施例本發(fā)明通過下列代表性的實施例進一步舉例說明,而非限制,實施例用于說明本 發(fā)明,而不能理解為限制。除非另外說明,所述的實施例應用下列物質(zhì)和方法MM =ΤΜ3和C2C12細胞從ATCC獲得,根據(jù)供應商的說明繁殖,并且維持在亞匯合 狀態(tài)。初級成肌細胞和分離的衛(wèi)星細胞在添加20%胎牛血清和青霉素/鏈霉素而不含 β FGF的Ham’ s FlO培養(yǎng)基中生長。將所有細胞鋪在預先包被膠原的平皿(MatTek)上或 鋪在用大鼠尾部膠原I型(BD)處理的塑料培養(yǎng)皿上。RNA和aRT-PCR:為了分析基因表汰,將細胞用介質(zhì)(DMSO)或IOnM Shh-Ag處理 24小時。根據(jù)供應商說明,將總RNA用RNEasy Miniprep試劑盒(Qiagen)分離、DNAse處 理(RQ1,Promega)并且反轉(zhuǎn)錄(iScript,Biorad)。定量PCR根據(jù)供應商說明應用Taqman 基因表達分析(Applied Biosystems)在ABI7500Fast系統(tǒng)中進行。基因表達變化應用比 較的Δ ACT方法來計算。蛋白質(zhì)表達對于詳細的蛋白質(zhì)提取和分析,請參見在線的補充方法。Western所 用的抗體是抗Glil、總Akt、磷酸化Akt-Ser473(細胞信號傳導)和Cyclin Dl (Abeam)的 兔多克隆抗體。成肌細胞和衛(wèi)星細胞的分離初級小鼠成肌細胞是如本文描述的那樣從小鼠后肢 肌肉中分離的。肌衛(wèi)星細胞是從4-6周齡C57BL/6J小鼠的后肢肌肉中分離的。將肌肉剖 分并且在DMEM中用保險刀片切碎。將切碎的肌肉置于含30mL分離溶液(0. 膠原酶D、 0.25%胰蛋白酶,在DMEM中)的50mL Falcon管中,并且在37°C下攪動20分鐘。分離后, 加入500 μ L胎牛血清以封閉胰蛋白酶活性,并且將樣品通過37 μ M濾器。將溶液在DMEM 中稀釋2倍,通過70 μ M濾器,以1000RPM下離心15分鐘,并且將隨后的沉淀物重新懸浮于 1% FCS/PBS中。然后將多配體聚糖4陽性衛(wèi)星細胞應用ARIA-UV細胞分選儀(BD)通過熒 光活化細胞分選系統(tǒng)(FACS)來分離。小鼠所有小鼠方案經(jīng)諾華牛物醫(yī)學研究所的動物管理和應用委員會批準。野生 型(C57BL/6J)和C57BL/10DMDmx小鼠從Jackson Labs獲得。所有分析在約6_8周齡的雄 性小鼠上進行。心臟毒素誘導的再生肌肉再生是通過將40 μ L(TA)或IOOyL(GA)的心臟毒素 (10 μ M Naja atra ;Sigma)注射到WT C57BL/6J小鼠各自的脛骨前肌或腓腸肌中來誘導的。Shh-Ag 處理將 20 μ L (TA)或 50 μ L (GA)的介質(zhì)(10 % DMS0/PBS)或 500 μ M Shh-Ag注射到各自的脛骨前肌或腓腸肌,每天一次,連續(xù)注射2天。BrdU處理為了處理分離的SC,在介質(zhì)或Shh-Ag處理24小時后,將1 100稀釋 的5-溴脫氧尿苷(BrdU)標記試劑(10mg/mL ;InVitr0gen)加入至培養(yǎng)基中。然后將細胞
20再溫育5小時,固定,探測BrdU,用含Dapi的介質(zhì)(Vector Labs)封固,然后如材料與方法 中描述的那樣成像。將四次重復試驗的三個隨機圖像用于分析總細胞(Dapi)和BrdU+細胞 數(shù)。對于體內(nèi)遞送,在第二次介質(zhì)或Shh-Ag肌內(nèi)注射后腹膜內(nèi)(IP)注射IOOyL的BrdU。FACS分析本研究中應用下列抗體APC-綴合的抗-⑶45 (BD)、PE-綴合的 抗-Syndecan 4(BD)和FITC-綴合的抗-BrdU(BioVision)。將處理的小鼠的肌肉如描述 的那樣剖分并且分離。為了分選衛(wèi)星細胞用于進一步試驗,在ARIA(BD)介導的細胞分選后 將APC-綴合的抗多配體聚糖4用于陽性篩選細胞。為了分析相關的BrdU表達,將分離的 細胞在1 %在PBS中的多聚甲醛中固定15分鐘,并且在-20°C下保存在70% ETOH中。然后 將細胞在吐溫20溶液(0.2%,在PBS中;Sigma)中透化處理10分鐘,洗滌并且與描述的抗 體溫育30分鐘,然后用LSRII (BD)進行FACS分析。免疫染餼法本研究中應用下列抗體抗-層粘連蛋白兔多克降抗體(1 25; Sigma)、抗-BrdU大鼠單克隆抗體(1 100 ;Abeam)和抗_Pax7小鼠單克隆抗體(1 25 ; DSHB,愛荷華大學)。將肌肉剖分并且在10%福爾馬林/PBS中固定過夜,進行石蠟包埋處 理,并且切成ΙΟμΜ切片。然后應用Discovery XT系統(tǒng)(Ventana)將肌肉切片封閉并且用 上述抗體染色。圖像是應用ScanScope XT掃描儀獲得的并且用Aperio ImageScope 6.25 軟件(Aperio Technologies)分析。為了免疫熒光染色,將上述抗體與抗小鼠、大鼠和/或山羊的綴合 的二抗(Alexa Fluor 488/555,1 400 ;Invitrogen) 一起應用。隨后將切片封固在含 DAPI (Vector Labs)的介質(zhì)中并且應用AxioImager顯微鏡(Zeiss)成像。統(tǒng)計學所有數(shù)倌都以平均倌士標準差(s.d.)表示。為了測定兩組(介質(zhì)與 Shh-Ag處理)間的顯著性,我們采用非配對student t_檢驗來進行比較,P < 0. 05認為有 統(tǒng)計學意義。蛋白質(zhì)表達將細胞收集在裂解緩沖液(20mM Tris,pH 7. 5、150mMNaCl、ImM EDTAUmM EGTAU % Nonidet NP_40、lmM β-甘油磷酸、ImM Na3V04、1 μ g/mL 亮抑酶肽和 ImM PMSF)中,并且用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce)測量蛋白質(zhì)濃度。電泳分離應用 20-60 μ g蛋白質(zhì)在4-12%小型膠(Invitrogen)上進行。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5% blotto [5%在TBST (Tris-緩沖鹽水,Tween 20)中的奶粉]封閉1小時,隨后與一抗在 4°C下溫育過夜。溫育過夜后,將膜在TBST中洗滌30分鐘,然后用抗兔抗體在室溫下探測 45分鐘。再次在TBST中洗滌30分鐘后,將斑點用ECL顯像。一旦獲得適合的圖像,將膜 用考馬斯藍染色,以證實所有泳道中相當?shù)妮d量。光密度測定應用AlphaEase軟件(Alpha Innotech)進行。成肌細胞分離將兩至三周齡的雄性C57/BL/6J pups用于本試驗。將小鼠用CO2 安樂死。然后將從踝關節(jié)至髖部的皮膚和筋膜去除,以暴露出下面的肌肉。將雙腿的肌肉 (胭旁腱、四頭肌、脛骨前肌、趾長伸肌、腓腸肌和比目魚肌)小心取下,設法去除任何腱和 非肌肉組織。將剖分的肌肉置于含PBS的無菌IOcm2平皿中,并且洗滌以除去毛發(fā)和其它 殘留物。然后將肌肉轉(zhuǎn)移至無菌35cm2平皿中,并且加入1. 5mL膠原酶/分散酶溶液,以消 化組織。應用無菌一次性器皿將組織埋入適當平滑的漿中,隨后在37°C下溫育12分鐘。然 后應用5mL塑料吸管將它們搗碎,以勻化混合物。將溫育和搗碎步驟再重復一次。將消化的組織混合物用5mL吸管進一步搗碎15至20次,然后裝入70 μ m濾器。將
21過濾的混合物以IOOOrpm離心5分鐘。將細胞沉淀物重新懸浮于3mL生長培養(yǎng)基中并且置 于60mm2非膠原包被的平皿上。將平皿在37°C下溫育2至4小時,使得成纖維細胞貼壁,而 大多數(shù)成肌細胞仍然在懸浮液中。然后將含有成肌細胞的上清液從非膠原包被的平皿中取 出,并且種在膠原包被的平皿中。將細胞每天用生長培養(yǎng)基飼養(yǎng),當單層細胞達到70%融合 時將其分離,以富集和擴大成肌細胞。3至4周富集后獲得相對純的成肌細胞群。實施例1 體外測定Shh-Ag對Shh信號傳導的作用為了測定Shh-Ag是否能夠活化肌細胞中的Shh信號傳導,已經(jīng)很好建立的 Shh-敏感細胞系TM3以及三種其它鼠肌細胞系初級成肌細胞(PM)、商購的C2C12成肌細 胞和分離的SC中的靶基因和下游功能基因(Glil)的表達是通過定量PCR分析測量的。根 據(jù)上面描述的方法和方案,將介質(zhì)(DMSO)和Shh-Ag處理(10 μ M)的細胞中的Glil基因表 達進行比較,通過實時taqman分析測量并且歸一化至GAPDH水平。如圖1所示,24小時的Shh-Ag處理(10 μ M)顯著地增加了所有細胞系檢查中的 Glil mRNA水平(即在ΤΜ3細胞中超過40倍,并且在成肌細胞和肌管中分別超過20倍)。 圖IA顯示在ΤΜ3細胞中為41. 79士3. 09 ;在PM細胞中為23. 09士3. 21 ;在C2C12細胞中為 7. 80士 1.24 ;以及在SC中為8. 14士2. 01 (分別是相對于歸一化至GAPDH后等于1的介質(zhì)的 倍數(shù)改變)。盡管基線Glil表達水平在分化的肌管中非常低(參見,例如圖1C),但是該數(shù) 據(jù)與其它細胞類型一致,其中Shh信號傳導隨著分化而降低,這意味著肌管保留對Shh活化 響應的能力。Shh-Ag處理對商購可獲得的C2C12細胞系也具有類似的作用。在建立Shh-Ag處理可以誘導Shh信號傳導后,Shh-Ag對細胞增殖的作用通過熒 光活化細胞分選(FACS)分析來檢驗。Shh-Ag處理(IOnM)誘導初級成肌細胞24小時后, 碘化丙啶(PI)染色和FACS分析證實細胞周期G2/M期的細胞百分數(shù)增加(參見例如圖IB ; 34. 4 士 0. 48對39. 6 士 0. 61)。然后,在Shh-Ag處理48小時后,評價分離的衛(wèi)星細胞的促有 絲分裂活性,并且發(fā)現(xiàn)SC數(shù)量顯著增加,以及摻入增殖標志物BrdU的SC的百分數(shù)增加了 兩倍(參見例如圖IC ;分別為100士2. 8對121 士5. 8禾口 100士24. 7對214士 17. 8)。為了解釋所觀察到的Shh-Ag介導的對肌細胞增殖的作用的分子機理,檢驗了與 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號傳導途徑的可能的協(xié)同作用。經(jīng)PI3K/Akt的胰島素 樣生長因子I(IGF-I)信號傳導是已知的骨骼肌促細胞分裂原,并且rShh-介導對肌細胞 增殖的誘導已經(jīng)顯示出需要Akt活化(Elia,D.等人(2007)Biochim Biophys Acta 1773, 1438-46) (CooIican, S. Α.等人(1997) J Biol Chem 272,6653-62)。Shh-Ag與IGF-I共同處理沒有顯著增加成肌細胞增殖,但是用LY294002 (有效的 PI3K/Akt信號傳導途徑抑制劑)處理完全封閉了細胞增殖(參見例如圖2A)。LY294002處 理還封閉了 Shh-Ag和rShh-介導的Glil蛋白質(zhì)水平的誘導(參見例如圖2B),進一步支 持了 Akt在調(diào)節(jié)下游Shh活化中的作用。細胞周期蛋白Dl (確定的細胞周期調(diào)節(jié)劑和Gli 轉(zhuǎn)錄靶標)也在Shh-Ag處理后顯示出升高的蛋白質(zhì)表達(參見例如圖2A)。另外,觀察到 在成肌細胞和分離的SC中Shh-Ag處理后細胞周期蛋白Dl mRNA表達增加超過50%。這些 結果與Shh和其它生長信號傳導途徑(例如表皮生長因子)協(xié)同性共刺激細胞周期蛋白Dl 的觀察結果一致(Kasper,M.等人(2006)Mol Cell Biol 26,6283-98) 綜合來看,這些結 果證實了 Shh-Ag處理是取決于誘導下游標靶和促進肌前體細胞增殖的PI3K/Akt信號傳導 途徑。
實施例2 肌內(nèi)注射Shh-Ag誘導體內(nèi)衛(wèi)星細胞增殖Shh-Ag體內(nèi)試驗是通過直接肌內(nèi)(IM)注射Shh-Ag至小鼠骨骼肌來進行的。將野 生型(WT)或DMDtffix小鼠(肌營養(yǎng)不良模型)的脛骨前肌(TA)或腓腸肌(GA)注射20 μ L(TA) 或40 μ L (GA)的介質(zhì)(10% DMS0/PBS)或Shh-Ag (500 μ Μ),每天一次,連續(xù)注射兩天。第二 次IM注射后立即給小鼠腹膜內(nèi)(IP)注射IOOyL的BrdU。BrdU注射后24小時,將小鼠處 死并且收集它們的肌肉,并且制備用于FACS分析(GA)或免疫染色(TA)。為了免疫染色,將 肌肉切片用抗-層粘連蛋白探測,以標記基底層,同時用抗-BrdU探測,以鑒定增殖的細胞, 并且用蘇木素染料處理,以染色所有的細胞核。對于BrdU染色,當WT介質(zhì)注射的肌肉切片是陰性時,Shh-Ag注射的肌肉顯示出 BrdU+前體細胞。有趣的是,當DMDtffix肌肉顯示出高的BrdU+染色背景時,Shh-Ag注射似乎 促進更高的單核細胞浸潤。為了確定通過Shh-Ag處理刺激的固有增殖的細胞(BrdU+)是 否真正是衛(wèi)星細胞(SC),我們將切片對Pax7(轉(zhuǎn)錄因子并且是肌肉SC的標志物)進行染 色。同樣地,Pax7+SC正好位于WT和DMDtffix肌肉的邊緣。如預期那樣,連續(xù)再生的DMDtffix肌 肉顯示出大量的Pax7+SC和中央有核的肌纖維;但是,一些非特異性染色也出現(xiàn)在大量細 胞損傷的區(qū)域。由于核表達的PaX7/BrdU的共可視化是困難的,因此進行熒光共染色,以確定 Shh-Ag處理的肌肉中BrdU+細胞是否真正是Pax7+SC。在WT介質(zhì)注射的肌肉切片中,對于 BrdU,所有表達Pax7的SC是陰性,而Pax7+/BrdU+雙陽性細胞在WT Shh-Ag注射的肌肉中 易于看到。在DMDtffix肌肉中,在正常未處理條件下,大多數(shù)SC是BrdU+,但是Shh-Ag處理極 大地增加了 Pax7-/BrdU+細胞的數(shù)量。綜合來看,這些結果證實在WT肌肉中,Shh-Ag注射 直接活化了 SC增殖,但是在連續(xù)再生狀態(tài)的DMDtffix肌肉中,表達Pax7的SC的增殖響應已 經(jīng)最大化。由于DMDtra肌肉的異常病理狀態(tài),研究了 Shh-Ag處理對WT肌肉再生的作用,采 用已經(jīng)很好建立的心臟毒素誘導的損傷模型(Cooper,R.N.等人(1999) J Cell Sci 112, 2895) (Meeson,A. P.等人(2004) Stem Cells 22,1305-20)。響應單個心臟毒素(ctx)損傷, 發(fā)現(xiàn)Shh-Ag處理顯著增加了再生早期BrdU+細胞的數(shù)量。另外,Pax7和BrdU的熒光共染 色證實了與介質(zhì)對照相比,在Shh-Ag處理的肌肉中更大百分比的表達PAx7的SC是Pax7+/ BrdU+雙陽性。為了定量SC增殖的誘導,收集ctx-損傷的和Shh-Ag處理的肌肉樣品(GA)并且 進行FACS分析?;冖?5-和SyndecaM+表達,門控單細胞肌肉懸浮液,通常應用肌肉 SC鑒定物,然后分析產(chǎn)生的群的細胞內(nèi)BrdU定位(參見例如圖4)。Shh-Ag處理僅適當?shù)?增加了肌肉樣品中SC的總百分比,但是增加了超過兩倍百分數(shù)的增殖的(BrdU+)SC((參 見圖3);對于總百分數(shù)13. 06士0. 31對16. 15士 1. 57,對于BrdU+百分數(shù)4. 82士0.33對 10. 67 士 1. 87)。為了確定該早期衛(wèi)星細胞增殖的Shh-Ag活化是否導致肌肉再生的持續(xù)改善,將 肌肉如上述那樣處理并且在ctx-損傷后的較晚時間點(7天)分析。用抗-層粘連蛋白和 BrdU共染色的縱向肌肉切片證實在Shh-Ag處理的肌肉中BrdU+、中央排列的細胞核增加 (參見圖3)。由于骨骼肌細胞核是有絲分裂后的,BrdU+肌細胞核表示增殖的前體,其最終 與再生的肌纖維融合并且促成再生的肌纖維。BrdU+肌細胞核的增加清楚地證實了 Shh-Ag處理后早期SC活化的功能影響。
權利要求
治療肌骨骼障礙的方法,該方法包括給患者施用治療有效量的Sonic Hedgehog(Shh)途徑激動劑。
2.權利要求1的方法,其中所述的Shh激動劑包括式(I)化合物 其中,由于化合價和穩(wěn)定性允許,Ar和Ar’獨立地表示取代的或未取代的芳基或雜芳基環(huán); Y在每次出現(xiàn)時獨立地是不存在或表示-N(R)-、-0-、-S-或-Se-; X 選自-C( = 0)-、-C( = S)-、-S(02)-、-S(0)-、-C( = NCN)-、-P( = 0) (OR)-、以及任 選被1-2個基團例如低級烷基、鏈烯基或炔基取代的亞甲基;M在每次出現(xiàn)時獨立地表示取代的或未取代的亞甲基,例 如-CH2-、-CHF-、-CH0H—CH(Me)-、-C( = 0)-等,或者兩個M—起表示取代的或未取代的乙 烯或乙炔,其中Mj中某些或所有出現(xiàn)的M形成環(huán)狀結構的全部或部分;R在每次出現(xiàn)時獨立地表示H或者取代的或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜 芳烷基、炔基、鏈烯基或烷基,或者兩個R —起可以例如與N形成4-至8-元環(huán); Cy’表示取代的或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基,包括多環(huán)基團; j在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至10、優(yōu)選2至7 ;并且 i在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至5、優(yōu)選0至2。
3.權利要求2的方法,其中所述的Shh激動劑是Shh-Ag。
4.權利要求1的方法,其中所述的肌骨骼障礙是肌營養(yǎng)不良。
5.權利要求1的方法,其中所述的肌骨骼障礙是肌病。
6.診斷肌骨骼障礙的方法,該方法包括給患者施用治療有效量的Sonic Hedgehog (Shh)途徑激動劑。
7.權利要求6的方法,其中所述的Shh激動劑包括式(I)化合物 (I)其中,由于化合價和穩(wěn)定性允許,Ar和Ar’獨立地表示取代的或未取代的芳基或雜芳基環(huán); Y在每次出現(xiàn)時獨立地是不存在或表示-N(R)-、-0-、-S-或-Se-; X 選自-C( = 0)-、-C( = S)-、-S(02)-、-S(0)-、-C( = NCN)-、-P( = 0) (OR)-、以及任 選被1-2個基團例如低級烷基、鏈烯基或炔基取代的亞甲基;M在每次出現(xiàn)時獨立地表示取代的或未取代的亞甲基,例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH( Me)-、-C ( = 0)-等,或者兩個M—起表示取代的或未取代的乙烯或乙炔,其中Mj中某些或所 有出現(xiàn)的M形成環(huán)狀結構的全部或部分;R在每次出現(xiàn)時獨立地表示H或者取代的或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜 芳烷基、炔基、鏈烯基或烷基,或者兩個R —起可以例如與N形成4-至8-元環(huán); Cy’表示取代的或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基,包括多環(huán)基團; j在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至10、優(yōu)選2至7 ;并且 i在每次出現(xiàn)時獨立地表示整數(shù)0至5、優(yōu)選0至2。
8.權利要求7的方法,其中所述的Shh激動劑是Shh-Ag。
9.權利要求6的方法,其中所述的肌骨骼障礙是肌營養(yǎng)不良。
10.權利要求6的方法,其中所述的肌骨骼障礙是肌病。
11.測定試驗藥物是否增加初級成肌細胞增殖的方法,該方法包括(i)將已知上調(diào) Sonic Hedgehog(Shh)途徑的試驗藥物施用于非人類個體;和(ii)測定個體產(chǎn)生的初級成 肌細胞增殖是否大于未施用藥物的個體,從而測定藥物是否增加初級成肌細胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明提供了診斷和治療與Hedgehog途徑相關的肌骨骼障礙的方法,所述的障礙包括但不限于肌營養(yǎng)不良(例如迪謝納肌營養(yǎng)不良),該方法應用激動Sonic Hedgehog(shh)并且從而激動Hedgehog信號傳導途徑的藥物。所述的激動劑包括例如本發(fā)明化合物(例如式I化合物)。本發(fā)明還提供了篩選能夠增加肌肉和/或肌肉前體細胞增殖的藥物的方法。
文檔編號A61K31/4436GK101932313SQ200980103469
公開日2010年12月29日 申請日期2009年1月27日 優(yōu)先權日2008年1月29日
發(fā)明者D·D·阿姆斯特朗, S·卡達姆 申請人:諾瓦提斯公司