轉(zhuǎn)基因玉米mir604轉(zhuǎn)化事件特異性定量pcr精準(zhǔn)檢測的引物和探針及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法。本發(fā)明采用設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列MIR604eveF、下游引物序列MIR604eveR、熒光探針序列MIR604eveP、MIR604的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR檢測。本發(fā)明主要建立了一種高擴(kuò)增效率、高準(zhǔn)確度的Taqman定量PCR檢測技術(shù)，適用于國內(nèi)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)、進(jìn)出境口岸轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢驗(yàn)、企業(yè)內(nèi)部進(jìn)口原材料含轉(zhuǎn)基因MIR604品系生物成分檢測。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測的引物和探針及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]國際上很多國家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國尚無具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值。為了打破歐盟等國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時(shí)彌補(bǔ)和完善我國轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系，更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法已成為必要。
[0003]目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的檢測技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法和標(biāo)準(zhǔn)，尚無關(guān)于擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化事件特異性某特定位點(diǎn)(基因序列)的定量PCR精準(zhǔn)檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高的檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化事件特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測技術(shù)。
[0005]本發(fā)明通過下述技術(shù) 方案實(shí)現(xiàn):
轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測的引物和探針，
其中，上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’ ；
下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’ ；
熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’。
[0006]轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，包括以下步驟:
(1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’
下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’
熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’ ；
(2)制備MIR604的DNA稀釋液；
(3)配制PCR反應(yīng)體系；
(4)定量PCR檢測。
[0007]進(jìn)一步地，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
[0008]再進(jìn)一步地，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將DNA稀釋液加入到反應(yīng)體系中配制成20μ1的反應(yīng)體系，所述20μ1的反應(yīng)體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液4.ΟμL
水3.5μ1。
[0009]另外，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性lOmin，I個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，60°C退火60s, 45個(gè)循環(huán)。
[0010]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
(1)本發(fā)明打破歐盟等國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘；
(2)本發(fā)明彌補(bǔ)和完善我國轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系；
(3)本發(fā)明提供的檢測技術(shù)可更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)；
(4)本發(fā)明擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明對(duì)非目標(biāo)轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的檢測結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。實(shí)施例
[0013]轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，主要包括以下步驟:
(I)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’
下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’
熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’。
[0014]本實(shí)施例引物及熒光探針的合成濃度均為10Mmol/l。
[0015]以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化事件特異性某特定位點(diǎn)，即目的基因與受體玉米基因組旁側(cè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)；通過該設(shè)計(jì)就可以精準(zhǔn)檢測轉(zhuǎn)基因玉米中MIR604的轉(zhuǎn)化事件。
[0016](2)制備MIR604的DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米MIR604中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。
[0017](3)配制PCR反應(yīng)體系；即將DNA稀釋液加入到反應(yīng)體系中配制成20μ1的反應(yīng)體系，所述20μ1的反應(yīng)體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL
下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液4.ΟμL
水3.5μ1。
[0018](4)定量 PCR 檢測。[0019]根據(jù)上述PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并檢測，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，60°C退火60s，45個(gè)循環(huán)。本實(shí)施例中采用的是ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀器。
[0020]采用本發(fā)明對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個(gè)玉米轉(zhuǎn)化體，5個(gè)水稻轉(zhuǎn)化體，5個(gè)大豆轉(zhuǎn)化體，3個(gè)棉花轉(zhuǎn)化體，3個(gè)油菜轉(zhuǎn)化體和I個(gè)甜菜轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了特異性檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，從圖1可看出本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)以上非轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體均沒有非特異擴(kuò)增。另外圖1中Λ Rn代表熒光原始信號(hào)減去背景信號(hào)的值。
[0021]同時(shí)，采用本發(fā)明對(duì)1%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性片段進(jìn)行定量檢測，連續(xù)重復(fù)做10個(gè)平行樣品的檢測數(shù)據(jù)見表1。
[0022] 表1檢測樣品(1%，CRM)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604特異片段定量檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測的引物和探針，其特征在于， 上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’ ； 下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’ ； 熒光探針序列，MIR604eveP:5’ -FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’。
2.轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，MIR604eveF:5’ -GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’ 下游引物序列，MIR604eveR:5’ -CGACGCTTGCGCGAG-3’ 熒光探針序列，MIR604eveP:5’-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3’ ； (2)制備MIR604的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應(yīng)體系； (4)定量PCR檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，步驟(1)所 述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將DNA稀釋液加入到反應(yīng)體系中配制成2θμL的反應(yīng)體系,所述2θμL的反應(yīng)體系包括以下組分: Taqman Master mix (2X )10M-1 上游引物ιμL 下游引物ιμL 熒光探針0.5μ1 DNA稀釋液4.ΟμL 水3.5μ1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604轉(zhuǎn)化事件特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，60°C退火60s,45個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104032027SQ201410304821
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】常麗娟, 宋君, 雷紹榮, 郭靈安, 劉勇, 王東, 尹全, 劉文娟, 張富麗 申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心