一種卵黃抗體的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種卵黃抗體的制備方法，其采用滅活的保藏編號(hào)為CGMCC?No.9181的大腸埃希氏菌HNJD2014免疫蛋雞，然后從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體。本發(fā)明采用滅活的大腸埃希氏菌HNJD2014，能夠持續(xù)性獲得高純度的抗原；獲得的卵黃抗體效價(jià)高，免疫效果好；能夠有效預(yù)防和治療仔豬腹瀉，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)豬的生長(zhǎng)發(fā)育。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種卵黃抗體的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于預(yù)防仔豬腹瀉的卵黃抗體制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種預(yù)防仔豬腹瀉的卵黃抗體的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，仔豬腹瀉給規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，在2010年至2012年，流行性腹瀉病毒導(dǎo)致的腹瀉發(fā)生率為39%至47%。大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒等病原體也是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要病原體?？股氐拇罅繎?yīng)用并沒(méi)有從根本上控制仔豬腹瀉的問(wèn)題，大量使用還容易產(chǎn)生耐藥性和畜產(chǎn)品藥物殘留，有悖于養(yǎng)豬業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。尋求綠色環(huán)保的預(yù)防性的抗生素替代品成為目前畜牧業(yè)健康發(fā)展的首選方案。卵黃抗體在疾病的預(yù)防、治療和診斷上發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，基于抗PRRSV-N蛋白的卵黃抗體可以診斷PRRS病原。卵黃抗體對(duì)產(chǎn)生相應(yīng)抗原的病原體的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)卵黃抗體的體內(nèi)和體外的抑菌特性，其對(duì)細(xì)菌性腹瀉和病毒性腹瀉具有良好的防治作用。總之，卵黃抗體在動(dòng)物傳染性疾病的預(yù)防和治療過(guò)程中具有良好的應(yīng)用前景，可以替代抗生素的使用，減少病原體的耐藥性，是一種新型的綠色環(huán)保型抗生素替代品。
[0003]卵黃抗體特點(diǎn):1gY具有良好的穩(wěn)定性，耐熱、耐酸、耐堿，抗離子強(qiáng)度，并具有一定抗酶解能力。研究表明，IgY能夠抵抗幼齡動(dòng)物腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。家禽免疫系統(tǒng)的特性決定小劑量的抗原便可發(fā)揮作用，因此可以用少量抗原在較長(zhǎng)時(shí)間獲得大量高滴度特異性抗體。一個(gè)母雞每年大約能產(chǎn)280枚雞蛋，每個(gè)卵黃里面含有100~150mg IgY，因此每只雞每年能夠產(chǎn)生40g特異性卵黃抗體，具有很大的生產(chǎn)潛力。因此，與其他哺乳動(dòng)物制備多克隆抗體相比，特異性IgY抗體制備有著經(jīng)濟(jì)、易操作、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。但是現(xiàn)有的制備純化卵黃抗體的方法還有待進(jìn)一步多元化以及提高效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防仔豬腹瀉的卵黃抗體的制備方法，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比操作簡(jiǎn)單，成本低，制備效率高，抗體效價(jià)高。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種卵黃抗體的制備方法，采用滅活的保藏編號(hào)為CGMCC N0.9181的大腸埃希氏菌HNJD2014免疫蛋雞，然后從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體。
[0007]采用TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸埃希氏菌HNJD2014。
[0008]大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.25%~0.35%甲醛在37°C滅活24小時(shí)。優(yōu)選大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.3%甲醛在37°C滅活24小時(shí)。
[0009] 用甲醛滅活并進(jìn)行濃縮，細(xì)菌含量為(1.5~3) X 19個(gè)/mL，佐劑為白油佐劑，白油佐劑包括94重量份白油、6重量份司本80、2?1:%硬脂酸招,水相與油相按體積比2:1混合，采用磁力攪拌器充分混勻。
[0010]選擇100羽180~220日齡蛋雞，胸肌分點(diǎn)免疫，0.8~1.0mL/羽，首次免疫后每隔15d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，首次免疫45~50d后，抽檢蛋樣滴度，當(dāng)凝集效價(jià)大于1:512后作為高免雞蛋收集，其后每隔30~40d再加強(qiáng)免疫一次，即可得到凝集價(jià)為1:512的持續(xù)高效價(jià)IgY的雞蛋。
[0011]從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時(shí)，獲得的蛋黃充分?jǐn)噭?，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋?zhuān)浞謹(jǐn)噭?；量取蒸餾水，按2.85%~3.15%質(zhì)量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分?jǐn)噭?，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為0.95~1.05wt% ;靜置使脂質(zhì)充分沉淀。
[0012]優(yōu)選雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時(shí)，獲得的蛋黃充分?jǐn)噭颍凑阵w積比1:1加入蒸餾水稀釋?zhuān)浞謹(jǐn)噭?；量取蒸餾水，按3%質(zhì)量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分?jǐn)噭?，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為lwt% ；靜置使脂質(zhì)充分沉淀。
[0013]蛋黃脂質(zhì)沉淀過(guò)后,將上清液過(guò)濾；添加8wt%~ 12wt%麥芽糊精、3wt%~ 5wt%β -環(huán)糊精、2wt%~4wt%微晶纖維素3種輔料，充分?jǐn)噭?；然后噴霧干燥，噴霧干燥條件:進(jìn)風(fēng)溫度170~190°C，蠕動(dòng)泵18~20轉(zhuǎn)每分鐘，風(fēng)速頻率為55~60Hz。
[0014]一種用于制備卵黃抗體抗原的大腸桿菌，所述的大腸桿菌是大腸埃希氏菌HNJD2014，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.9181。
[0015]該菌株從患病仔豬體內(nèi)分離篩選得到，經(jīng)16S rRNA基因鑒定為Escherichia coli屬，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)HNJD2014 ；
[0016]保藏日期:2014年5月20日；
[0017]保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；
[0018]保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)；
[0019]保藏號(hào):CGMCCN0.9181。
[0020]本發(fā)明帶來(lái)的有益效果
[0021]1、大腸桿菌菌種保藏編號(hào)為CGMCC N0.9181由本發(fā)明人分離保藏，經(jīng)PCR鑒定，該菌種可表達(dá)ST、LT及志賀毒素，能夠很方便地直接獲得這三種毒素引起的仔豬腹瀉的抗體，使得產(chǎn)生的抗體具有更好的保護(hù)力，能夠持續(xù)性獲得高純度的抗原；
[0022]2、利用滅活的大腸桿菌菌種CGMCC N0.9181免疫蛋雞，可以高效率地獲得卵黃抗體；
[0023]3、獲得的卵黃抗體效價(jià)高，免疫效果好；能夠有效預(yù)防和治療仔豬腹瀉，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)豬的生長(zhǎng)發(fā)育；
[0024]4、采用噴霧干燥技術(shù)簡(jiǎn)化卵黃抗體純化生產(chǎn)工藝，使卵黃抗體在豬場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用成為可能；
[0025]5、在生產(chǎn)過(guò)程中避免使用有機(jī)溶劑等有害物質(zhì)，減少污染，保護(hù)環(huán)境；
[0026]6、操作條件容易掌握，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本可大幅降低。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為大腸埃希氏菌HNJD2014菌落圖；
[0028] 圖2為大腸埃希氏菌HNJD2014毒素PCR鑒定結(jié)果；
[0029]圖2中M表示DNA分子Marker2000，ST表示耐熱腸毒素，分子大小240bp ；LT表示不耐熱腸毒素，分子大小300bp ；eVT表不志賀毒素,分子大小469bp。

【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0031]實(shí)施例1
[0032]1、大腸桿菌IgY制備具體方案
[0033]大腸桿菌菌種CGMCC N0.9181由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏，采用TSB平板培養(yǎng)，生成圓形突起、光滑、濕潤(rùn)、半透明的乳白色菌落，如圖1所示。本菌在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度為37°C，最適生長(zhǎng)pH為7.2~7.4。經(jīng)PCR鑒定，該菌種可表達(dá)ST (耐熱腸毒素)、LT(不耐熱腸毒素)及志賀毒素，如圖2所示。采用TSB液體培養(yǎng)基大量培養(yǎng)大腸桿菌，用
0.25~0.35%甲醛滅活并進(jìn)行濃縮，優(yōu)選甲醛濃度為0.3%，細(xì)菌含量為(1.5~3) X 19/mL，佐劑為白油佐劑(94份白油、6份司本80、2%硬脂酸鋁)，水相與油相按2:1體積混合，用磁力攪拌器在室溫下充分混勻，轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/分鐘。選擇100羽180~220日齡蛋雞，胸肌分點(diǎn)免疫，0.8~1.0mL/羽。首次免疫后每隔15d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，首次免疫45~50d后，抽檢蛋樣滴度，當(dāng)凝集效價(jià)大于1:512后作為高免雞蛋收集，其后每隔30~40d再加強(qiáng)免疫一次，即可得到持續(xù)高價(jià)IgY的雞蛋(凝集價(jià)為1:512)。
[0034]2、雞蛋消毒及蛋黃分離
[0035]采用千分之一濃度的聚維酮碘浸泡雞蛋消毒，清除蛋殼上的污點(diǎn)，打蛋分離蛋黃和蛋清。
[0036]3、蛋黃脂質(zhì)沉淀
[0037]獲得的蛋黃充分?jǐn)噭颍凑阵w積比1:1加入蒸餾水稀釋?zhuān)浞謹(jǐn)噭?；量取蒸餾水，按2.85~3.15wt %的量添加泊洛沙姆，優(yōu)選3wt %的泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分?jǐn)噭?；使蛋黃液終體系中泊洛沙姆的含量為0.95~1.05wt%,優(yōu)選lwt%的泊洛沙姆；靜置使脂質(zhì)充分沉淀。
[0038]蛋黃中脂質(zhì)含量達(dá)到36%，在噴霧干燥過(guò)程中容易導(dǎo)致旋風(fēng)分離器發(fā)生粘壁。降低蛋黃中脂肪含量是解決粘壁問(wèn)題的關(guān)鍵。泊洛沙姆能夠沉淀蛋黃中的脂肪，脫脂后的蛋黃液噴霧干燥過(guò)程粘壁現(xiàn)象明顯降低。泊洛沙姆是一類(lèi)由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)組成的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0型非離子三嵌段共聚物。它具有表面活性，良好的安全性。
[0039]4、卵黃抗體噴霧干燥
[0040]蛋黃脂質(zhì)沉淀過(guò)后,將上清液過(guò)濾。添加8wt%~ 12wt%麥芽糊精、3wt%~ 5wt%β -環(huán)糊精、2wt%~ 4wt%微晶纖維素3種輔料，充分?jǐn)噭?。采用BIL0N-6000Y噴霧干燥機(jī)噴霧干燥。噴霧干燥條件:進(jìn)風(fēng)溫度170~190°C，蠕動(dòng)泵18~20轉(zhuǎn)每分鐘，風(fēng)速頻率為55~60Hz。將收集的噴霧干燥卵黃抗體粉裝入封口袋，密封保存。
[0041]5、大腸桿菌IgY滴度評(píng)估(微量凝集實(shí)驗(yàn))
[0042]將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌液進(jìn)行10倍濃縮，過(guò)夜培養(yǎng)菌含量為1.5 X 19個(gè)/mL。采用PEG6000沉淀法提取蛋黃中的IgY，具體過(guò)程為:蛋黃液與PBS按1:2混合，加入3.5%PEG6000, 1000rpm 離心 15min，收集上清并過(guò)濾，加入 8.5% PEG6000, 1000rpm, 15min，棄上清，用PBS懸浮沉淀，加入12% PEG6000再次沉淀，即可獲得較純的IgY。
[0043]按棋盤(pán)法對(duì)抗原抗體進(jìn)行稀釋?zhuān)乖?:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，抗體作1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024，各加 50 μ 1，37。。作用 I ~4h，每隔30min進(jìn)行觀察,觀察沉淀的效果,結(jié)果顯示抗原在1:4~1:6,抗體在1:128~1:512,結(jié)果最為明顯。
[0044]實(shí)施例2本發(fā)明制備的卵黃抗體預(yù)防腹瀉效果
[0045]株洲某豬場(chǎng)，該場(chǎng)2013年10月份爆發(fā)腹瀉，仔豬出生后3~4天腹瀉嚴(yán)重，黃色水樣糞便，小豬死亡很多。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉。
[0046]隨機(jī)選擇30頭待產(chǎn)母豬，試驗(yàn)組和對(duì)照組各15頭，按照欄位間隔排列。試驗(yàn)組(A)母豬所產(chǎn)仔豬采用本發(fā)明制備的卵黃抗體灌服:卵黃抗體粉采用生理鹽水稀釋?zhuān)琁克卵黃抗體粉加生理鹽水2mL，出生后I小時(shí)內(nèi)灌服3mL ;對(duì)照組(B)母豬所產(chǎn)仔豬不做任何處理。飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。觀察并記錄仔豬腹瀉情況。試驗(yàn)結(jié)果如下所示。
[0047]數(shù)字1、2、3分別表示不同程度的腹瀉:1表示輕微腹瀉，糞便變軟；2表示中度腹瀉，糞便水樣；3表示嚴(yán)重腹瀉，糞水分離狀態(tài)。表格中數(shù)字表示每天觀察到的腹瀉次數(shù)，根據(jù)漏糞板上糞便狀況而定。最終結(jié)果由腹瀉指數(shù)評(píng)定，數(shù)值越大，腹瀉越嚴(yán)重。腹瀉指數(shù)=糞便評(píng)分之和/供試驗(yàn)仔豬總頭數(shù)。
[0048]表1卵黃抗體預(yù)防仔豬腹瀉效果
[0049]

【權(quán)利要求】
1.一種卵黃抗體的制備方法,其特征在于,米用滅活的保藏編號(hào)為CGMCC N0.9181的大腸埃希氏菌HNJD2014免疫蛋雞，然后從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，采用TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸埃希氏菌HNJD2014。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.25%~0.35%甲醛在37°C滅活24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，大腸埃希氏菌HNJD2014采用0.3%甲醛在37°C滅活24小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，用甲醛滅活并進(jìn)行濃縮，細(xì)菌含量為(1.5~3) X 19個(gè)/mL，佐劑為白油佐劑，白油佐劑包括94重量份白油、6重量份司本80、2wt%硬脂酸鋁，水相與油相按體積比2:1混合，采用磁力攪拌器充分混勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，選擇100羽180~220日齡蛋雞，胸肌分點(diǎn)免疫，0.8~1.0mL/羽，首次免疫后每隔15d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，首次免疫45~50d后，抽檢蛋樣滴度，當(dāng)凝集效價(jià)大于1:512后作為高免雞蛋收集，其后每隔30~40d再加強(qiáng)免疫一次，即可得到凝集價(jià)為1:512的持續(xù)高效價(jià)IgY的雞蛋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時(shí)，獲得的蛋黃充分?jǐn)噭?，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋?zhuān)浞謹(jǐn)噭颍涣咳≌麴s水，按2.85%~3.15%質(zhì)量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分?jǐn)噭?，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為0.95~1.05wt% ;靜置使脂質(zhì)充分沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，從雞蛋蛋黃中提取純化卵黃抗體時(shí)，獲得的蛋黃充分?jǐn)噭?，按照體積比1:1加入蒸餾水稀釋?zhuān)浞謹(jǐn)噭?；量取蒸餾水，按3%質(zhì)量比添加泊洛沙姆，充分溶解，將溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黃液中充分?jǐn)噭?，使包含蛋黃液的終體系中泊洛沙姆的含量為;靜置使脂質(zhì)充分沉淀。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，蛋黃脂質(zhì)沉淀過(guò)后，將上清液過(guò)濾；添加8wt%~12wt%麥芽糊精、3wt%~5wt% β -環(huán)糊精、2wt%~4wt%微晶纖維素3種輔料，充分?jǐn)噭?；然后噴霧干燥，噴霧干燥條件:進(jìn)風(fēng)溫度170~190°C，蠕動(dòng)泵18~20轉(zhuǎn)每分鐘，風(fēng)速頻率為55~60Hz。
10.一種用于制備卵黃抗體抗原的大腸桿菌，其特征在于，所述的大腸桿菌是大腸埃希氏菌 HNJD2014，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.9181。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104072609SQ201410304764
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】汪鎮(zhèn)南, 劉云福, 肖淑華, 顏愛(ài), 李代林 申請(qǐng)人:湖南九鼎科技（集團(tuán)）有限公司獸藥分公司