專利名稱：一種雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的制備方法，屬于疾病免疫技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病是養(yǎng)雞業(yè)中常見的疾病，容易大面積爆發(fā)從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì) 損失。目前主要的防止方法包括抗生素、中西藥及其制劑、卵黃抗體及其生物制劑等，其中 卵黃抗體是采用雞傳染性法氏囊病抗原免疫健康雞，從免疫雞蛋的卵黃中提取雞傳染性法 氏囊病抗體，這種通過雞免疫后卵黃抗體對(duì)雞傳染性法氏囊病見效快、療效顯著，而且針對(duì) 性強(qiáng)，對(duì)雞傳染性法氏囊病具有很好的預(yù)防效果。目前卵黃抗體的制備及生產(chǎn)工藝在現(xiàn)在 生產(chǎn)中已經(jīng)成熟，主要采用的是離心沉淀法提取抗體，這樣效率比較高，但是在高速離心的 情況下會(huì)造成抗體的損失，從而影響卵黃抗體生產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞傳染性法氏囊病的卵黃抗體的提取方法，以減少卵黃 抗體的損失，提高卵黃抗體的效價(jià)。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種雞傳染性法氏囊病的雞卵 黃抗體的提取方法，取得免疫卵黃后，打碎，分別采用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、辛酸溶液及 硫酸銨進(jìn)行提純凈化，然后用濾膜過濾得到卵黃抗體。本發(fā)明提取方法的具體步驟如下
1)將免疫雞蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；
2)從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入抗生素和無菌生理鹽水，再進(jìn)行打碎混勻，得到 卵黃液；
3)向卵黃液中加入pH為4.8-5. 2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，混勻，靜置，取上清液；
4)向步驟3)得到的上清液中加入占上清液0.8-1. 0%體積的辛酸，混勻，靜置，取上清
液；
5)向步驟4)得到的上清液加入0.6-1. 4倍體積的硫酸銨溶液，震蕩、離心，棄去上清液 后，用PBS溶液重新懸浮沉淀至初體積，再在攪拌下加入0. 3-0. 7倍初體積的飽和硫酸銨溶 液，靜置，再用100KD的濾膜進(jìn)行抽濾，得到大于等于100KD分子量的沉淀物，用PBS溶液重 懸沉淀，得到卵黃抗體溶液；
步驟2)所述抗生素的加入量為每毫升卵黃2000-4000U。在進(jìn)行100KD的濾膜抽濾前采用0. 22 μ m的濾膜過濾，取濾液。步驟3)和4)中的靜置的溫度為4-6°C，靜置時(shí)間為10_12h。步驟5)中的PBS溶液的濃度為0. 8-1. 0%。步驟5)所述第一次加入的硫酸銨溶液的濃度為25-30%。將步驟5)得到的卵黃抗體溶液用甲醛滅活除菌。
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本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病的卵黃抗體的提取方法，分別采用乙酸-乙酸鈉緩沖 溶液、辛酸溶液及硫酸銨溶液進(jìn)行提純和凈化，最終采用濾膜抽濾，減少抗體的損失和抗體 的破壞，提高了卵黃抗體的生產(chǎn)率，而且本發(fā)明的方法操作簡單、便于生產(chǎn)推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本實(shí)施例的雞傳染性法氏囊病的卵黃抗體的提取方法，其步驟如下
1)將免疫雞蛋進(jìn)行清洗，然后用無菌生理鹽水清洗，晾干，接著用消毒液進(jìn)行42°c浸泡 20min,晾干，用95%的酒精噴灑消毒，晾干備用；
2)采用蛋黃分離器進(jìn)行分離，從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入與卵黃體積等量的無 菌生理鹽水，然后按照每毫升卵黃2000U的量分別加入青霉素和鏈霉素，再進(jìn)行打碎混勻， 得到卵黃液；
3)向卵黃液中加入pH為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加入量為卵黃液體積的5倍 量，混勻，于4°C靜置10h，取上清液；
4)向步驟3)得到的上清液加入上清液體積0.8%的辛酸，混勻，于室溫靜置2h，取上清
液；
5)向步驟4)得到的上清液加入0.6倍體積的25%硫酸銨溶液，4°C振蕩l_2h，ISOOOr/ min離心20min，棄去上清液后，用0. 8% PBS溶液重新懸浮沉淀至初體積，再在攪拌下加入 0. 3倍初體積的飽和硫酸銨溶液，靜置lh，接著用100KD的濾膜(型號(hào)MWC0)進(jìn)行抽濾，得到 大于等于100KD分子量的沉淀物，用0. 8% PBS溶液重懸沉淀，得到卵黃抗體溶液；
6)用甲醛對(duì)卵黃抗體溶液滅活，防止其它垂直傳染病的感染。實(shí)施例2
本實(shí)施例的雞傳染性法氏囊病的卵黃抗體的提取方法，其步驟如下
1)將免疫雞蛋進(jìn)行清洗，然后用無菌生理鹽水清洗，晾干，接著用消毒液進(jìn)行42°C浸泡 20min,晾干，用95%的酒精噴灑消毒，晾干備用；
2)采用蛋黃分離器進(jìn)行分離，從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入與卵黃體積等量的無 菌生理鹽水，然后按照每毫升卵黃3000U的量加入青霉素和鏈霉素，再進(jìn)行打碎混勻，得到 卵黃液；
3)向卵黃液中加入pH為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加入量為卵黃液體積的6倍， 混勻，于5°C靜置11小時(shí)，取上清液；
4)向步驟3)得到的上清液加入上清液體積0.9%的辛酸，混勻，于5°C靜置2h，取上清
液；
5)向步驟4)得到的上清液加入1.0倍體積的28%硫酸銨溶液，4°C振蕩l_2h，ISOOOr/ min離心20min，棄去上清液后，用0. 9% PBS溶液重新懸浮沉淀至初體積，再在攪拌下加入 0. 5倍初體積的飽和硫酸銨溶液，靜置lh，接著用100KD的濾膜(型號(hào)MWC0)進(jìn)行抽濾，得到 大于等于100KD分子量的沉淀物，用0. 9% PBS溶液重懸沉淀，得到卵黃抗體溶液；
6)用甲醛對(duì)卵黃抗體溶液滅活，防止其它垂直傳染病的感染。實(shí)施例3
本實(shí)施例的雞傳染性法氏囊病的卵黃抗體的提取方法，其步驟如下1)將免疫雞蛋進(jìn)行清洗，然后用無菌生理鹽水清洗，晾干，接著用消毒液進(jìn)行42°C浸泡 20min,晾干，用95%的酒精噴灑消毒，晾干備用；
2)采用蛋黃分離器進(jìn)行分離，從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入與卵黃體積等量的無 菌生理鹽水，然后按照每毫升卵黃4000U的量加入青霉素和鏈霉素，再進(jìn)行打碎混勻，得到 卵黃液；
3)向卵黃液中加入pH為5.2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加入量為卵黃液體積的7倍， 混勻，于6°C靜置12小時(shí)，取上清液；
4)向步驟3)得到的上清液加入上清液體積1%的辛酸，混勻，于室溫靜置2h，取上清
液；
5)向步驟4)得到的上清液加入1.4倍體積的30%硫酸銨溶液，4°C振蕩l_2h，ISOOOr/ min離心20min，棄去上清液后，用1.0% PBS溶液重新懸浮沉淀至初體積，再在攪拌下加入 0. 7倍初體積的飽和硫酸銨溶液，靜置lh，接著采用0. 22 μ m的濾膜過濾取濾液，保證濾液 中物質(zhì)分子量低于200KD，再用100KD的濾膜(型號(hào)MWC0)進(jìn)行抽濾，得到大于等于100KD分 子量的沉淀物，用1. 0% PBS溶液重懸沉淀，得到卵黃抗體溶液；
6)用甲醛對(duì)卵黃抗體溶液滅活，防止其它垂直傳染病的感染。實(shí)驗(yàn)例
一、對(duì)實(shí)施例1-3和常規(guī)提取方法的卵黃抗體利用瓊脂擴(kuò)散凝膠試驗(yàn)瓊脂為1. 2%， 氯化鈉為8%，配制成平板，要求平板厚度為5mm，孔距為4 mm,孔徑為5mm，加入量約30 μ 1， 37°C培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果。結(jié)果見表1。表1各實(shí)施例效價(jià)試驗(yàn)結(jié)果
組別實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3常規(guī)提取抗體效價(jià)1:641:641:321:32
二、毒性試驗(yàn)以實(shí)施例1的卵黃抗體為例。選取三組試驗(yàn)動(dòng)物每組20只健康的SPF 小雞，一組生理鹽水，二組常量(lml)，三組大于治療量(3ml)，采用完全自由飼養(yǎng)方式，接 種后觀察兩周，三組的雞群精神比較均一，飲食欲幾乎無變化。 三、攻毒試驗(yàn)將試驗(yàn)動(dòng)物分成五組每 20只健康的SPF小雞，一組生理鹽水，二、 三、四組分別為實(shí)施例1、2、3的試驗(yàn)組，五組常規(guī)提取抗體，接種量為lml/只，采用完全自 由飼養(yǎng)方式，五天后，接種分離的強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒，觀察兩周。結(jié)果見表2 表2統(tǒng)計(jì)抗體保護(hù)動(dòng)物試驗(yàn)情況
權(quán)利要求
一種雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于取得免疫卵黃后，打碎，分別采用乙酸 乙酸鈉緩沖溶液、辛酸溶液及硫酸銨進(jìn)行提純凈化，然后用濾膜過濾得到卵黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 具體步驟如下1)將免疫雞蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；2)從免疫雞蛋中取得卵黃，打碎，加入抗生素和無菌生理鹽水，再進(jìn)行打碎混勻，得到 卵黃液；3)向卵黃液中加入pH為4.8-5. 2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，混勻，靜置，取上清液；4)向步驟3)得到的上清液中加入占上清液0.8-1. 0%體積的辛酸，混勻，靜置，取上清液；5)向步驟4)得到的上清液加入0.6-1. 4倍體積的硫酸銨溶液，震蕩、離心，棄去上清液 后，用PBS溶液重新懸浮沉淀至初體積，再在攪拌下加入0. 3-0. 7倍初體積的飽和硫酸銨溶 液，靜置，再用100KD的濾膜進(jìn)行抽濾，得到大于等于100KD分子量的沉淀物，用PBS溶液重 懸沉淀，得到卵黃抗體溶液；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 步驟2)所述抗生素的加入量為每毫升卵黃2000-4000U。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 在進(jìn)行100KD的濾膜抽濾前采用0. 22 μ m的濾膜過濾，取濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 步驟3)和4)中的靜置的溫度為4-60C，靜置時(shí)間為10-12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 步驟5)中的PBS溶液的濃度為0. 8-1. 0%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 步驟5)所述第一次加入的硫酸銨溶液的濃度為25-30%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，其特征在于 將步驟5)得到的卵黃抗體溶液用甲醛滅活除菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞傳染性法氏囊病的雞卵黃抗體的提取方法，取得免疫卵黃后，打碎，分別采用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、辛酸溶液及硫酸銨進(jìn)行提純凈化，然后用濾膜過濾得到卵黃抗體。本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病的卵黃抗體的提取方法，分別采用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、辛酸溶液及硫酸銨溶液進(jìn)行提純和凈化，最終采用濾膜抽濾，減少抗體的損失和抗體的破壞，提高了卵黃抗體的生產(chǎn)率，而且本發(fā)明的方法操作簡單、便于生產(chǎn)推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101955532SQ201010514068
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 郭俊清 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司