專利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米nk603結(jié)構(gòu)特異定量pcr精準檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及基因的定量的分析方法。
背景技術(shù)：
國際上很多國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時彌補和完善我國轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系，更好地保護消費者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。并且目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米NK603的檢測技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關(guān)于擴增檢測轉(zhuǎn)基因玉米NK603及產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特異性某特定位點(基因序列) 的定量PCR精準檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉(zhuǎn)基因玉米NK603及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術(shù)。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)
轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟 合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，Construct603-F: 5，-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3’ 下游引物序列，Construct603-R: 5，-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3， 熒光探針序列，Construct603-P: 5，-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3’ ；
(2)制備NK603品系的DNA稀釋液；
(3)配制PCR反應(yīng)體系；
(4)定量PCR檢測。進一步，步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度都為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。為了達到最好的檢測效果，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到25μ1反應(yīng)體系中，所述25μ1的反應(yīng)體系包括以下組分
Taqman Master mix12. 5M-I
上游引物ιμ
下游引物ιμ
熒光探針0. 5 μι
水IOul。作為最優(yōu)的反應(yīng)條件，所述PCR反應(yīng)條件為95°C預變性10min，l個循環(huán)；95°C變性15s，59°C退火60s，45個循環(huán)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果1、本發(fā)明打破了歐盟等國家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘。2、本發(fā)明彌補和完善了我國轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系。3、本發(fā)明提供的檢測技術(shù)可更好地保護消費者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)。4、本發(fā)明擴增效率高、準確度高。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明的實施方式并不限于此。 實施例轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法，主要包括以下步驟 (1)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，Construct603-F: 5，-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3’
下游引物序列，Construct603-R: 5，-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3，
熒光探針序列，Construct603-P: 5，-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3，。本實施例引物及熒光探針的合成濃度都為lOMmol/l。以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對轉(zhuǎn)基因玉米NK603及產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特異性某特定位點，即目的基因與調(diào)控元件特異位點設(shè)計；通過該設(shè)計就可以精準檢測轉(zhuǎn)基因玉米中NK603的轉(zhuǎn)化事件。(2)制備NK603品系的DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米 NK603中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。(3)配制PCR反應(yīng)體系；即將3ul制備好的DNA稀釋液加入25ul反應(yīng)體系中即可。以上25ul反應(yīng)體系包括以下組分
Taqman Master mix12. 5M-I
上游引物ιμ
下游引物ιμ
熒光探針0. 5 μι
水 ομ 。Taqman Master mix 采用的是 ABI 公司生產(chǎn)的 Taqman Master mix。(4)定量 PCR 檢測。根據(jù)上述PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對產(chǎn)物進行擴增并檢測，所述PCR 反應(yīng)條件為95°C預變性10min，l個循環(huán)；95°C變性15s，59°C退火60s，45個循環(huán)。本實施例中采用的是ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀器。對本實施例的方法數(shù)據(jù)連續(xù)重復做13個平行樣品，對該13個樣品進行了檢測，其檢測數(shù)據(jù)如表1。 表權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，主要包括以下步驟(1)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，Construct603-F: 5，-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3’下游引物序列，Construct603-R: 5，-ACAGGATCCACTCAAACACTAGAG-3， 熒光探針序列，Construct603-P: 5，-FAM-AGTGTGTCGCGTGGTACCAAGCTTGA-TAMRA-3’ ；(2)制備NK603品系的DNA稀釋液；(3)配制PCR反應(yīng)體系；(4)定量PCR檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于步驟(1)所述合成的引物及熒光探針的濃度都為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA 稀釋液的濃度為50ngAa。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到25μ1反應(yīng)體系中， 所述25μ1的反應(yīng)體系包括以下組分Taqman Master mix12. 5M-I上游引物ιμ 下游引物ιμ 熒光探針0. 5 μι水IOul。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的轉(zhuǎn)基因玉米ΝΚ603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為95°C預變性lOmin，1個循環(huán)；95°C變性15s，59°C退火60s， 45個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉(zhuǎn)基因玉米NK603結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準檢測方法。本發(fā)明采用設(shè)計的特異性上游引物Construct603-F、下游引物Construct603-R、熒光探針Construct603-P、與NK603品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix和水配制成PCR反應(yīng)體系；進行定量PCR檢測。本發(fā)明主要建立了一種高擴增效率、高準確度的Taqman定量PCR檢測技術(shù)，適用于國內(nèi)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品監(jiān)督檢驗、進出境口岸轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢驗、企業(yè)內(nèi)部進口原材料含轉(zhuǎn)基因NK603品系生物成分檢測。
文檔編號G01N21/64GK102409092SQ20111036362
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉勇, 劉文娟, 宋君, 尹全, 常麗娟, 張富麗, 王東 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心