專利名稱：用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)基因的修飾型信使rna穩(wěn)定化序列的制作方法
用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)基因的修飾型信使RNA穩(wěn)定化序列 涉M列表
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背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的方法。本發(fā) 明還涉及分離的修飾型mRNA力。工/穩(wěn)定化序列(modified mRNA processing/stabilizing sequence),還涉及核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞,其包 含與用于表達(dá)多核苦酸序列的啟動(dòng)子區(qū)可操作地連接的所述修飾型mRNA 加工/穩(wěn)定化序列，所述多核苷酸序列編碼具有生物學(xué)活性的多肽序列。
相關(guān)技術(shù)描述
具有生物學(xué)活性的天然或異源多肽在細(xì)菌宿主細(xì)胞，特別是芽孢桿菌屬 CBad/Zw力細(xì)胞中的重組生產(chǎn)可為以適合商用的量(commercially relevant quantities)生產(chǎn)物質(zhì)提供一種更理想的手段(vehicle)。
具有生物學(xué)活性的天然或異源多肽的重組生產(chǎn)通過構(gòu)建表達(dá)盒 (expression cassette)來完成，在所述表達(dá)盒中將編碼所述多肽的DNA置于啟 動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控之下，所述啟動(dòng)子是>^人受調(diào)節(jié)的基因切下的，適合用于所述 宿主細(xì)胞。將表達(dá)盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通常通過質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行。然后多 肽的產(chǎn)生通過在表達(dá)盒中所含啟動(dòng)子正確發(fā)揮功能所必需的誘導(dǎo)條件下培 養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。
翻譯起始頻率、密碼子選擇和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是影響細(xì)菌中mRNA穩(wěn)定 性的因素(Rignier和Arraiano, 2000,歷oawap 22: 235-244; Steege, 2000,7 iV」6: 1079-1090)。在枯草芽孢桿菌CBacz7/w wto'fc)中，mRNA穩(wěn)定性受到在5'-非翻譯區(qū)處核糖體停頓(stalling)的影響。例如，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌堿性蛋白 酶基因("/^￡)的穩(wěn)定性由于基因前導(dǎo)區(qū)中存在核糖體結(jié)合位點(diǎn) (Shine-Dalgarno序列)而在枯草芽孢桿菌中具有大約25分鐘的長(zhǎng)半衰期 (Hambraeus等，2002， MfcraWo/ogy 148: 1795-1803)。在16S核糖體RNA的 3'-OH端的Shine-Dalgarno序列的互補(bǔ)性決定了核糖體亞單位和mRNA之間 的親和力。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了核糖體亞單位固定于5'-UTR是枯草芽孢桿菌中mRNA 穩(wěn)定性的誘導(dǎo)者(Sharp和Bechhofer, 2003, /丑a"enb/ogy 173: 4952-4958)。 已經(jīng)4是出4皮稱作穩(wěn)定子序歹'J (stabilizer sequence)的Shine-Dalgamo才羊序列在 5'-UTR中的存在是引起針對(duì)基因的高mRNA穩(wěn)定性的原因之一 (Agaisse和Lereclus, 1996, i^fo/. MifcraWo/. 20: 633-643)。美國(guó)專利Nos. 6，255，076和5,955,310描述了使用c^y/tt4 mRNA穩(wěn)定子序列用于改進(jìn)酶在芽 孢桿菌屬細(xì)胞中的表達(dá)的用途。Daguer等，2005， Zw M&ra&o/ogv 41: 221-226描述了增加轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性可改進(jìn)枯草芽孢 桿菌中的果聚糖蔗糖酶產(chǎn)生。
在本領(lǐng)域中提供新方法用于轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定化以改進(jìn)細(xì)菌宿主菌林表達(dá)的多 肽的水平將是有利的。
本發(fā)明涉及改進(jìn)的在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的方法，包括 (a)在有益于產(chǎn)生所述具有生物學(xué)活性的多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞， 其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子區(qū)，該啟 動(dòng)子區(qū)與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苦S臾序列和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下 游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核香酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS) 上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可操作地連接，其中所述修飾型mRNA 加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸 序列的更高的表達(dá)；和(b)從培養(yǎng)基分離所述具有生物學(xué)活性的多肽。
本發(fā)明還涉及包含核酸構(gòu)建體的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含啟 動(dòng)子區(qū)，該啟動(dòng)子區(qū)與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核普酸序列和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苦酸序列核糖體
結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可操作地連接，其中所述修 飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使 所述多核苷酸序列的更高的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及獲得細(xì)菌宿主細(xì)胞的方法，包括向細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)入核酸構(gòu)建 體，所述核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子區(qū)，該啟動(dòng)子區(qū)與編碼具有生物學(xué)活性的多 肽的多核苷酸序列和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的 多肽的多核香S1^列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列 可操作地連接，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA 加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其包含啟動(dòng)子區(qū)，該啟動(dòng)子區(qū)與編碼具有生 物學(xué)活性的多肽的多核香酸序列和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有 生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加 工/穩(wěn)定化序列可操作地連接，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未 修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生細(xì)菌宿主細(xì)胞不含選擇標(biāo)記的突變體的方法，包 括缺失細(xì)菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因，其中所述細(xì)菌細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體， 該核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子區(qū)，該啟動(dòng)子與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核 苷酸序列和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多 核芬酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可操作地 連接，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn) 定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表達(dá)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示未加工的mRNA的示意圖，和與所表達(dá)的基因相關(guān)的各種修 飾型mRNA加工/穩(wěn)定化Shine-Dalgarno (S-D)序列、所述基因的內(nèi)源核糖體 結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和轉(zhuǎn)錄終止子序列的位置(莖-環(huán))。"野生型"表示未修飾的 mRNA加工/穩(wěn)定化序列。"修飾型l"是實(shí)施例5中描述的mRNA加工/穩(wěn)定 化序列的修飾形式。"修飾型2、 3和4"是多種不同的修飾型mRNA加工/穩(wěn) 定化序列。"修飾型2"含有一個(gè)額外的Shine-Dalgamo序列，其類似于"修飾型1",只是所述額外的Shine-Dalgamo序列在不同的位置。"修飾型3和4" 含有額外的位于不同位置的Shine-Dalgamo序列。所有額外的Shine-Dalgarno 序列都位于基因的內(nèi)源RBS和未加工的mRNA的5'端之間。
圖2顯示pGME079的限制圖。
圖3顯示pNBT48的限制圖。
圖4顯示pNBT55的限制圖。
圖5顯示pNBT56的限制圖。
圖6顯示從枯草芽孢桿菌菌抹BW198 (P,e/c7//" stab/a/^//表達(dá)盒) 和BW199 (Pa，e/mod. cr_y//" stab/a; r/f表達(dá)盒)獲得的搖瓶中的相對(duì)克勞氏 芽孢桿菌(Sacz7/w c/awWz')石威性蛋白酶(AprH)活性。
圖7顯示pGME085的限制圖。
圖8顯示pGME080的限制圖。
圖9顯示從枯草芽孢桿菌菌抹GME200 (野生型P^/^/c^//" stab/ pr// 表達(dá)盒)、GME201 (P **co;////f/co^7" stab/qpr/f表達(dá)盒)、GME202 (P^〃/乂mod. ct少/ZL4 stab/fl/ r7/表達(dá)盒)和GME203 (P共有^肌/mod. c^y//L4 stab/ap"i/表達(dá)盒) 獲得的搖瓶中的相對(duì)克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(AprH)活性。
圖10顯示pMDT131的限制圖。
圖11顯示pMDT159的限制圖。
圖12顯示pMDT160的限制圖。
圖13顯示pHyGe203的限制圖。
圖14顯示pHyGe205的限制圖。
圖15顯示pHyGe201的限制圖。
圖16顯示pHyGe206的限制圖。
圖17顯示三聯(lián)啟動(dòng)子(triple tandem promoter)變體對(duì)地衣芽孢桿菌菌抹 HyGe210和HyGe211中克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(AprH)生產(chǎn)的作用。 圖18顯示pKK223-3的限制圖。 圖19顯示pNBT51的限制圖。 圖20顯示pNBT52的限制圖。 圖21顯示pNBT53的限制圖。 圖22顯示pNBT54的限制圖。 圖23顯示pNBT35的限制圖。圖24顯示pNBT30的限制圖。 圖25顯示pNBT31的限制圖。 圖26顯示pNBT36的限制圖。 圖27顯示pMDT100的限制圖。 圖28顯示pMDT174的限制圖。
圖29顯示枯草芽孢桿菌菌抹MDT134和MDT135的相對(duì)蛋白酶活性。 定義
信使RNA (mRNA)加工/穩(wěn)定化序列術(shù)語(yǔ)"mRNA加工/穩(wěn)定化序列"在 本文定義為這樣的序列,其位于啟動(dòng)子區(qū)下游和編碼具有生物學(xué)活性的多肽 的多核苦酸的翻譯起始位點(diǎn)(即，核糖體結(jié)合位點(diǎn)；RBS)上游，所述啟動(dòng)子 區(qū)與該序列可操作地連接，由此可以使從啟動(dòng)子區(qū)合成的所有mRNA得到 加工以生成在其5'端具有穩(wěn)定子序歹'J(stabilizer s叫uence)的mRNA轉(zhuǎn)錄物。 這種穩(wěn)定子序列在mRNA轉(zhuǎn)錄物的5'端的存在使mRNA轉(zhuǎn)錄物的半衰期增 力口(Agaisse禾口 Lereclus， 1994,見上文，Hue等，1995, Jow77a/o/5ac/en'o/ogy 177: 3465-3471)。所述mRNA加工/穩(wěn)定化序列與細(xì)菌16S核糖體RNA的3' 最末端互補(bǔ)。在優(yōu)選的方面，所述mRNA加工/穩(wěn)定化序列生成基本上單一 大小的轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物在其5'端具有穩(wěn)定化序列。mRNA加工/穩(wěn)定化 序列優(yōu)選與細(xì)菌16S核糖體RNA的3'最末端互補(bǔ)。參見，例如，美國(guó)專利 Nos. 6,255,076和5,955,310。
Shine-Dalgarno序列術(shù)語(yǔ)"Shine-Dalgarno序列"在本文定義為在信使 RNA分子中核糖體將與之結(jié)合的核苷酸序列。這樣的序列與細(xì)菌16S核糖 體RNA的3'端互補(bǔ)。
在優(yōu)選的方面，Shine-Dalgamo序列包含序列GGAG。在另 一優(yōu)選的方 面，Shine-Dalgamo序列包含序列GGAGG 。在另 一 優(yōu)選的方面， Shine-Dalgamo序列包含序列AGAAAGGAGG (SEQ ID NO: 1)。在另 一優(yōu)選 的方面，Shine-Dalgamo序列包含序列AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAC C (SEQ ID NO: 2)。在另一優(yōu)選的方面，Shine-Dalgarno序列包含序列
未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列術(shù)語(yǔ)"未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化 序列，，在本文定義為包含mRNA加工/穩(wěn)定化序列的野生型多核苷酸。修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列術(shù)語(yǔ)"修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列" 在本文定義為經(jīng)過重組修飾而包含至少一個(gè)額外的Shine-Dalgarno序列拷貝 的mRNA穩(wěn)定化序列，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的 mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使多核苷酸序列的更高的表達(dá)。
啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"在本文定義為這樣的DNA序列，其結(jié)合RNA聚 合酶并指導(dǎo)該聚合酶到達(dá)多核苷酸的正確下游轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以起始轉(zhuǎn)錄，所 述多核苷酸編碼具有生物學(xué)活性的多肽。RNA聚合酶有效地催化與編碼區(qū) 的適當(dāng)DNA鏈互補(bǔ)的信使RNA裝配。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"還應(yīng)理解為包括用于在 轉(zhuǎn)錄成mRNA之后的翻譯的5'非編碼區(qū)(啟動(dòng)子和翻譯起點(diǎn)之間)，順式作用 轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如增強(qiáng)子，和/或其它能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的核苷酸序 列。啟動(dòng)子可以是野生型啟動(dòng)子、變體啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子體或共有啟動(dòng)子 (consensus promoter)。
啟動(dòng)子區(qū)術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子區(qū)"在本文定義為包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))啟動(dòng)子 序列的核普酸序列，例如串耳關(guān)三啟動(dòng)子(tandem triple promoter)。
啟動(dòng)子變體術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子變體"在本文定義為這樣的啟動(dòng)子，其具有的 核苷酸序列包含對(duì)親本啟動(dòng)子的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的取代、缺失和/ 或插入，其中所述突變啟動(dòng)子比相應(yīng)的親本啟動(dòng)子具有更高或更^f氐的啟動(dòng)子 活性。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子變體"還將包括天然變體和使用本領(lǐng)域^^知的方法獲得的 體外生成的變體，所述方法如經(jīng)典誘變、定點(diǎn)誘變和DNA改組。
串聯(lián)啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)"串聯(lián)啟動(dòng)子"在本文定義為兩個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子序 列，其中每一個(gè)都和編碼序列可操作地連接并且介導(dǎo)所述編碼序列轉(zhuǎn)錄成 mRNA。
雜合啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)"雜合啟動(dòng)子"在本文定義為兩個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子的部 分，其融合在一起生成的序列是所述兩個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子的融合體，當(dāng)與編 碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸編碼序列可操作地連接時(shí)，其介導(dǎo)該編 碼區(qū)轉(zhuǎn)錄成mRNA。
分離的多肽術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"如用于本文是指從某個(gè)來源分離的多 肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少 10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至 更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純，如通過SDS-PAGE測(cè)定的。
基本上純的多肽術(shù)語(yǔ)"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計(jì)含有至多10%,優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6°/。，更優(yōu)選 至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至 多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然或重組結(jié)合的(natively or recombinantlyassociated)其它多肽材料。因此，優(yōu)選的是所述基本上純的多肽 是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純， 更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97% 純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99°/。純，最優(yōu)選至少99.5%純，并 且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽 制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。這可以 通過，例如，用公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。
分離的多核苷酸術(shù)語(yǔ)"分離的多核苷酸，，用于本文是指從某個(gè)來源分離的 多核苷酸。在優(yōu)選的方面，多核苷酸為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至 少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚 至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純，如通過瓊脂糖電泳測(cè)定的。
基本上純的多核苷酸術(shù)語(yǔ)"基本上純的多核苷酸"用于本文是指不含其 它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處 于適合于在遺傳工程化蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多 核苷酸按重量計(jì)含有至多10%，優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多 5%,更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多 1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。 然而，基本上純的多核香酸可以包括天然存在的5，和3，非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子 和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92% 純，更優(yōu)選至少94°/。純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至 少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少 99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多核苷酸 制備物基本上不含(essentially free of)與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材 料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、 RNA、半合成、合成來源的，或 它們的^f壬何組合。
核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"如用于本文是指單鏈或雙鏈的核酸分 子，其從天然存在的基因分離，或其經(jīng)過修飾從而以本不存在于自然界的方 式含有核酸的區(qū)段(segment),或其是合成的。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)"表達(dá)盒"同義。
調(diào)控序列術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核 苷酸的表達(dá)是必需的所有成分。每個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷^ 列可以是天然的或外源的，或?qū)τ诒舜丝梢允翘烊坏幕蛲庠吹?。這些調(diào)控序 列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào) 肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況下，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻 譯的停止信號(hào)。調(diào)控序列可以與接頭一起提供，所述接頭的目的是引入特異 性限制位點(diǎn)，促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)連接。
可操作地連接術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào) 控序列置于相對(duì)于多核香酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo) 多肽的編碼序列的表達(dá)。
編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物 的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，所述 開放閱讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和 TTG開始，并以終止密碼子例如TAA、 TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是 DNA、 cDNA、合成或重組核苷酸序列。
表達(dá)術(shù)語(yǔ)"表達(dá)，，包括多肽的產(chǎn)生所涉及的任何步驟，其包括但不限于 轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子， 其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的 額外核苦酸可操作地連接。
宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括任何對(duì)于使用核酸構(gòu) 建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等易感的(susceptible)細(xì)胞類型。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的方法，包 括(a)在有益于產(chǎn)生所述具有生物學(xué)活性的多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì) 胞，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子區(qū)， 該啟動(dòng)子區(qū)與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列和位于所述啟動(dòng) 子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體結(jié)合位 點(diǎn)(RBS)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可操作地連接，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所 述多核苷酸序列的更高的表達(dá)；和(b)從培養(yǎng)基分離具有生物學(xué)活性的多肽。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，為了獲得飽和水平的mRNA而需要向宿主染 色體中導(dǎo)入的表達(dá)盒拷貝較少，由此顯著縮短構(gòu)建生產(chǎn)菌抹所需的時(shí)間長(zhǎng) 度。同樣，本發(fā)明允許在當(dāng)前技術(shù)不足以生成飽和水平的mRNA的情況下 有更高水平的基因表達(dá)。
在優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工 /穩(wěn)定化序列相比促使多核苷^列的表達(dá)高出至少15%,優(yōu)選至少25%, 更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少100%,更優(yōu)選至少150%, 更優(yōu)選至少200%，更優(yōu)選至少250%,甚至更優(yōu)選至少300%,最優(yōu)選至少 400%,并且甚至最優(yōu)選至少500%。
信使RNA (mRNA)加工/穩(wěn)定化序列
本發(fā)明還涉及修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列。任何mRNA加工/穩(wěn)定 化序列可以用作親本來構(gòu)建本發(fā)明的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
本發(fā)明的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含至少一個(gè)額外的 Shine-Dalgamo序列，該序列為其所連接的mRNA提供增強(qiáng)的保護(hù)，由此， 與利用野生型mRNA穩(wěn)定化序列的構(gòu)建體相比產(chǎn)生更高水平的基因表達(dá)。所 述至少 一個(gè)額外的Shine-Dalgarno序列可以是與所述mRNA加工/穩(wěn)定化序列 天然結(jié)合的或所述mRNA加工/穩(wěn)定化序列固有的Shine-Dalgarno序列的副本 (duplicate),或者可以獲得自不同的mJRNA加工/穩(wěn)定化序列。圖1顯示的是 未加工mRNA的示意圖，和與表達(dá)的基因相關(guān)的各種修飾型mRNA加工/穩(wěn) 定化序列、內(nèi)源核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和轉(zhuǎn)錄終止子序列的位置(莖-環(huán))。
在優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含至少兩個(gè) Shine-Dalgarno序列。在另 一優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包 含至少三個(gè)Shine-Dalgamo序列。在另 一優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/ 穩(wěn)定化序列包含至少四個(gè)Shine-Dalgarno序列。在另一優(yōu)選的方面，修飾型 mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含至少五個(gè)Shine-Dalgarno序列。
在另 一 優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含的 Shine-Dalgarno 序歹U (a Shine-Dalgarno sequence comprising the modified mRNA processing/stabilizing sequence)至少為4 bp。在另 一優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至少為5 bp。在另一 優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含的Shine-Dalgarno序列至 少為10 bp。在另一優(yōu)選的方面，》務(wù)飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含的 Shine-Dalgamo序列至少為15 bp。在另 一優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/ 穩(wěn)定化序列包含的Shine-Dalgamo序列至少為20 bp。在另一優(yōu)選的方面， 修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含的Shine-Dalgamo序列至少為25 bp。在 另 一優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列包含的Shine-Dalgamo序 列至少為30bp。
修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列的構(gòu)建可以(l)通過除已經(jīng)存在的 Shine-Delgamo/mRNA穩(wěn)定化序列之外，將一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))Shine-Delgarno 序列置于感興趣的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和基因的RBS之間，或(2)通過將兩 個(gè)或更多個(gè)(幾個(gè))Shine-Delgarno序列置于感興趣的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和 基因的RBS之間，其中所述基因除了原有的RBS之外先前不含 Shine-Delgamo/mRNA穩(wěn)定化序列。修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可以從 不同于所述基因的Shine-Delgarno序列構(gòu)建。修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序 列的每個(gè)Shine-Delgarno序列可以是相同的序列或一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))不同序 列的組合。例如，如本文所述，將額外的Shine-Delgarno序列置于已經(jīng)存在 的Shine-Delgarno/mRNA穩(wěn)定化序列和RBS之間。由于RBS本身通常也是 Shine-Delgarno序列，因此在未加工的mRNA上存在最少三個(gè)Shine-Delgarno 序列。前兩個(gè)(從5，端起)賦予mRNA穩(wěn)定性，而第三個(gè)(RBS)指導(dǎo)mRNA的 翻譯。
在優(yōu)選的方面，親本mRNA加工/穩(wěn)定化序列是WO 94/25612和Agaisse 和Lereclus， 1994, Mo/ecw/w M/cra6/o/ogv 13: 97-107中公開的蘇云金芽孢桿 菌CSac/〃w Aw/"g/m^) C7//" mRNA力口工/穩(wěn)定化序歹寸，或其保留著mRNA 加工/穩(wěn)定化功能的部分。
在另一優(yōu)選的方面，親本mRNA加工/穩(wěn)定化序列是Hue等，1995,見 上文中公開的枯草芽孢桿菌SP82 mRNA加工/穩(wěn)定化序列，或其保留著 mRNA加工/穩(wěn)定化功能的部分。
在更優(yōu)選的方面，co/i/L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列是SEQ ID NO: 4,或 保留著SEQ ID NO: 4的mRNA穩(wěn)定化功能的SEQ ID NO: 4的一部分。
在另 一更優(yōu)選的方面，SP82 mRNA加工/穩(wěn)定化序列是SEQ ID NO: 5 ，或保留著SEQ ID NO: 5的mRNA穩(wěn)定化功能的SEQ ID NO: 5的一部分。
在優(yōu)選的方面，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列是SEQIDNO:6，或保 留著SEQ ID NO: 6的mRNA穩(wěn)定化功能的SEQ ID NO: 6的一部分。
修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列優(yōu)選位于啟動(dòng)子區(qū)的下游和基因的核糖 體結(jié)合位點(diǎn)的上游。然而，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可以位于啟動(dòng)子 區(qū)包含的"f壬"f可啟動(dòng)子的下游(downstream of any promoter comprising the promoter region), 和編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體結(jié)合 位點(diǎn)的上游。另外，修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列可以位于啟動(dòng)子區(qū)包含 的每個(gè)啟動(dòng)子的下游，和編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體 結(jié)合位點(diǎn)的上游。修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列的親本對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)的一 個(gè)或多個(gè)(兒個(gè))啟動(dòng)子可以是外源的。
編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸
由導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞中的多核苷酸編碼的具有生物學(xué)活性的多肽可以 是感興趣的任何多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"在此不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此， 包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。多肽對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是天然的或異源(夕卜源) 的。術(shù)語(yǔ)"異源多肽"在本文定義為多肽，其對(duì)于宿主細(xì)胞不是天然的；天 然多肽，其中進(jìn)行過結(jié)構(gòu)修^飾而改變了天然多肽，例如，天然多肽的蛋白質(zhì) 序列；或天然多肽，由于通過重組DNA技術(shù)對(duì)編碼所述多肽的DNA進(jìn)行 了操作(例如，較強(qiáng)的啟動(dòng)子)而使所述天然多肽的表達(dá)量改變。多肽可以是 任何多肽的工程化變體。
在優(yōu)選的方面，多肽是抗體、抗原、抗孩i生物肽、酶、生長(zhǎng)因子、激素、 免疫調(diào)節(jié)劑(immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報(bào)告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄 因子。
在更優(yōu)選的方面，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu) 酶或連接酶。在最優(yōu)選的方面，多肽是乙酰木聚糖酯酶(acetylxylanesterase)、 a-葡糖香酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解 酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、 內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀 粉酶、葡糖腦苷脂酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、變構(gòu)酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、
尿激酶或木聚糖酶。
在另一優(yōu)選的方面，多肽是清蛋白、M^、、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。 在另一優(yōu)選的方面，多肽是雜合多肽，其包含從至少兩種不同多肽獲得
的部分或完整多肽序列的組合，其中的一種或多種(幾種)對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞
可以是異源的。
在另一優(yōu)選的方面，多肽是融合的多肽，其中將另一多肽融合在所述多 肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通過將編碼一種多肽的核苷 酸序列(或其部分)與編碼另 一多肽的核苷酸序列(或其片段)融合來產(chǎn)生的。 用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括，連接編碼多肽的編碼 序列從而使它們符合閱讀框并且使所述融合的多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和 終止子的調(diào)控下。
編碼感興趣的多肽的多核苷酸可以獲得自任何原核、真核或其它來源。 就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)"獲得自"用于本文中與具體的微生物來源有關(guān)，意思應(yīng) 該是多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中已插入來自該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。
用于分離或克隆編碼感興趣多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且
包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或它們的組合。從這種基因組DNA 克隆感興趣的多核苷酸可以例如通過使用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來實(shí) 王見。參見，例3口，Innis等,1990,尸C7 尸ratocofc:」GW<ie to Afef/zo(is ^/^//cario": Academic Press, New York。克隆步驟可以牽涉切下和分離包含編碼多肽的多核 苦酸的核酸片段，將所述片段插入載體分子，和將重組載體并入細(xì)菌宿主細(xì)胞， 在該細(xì)菌宿主細(xì)胞中將復(fù)制所述多核苷酸的多個(gè)拷貝或克隆。DNA可以M 因組、cDNA、 RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。
可以用許多方式操作編碼感興趣的多肽的多核苷酸以提供多核苷酸在 合適細(xì)菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)。為編碼感興趣的多肽的多核苷酸構(gòu)建核酸構(gòu)建 體和重組表達(dá)載體可以如本文關(guān)于表達(dá)具有生物學(xué)活性的多肽所描述的來 進(jìn)行。
核酸構(gòu)建體
本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核 苦酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)，和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核香酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)上游的修飾型 mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
構(gòu)建包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可操作地連接 的啟動(dòng)子區(qū)和本發(fā)明的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列(其位于啟動(dòng)子區(qū)的下 游和多核苷酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)的上游)的核酸構(gòu)建體可以如下完成通 過使用本領(lǐng)域公知的方法修飾所述多核苷酸序列，以將啟動(dòng)子區(qū)和修飾型 mRNA加工/穩(wěn)定化序列，以及其它調(diào)控序列，與所述多核芬酸可操作地連 接，將所述構(gòu)建體插入載體，再將所述載體通過同源重組導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的染 色體或作為染色體外自主復(fù)制元件(例如，質(zhì)粒)導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。
每個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可以是 天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、啟動(dòng)子區(qū)、信 號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況下，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子區(qū)，以及轉(zhuǎn)錄和 翻譯的停止信號(hào)。調(diào)控序列可以與接頭一起提供，所述接頭的目的是引入特 異性限制位點(diǎn)，促進(jìn)調(diào)控序列與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核香臥^列 編碼區(qū)連接。
啟動(dòng)子區(qū)。啟動(dòng)子區(qū)可以包含單個(gè)啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子的組合。在啟動(dòng) 子區(qū)包含多個(gè)啟動(dòng)子的組合的情況下，多個(gè)啟動(dòng)子優(yōu)選是前后串聯(lián)的(in tandem)。啟動(dòng)子區(qū)的啟動(dòng)子可以是能夠在感興趣的細(xì)菌宿主細(xì)胞中起始編碼 具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的任何啟動(dòng)子。啟動(dòng)子對(duì)于編碼具有 生物學(xué)活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的、或它們的組合。這 樣的啟動(dòng)子可以從指導(dǎo)具有生物學(xué)活性的胞外或胞內(nèi)多肽(對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì) 胞是同源的或異源的)合成的基因獲得。
在優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含/人細(xì)菌來源獲得的啟動(dòng)子。在更優(yōu)選的方 面，啟動(dòng)子區(qū)包含從革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌獲得的啟動(dòng)子。在另一更優(yōu)選的方面， 啟動(dòng)子區(qū)包含從革蘭氏陰性細(xì)菌獲得的啟動(dòng)子。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括，但不 限于，芽孢桿菌屬CSac/〃ws)、 鏈球菌屬(&reptococcw力、鏈霉菌屬 OSfre/ tom;vces)、 葡萄球菌屬(&qp/i;y/ococciw)、腸球菌屬(五wto-ococcus)、 乳桿 菌屬(丄(3cto6ac/〃w)、乳J求菌屬(丄ac ococcw》、才炎菌屬(C7oWn-fl^m)、 土芽孑包4干 菌屬(Geo6ac/〃w力和海洋芽孢桿菌屬(Ocea"okzc/〃us)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括， 但不P艮于，大腸桿菌、假單胞菌屬(尸化wcfowowos)、沙門氏菌屬(5b/wo"e〃a)、 彎曲桿菌屬(Cam;7少/oZ^"er)、 螺桿菌屬(i/e//co6a"er)、 黃桿菌屬CF/(3vc>6ac/en.i/m)、才炎4干菌屬(尸wsoZ^c/er/w/w)、；尼4干菌屬(7/少o6a"e/")、 奈瑟氏 ^求菌屬(iVe/Men'a)和尿4支原體屬(t/reqp/mwa)。
在最優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含從以下菌抹獲得的啟動(dòng)子芽孢桿菌屬 菌才朱，例如,5ac/〃ws agara(i/^rem1、嗜;威芽孑包4干菌(5ac/〃ws a/fejf/c;p/zz7^s")、解 淀粉芽孑包軒菌C6flc,〃ws am;;/o/一ey^cz'ms)、短芽孑包軒菌(Bac/〃w51 6rev")、環(huán)狀 芽孢桿菌C8flc///^ c/rcw/ara)、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌(5ac/〃w coflgM/a"s)、 堅(jiān)強(qiáng)芽孑包軒菌C6a"7,us，mus)、 杣爛芽抱桿菌(5flc"/m: /om加)、 遲纟爰芽孑包4干菌(Aac〃/ws /ewftw) 、 i也衣芽孑包4干菌(5"c/〃uy //c/zem》/7m'力、巨大芽 孢桿菌(5ac〃/iw wegafen'w/w)、短小芽孢桿菌(8a"7/z^ /7w脂7m)、嗜熱月旨肪芽 孢桿菌(萬(wàn)ac///^ >sfeara//zerwo/ /2//w1s)、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌 (5czc/〃ws決wn'"g^m^); 或4連霉菌屬菌4朱，寸列^口^i青f，鏈霉菌OS!^e/ towycey //v油/m)或鼠灰鏈霧菌(浙，owyces wwr/"—。
用于在本發(fā)明的方法中指導(dǎo)編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn) 錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán) 色鏈霉菌(&r印tom^&s coe/Zco/or)瓊脂糖酶基因(^g^)、遲緩芽孢桿菌或克勞 氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(^^//)、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白 酶Carlsberg基因(subtilisin Carlsberg gene))、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因 O"cS)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amj^)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因 (am_y￡)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(am少M(fèi))、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(flmy0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pew巧、枯草芽孢桿菌；qyM 和x_y/B基因、蘇云金芽孢桿菌擬步行甲亞種CBacz7/w決wn7 gz'e"^s subsp. te朋6n'om'力CryIIIA基因(c^y//")或其部分，原核(3-內(nèi)酰胺酶基因 (Villa-Kamaroff等，1978,尸racee^V^ o/f/ze iVa"o加/
75:3727-3731)，和巨大芽孢桿菌基因(Rygus和Hillen， 1992, / Bacfen'o/. 174:3049-3055; Kim等，1996， (7e"e 181: 71-76)，以及toc啟動(dòng)子(DeBoer 等,1983,尸raceWwgs o/Ato/owa/爿c^em;; o/5Wewc^ 80:21 -25)，質(zhì) 粒pUB U 0的啟動(dòng)子(Tortosa等，2000， Mo/. M/cra6/o/. 35:1110-1119)， 和spac啟動(dòng)子(Henner， 1990, MeAocfe五"2^wo/. 185: 223-228)。其它實(shí)例是 spo7謹(jǐn)菌體啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子的啟動(dòng)子(DeBoer等，1983,尸race^/wgs o/f/^ A^"owa/^c^/em_y 。/5Wewces WSv4 80:21-25)。另夕卜的啟動(dòng)子在"Useflil proteins from recombinant bacteria"于 5"cz'e打hy c 4wten.ca打，1980, 242:74-94; 及Sambrook, Fritsch和Maniatus， 1989， Mo/ecw/ar C7ow/"g， Z^orato^ Mwwa/, 第2版，Cold Spring Harbor, New York中描述。
在另一優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含的啟動(dòng)子是"共有，，啟動(dòng)子，其具有 "-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的TATAAT。共有啟動(dòng)子可以從能夠在細(xì) 菌宿主細(xì)胞例如芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何啟動(dòng)子獲得?？梢允?用本領(lǐng)域公知的方法通過定點(diǎn)誘變完成"共有"啟動(dòng)子的構(gòu)建以創(chuàng)造啟動(dòng)子， 該啟動(dòng)子更加完美地符合枯草芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)型(vegetative)"cj A型"啟動(dòng)子 "-10"和"-35"區(qū)的已確定的共有序歹寸(Voskuil等，1995, Mo/ecw/w MfcraZ)Zo/og); 17: 271-279)。
在另一優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子包含"共有"啟動(dòng)子，該"共有"啟動(dòng)子獲得自 從以下獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因 (&g^)、克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(a/^//)、地衣芽孢 桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖 酶基因0acB)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am少5)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶 基因(amyZ0、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(a;^M)、解淀粉芽孢桿菌 a-淀粉酶基因(am;^)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pmP)、枯草芽孢桿菌 和"/S基因、蘇云金芽孢桿菌擬步行曱亞種(3^111八基因(67^//")或其部分， 或原核P-內(nèi)酰胺酶基因^po/細(xì)菌的噬菌體啟動(dòng)子。
在更優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含獲得自解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因 (am少g)的"共有"啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含的啟動(dòng)子是雜合啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含的啟動(dòng)子是變體啟動(dòng)子。參見，例如， WO 05/098016,美國(guó)專利No. 5,698,415和美國(guó)專利No. 6,100,063。在優(yōu)選
的方面，變體啟動(dòng)子是P肌yl^99,其中P:啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選的方面，啟動(dòng)子區(qū)包含的啟動(dòng)子是串聯(lián)啟動(dòng)子。參見，例如，
WO 99/043835和WO 05/098016。在優(yōu)選的方面，串聯(lián)啟動(dòng)子是P共有鵬w P^/,『cO^" mRNA加工/穩(wěn)定化序列。在另一優(yōu)選的方面，串聯(lián)啟動(dòng)子是 P。,一4i9r P共有。，e-Pco^4-co^" mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
在本發(fā)明的方法中，雜合啟動(dòng)子或串聯(lián)啟動(dòng)子將被理解為對(duì)于編碼具有 生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列是外源的，即使野生型啟動(dòng)子對(duì)于所述多 核苷酸序列是天然的。例如，在由至少兩個(gè)啟動(dòng)子組成的串聯(lián)啟動(dòng)子中，其中一個(gè)啟動(dòng)子可以是編碼生物學(xué)物質(zhì)的多核苦酸的野生型啟動(dòng)子。
終止子。調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由細(xì)菌細(xì)胞識(shí) 別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的核苷S^
列3，末端可操作地連接。在所選細(xì)菌宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子均可以 在本發(fā)明中使用。
前導(dǎo)序列。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是mRNA非翻譯區(qū)， 對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞的翻譯是重要的。前導(dǎo)序列與指導(dǎo)具有生物學(xué)活性的多肽合成 的核苷酸序列的5'末端可操作地連接。在所選細(xì)菌宿主細(xì)胞中有功能的任何 前導(dǎo)序列可以用于本發(fā)明中。
信號(hào)肽編碼區(qū)。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基 末端連接的氨基酸序列，其能夠指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。信號(hào) 肽編碼區(qū)對(duì)于多肽可以是天然的或可以得自外源。編碼多肽的多核苷酸編碼 序列的5，端可以固有地(inherently)含有信號(hào)肽編碼區(qū)，其天然地在翻譯閱讀 框之內(nèi)與編碼所分泌多肽的編碼區(qū)片段連接?；蛘?，編碼序列的5'端可以含 有信號(hào)肽編碼區(qū)，其對(duì)于編碼所分泌多肽的編碼序列部分是外源的。當(dāng)編碼 序列天然不含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外源信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘?，外源信 號(hào)肽編碼區(qū)可以簡(jiǎn)單地代替天然信號(hào)肽編碼區(qū)，以獲得相對(duì)于通常與編碼序 列連接的天然信號(hào)肽編碼區(qū)增強(qiáng)的多肽分泌。信號(hào)肽編碼區(qū)可以從例如芽孢 桿菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因獲得。然而，能夠指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所 選細(xì)菌宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)可以在本發(fā)明中使用。
對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，例如芽孢桿菌屬細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是獲得自以下 基因的信號(hào)肽編碼區(qū)來自芽孢桿菌屬NCIB 11837的產(chǎn)麥芽淀粉酶基因、 嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢 桿菌P-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因07^r、 "pnS、 和枯草芽孢桿菌基因。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137描述。
選擇標(biāo)記。核酸構(gòu)建體可以進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇標(biāo)記，其 允許簡(jiǎn)單選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑抗性、對(duì) 重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophy to auxotrophs)等。細(xì)菌選 擇標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的由/基因，或賦予抗生 素抗性的標(biāo)記，例如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素 四環(huán)素抗性。另外，選擇可以通過共轉(zhuǎn)化完成，例如，如WO 91/09129中所述，其中選擇 標(biāo)記在單獨(dú)的載體上。
然后可以使用本領(lǐng)域已知的方法或那些在本文中描述的用于表達(dá)具有 生物學(xué)活性的多肽的方法將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞可 以含有相同核酸構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))拷貝，或至少兩種不同核酸構(gòu)建 體的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))拷貝，其中每種構(gòu)建體都如上文所述構(gòu)建。
表達(dá)栽體
在本發(fā)明的方法中，重組表達(dá)載體可以構(gòu)建成包含與編碼具有生物學(xué)活 性的多肽的多核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)，和本發(fā)明的修飾型 mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其位于啟動(dòng)子區(qū)的下游和編碼具有生物學(xué)活性的 多肽的多核苷i^f列核糖體結(jié)合位點(diǎn)的上游?？梢詫⑸鲜龅亩喾N核酸和調(diào)控 序列結(jié)合在一起，產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可能包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的 限制位點(diǎn)，以允許在這些位點(diǎn)插入或取代多核苷酸。或者，可以通過將多核 苷酸序列或包含該多核苷酸序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中 來表達(dá)編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列。在創(chuàng)建表達(dá)載體的過程 中，將編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷S餅列置于載體中，使得該編碼 序列與啟動(dòng)子區(qū)和修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列，以及任何其它用于表達(dá) 和可能用于易位(translocation)的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連才妄。
重組表達(dá)載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA方法并且在導(dǎo)入細(xì)菌宿 主細(xì)胞時(shí)能夠引起具有生物學(xué)活性的多肽表達(dá)的任何載體。載體的選擇將通 常依賴于載體與將導(dǎo)入該載體的細(xì)菌宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的 或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制的載體，即，作為染色體外實(shí)體存 在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色 體或人工染色體。載體可以含有保證自復(fù)制的任何手段?；蛘?，載體可以是 一種當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到染色體中并且與其所整合的染色體 一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或是兩個(gè)或更多個(gè)的載 體或質(zhì)粒，或是轉(zhuǎn)座子。
"導(dǎo)入，，是指將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞從而使所述載體作為染色體整合 體或作為自復(fù)制的染色體外載體保留。通常認(rèn)為整合是一種優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楦?可能將一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))編碼序列或基因穩(wěn)定地保留在細(xì)胞中。將載體整合入染色體通過同源重組、非同源重組或轉(zhuǎn)座來進(jìn)行。
例如，將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合
等來進(jìn)行。
對(duì)于整合，載體可以依賴于任何載體元件通過同源重組將載體穩(wěn)定整合 入基因組。載體可以含有額外的多核苦酸序列用于指導(dǎo)通過同源重組向細(xì)菌 宿主細(xì)胞基因組中的整合。所述額外的多核香酸序列使得載體能夠整合入細(xì) 菌宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能 性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的與相應(yīng)目標(biāo)序列高度同源的核酸，如
100至10,000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400至10,000個(gè)石咸基對(duì)，并且最優(yōu)選800至 10,000個(gè)堿基對(duì)，以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何多核苷^
列，其與細(xì)菌宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非 編碼或編碼序列。
為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使載體能夠在所述的芽孢桿菌屬細(xì) 胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的
質(zhì)粒pBR322、 pUC19、 pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽 孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、 pE194、 pTA1060和pAMBl的復(fù)制起點(diǎn)。 復(fù)制起點(diǎn)可以具有突變，其使得該復(fù)制起點(diǎn)的功能在細(xì)菌宿主細(xì)胞中是溫度 壽文感的(參見，例^口, Ehrlich, 1978, Praceecf!'wgs o/ f/ze ATafz'owaZ爿cacfemy o/ 6W置&s , 75: 1433)。
用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。
細(xì)菌宿主細(xì)胞
本發(fā)明還涉及細(xì)菌宿主細(xì)胞，其包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多 核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)，和本發(fā)明的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定 化序列，該序列位于啟動(dòng)子區(qū)的下游和編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷 酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)的上游，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與 未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表 達(dá)。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌細(xì)胞不含外源(異源)選擇標(biāo)記基因。
本發(fā)明還涉及獲得細(xì)菌宿主細(xì)胞的方法，包括向細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)入核酸構(gòu)建 體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷S吏序列可操作地連4妻的啟動(dòng)子區(qū)，和本發(fā)明的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定4匕序列，該序列位 于啟動(dòng)子區(qū)的下游和編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苦酸序列核糖體結(jié) 合位點(diǎn)的上游，其中所述》務(wù)飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA 加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表達(dá)。
細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌包括，但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、 腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、土芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。 革蘭氏陰性細(xì)菌包括，但不限于，大腸桿菌、布I單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎 曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏球菌屬和尿 枝原體屬。
在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是<壬何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā) 明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括，但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉 芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、 克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢 桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌(^ac/〃附w^/avera&)、 短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和花域
芽孑包4干菌(5<3C/〃M>S V(3〃&WOW力纟田月包。
在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣 芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌 宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克 勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì) 胞。在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明
的實(shí)踐中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括，但不限于，似馬鏈球菌OSyr印tococcm e《M/57'w//^)、 酉良膿《連王求菌(AS^re/ tococczw /^oge"es)、 吝'L房鏈J求菌(iS reptococciw i/6m'力和馬鏈球菌獸痙亞種(浙取ococcw5 subsp. Zooe/ /ofe附/cw力。
在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方 面中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面中，細(xì)菌宿主細(xì) 胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟 亞種細(xì)月包。
在本發(fā)明的方法中，細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括，但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌(5^epfomyces ac/ ramogewey)、 P余蟲鏈霉菌(及^ptomyces averm"http://^)、 天藍(lán)色鏈霉菌、灰色 鏈霉菌(浙取畫戸s gni潔)和淺青紫鏈霉菌。
在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的 方面中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面中，細(xì)菌宿主 細(xì)胞是天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉 菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞可以額外地含有對(duì)其它基因的修 飾，例如，缺失或破壞(disruption)，所述其它基因可能對(duì)具有生物學(xué)活性的 多肽的生產(chǎn)、回收和/或應(yīng)用有害。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是蛋白^: 陷型細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如，芽孢桿菌屬細(xì)胞，包含 對(duì)qp必和"/ r五的破壞或缺失。在另 一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞不產(chǎn)孢子。 在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如，芽孢桿菌屬細(xì)胞，包含對(duì)s; o/Z4C 的破壞或缺失。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如，芽孢桿菌屬細(xì)胞， 包含對(duì)表面活性肽生物合成中涉及的基因(例如，w/4、 wW、 w/C和w^D) 之一的破壞或缺失。參見，例如，美國(guó)專利No. 5,958,728。對(duì)具有生物學(xué)活 性的多肽的生產(chǎn)、回收和/或應(yīng)用有害的其它基因(例如，基因)也可以 被破壞或缺失。
可以例如通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA導(dǎo)入芽孢桿茵屬細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 (參見，例如，Chang和Cohen， 1979, Mo/ecw/w Ge恥ra/Ge"e"cs 168: 111-115)， 4吏用感受態(tài)纟田月包(參見，例長(zhǎng)口 ， Young牙口 Spizizen, 1961, /owr""/ o/5acten'o/ogy 81: 823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson, 1971, Jowtoj/ Mo/ecw/ar所o/ogy 56:209-221)，電穿孑L(參見，侈'J^口， Shigekawa禾口 Dower， 1988,5/otec/zm々was 6: 742-751 )或接合(參見，例如，Koehler和Thome, 1987， Jowr"a/ o/SacteHo/ogy 169:5271-5278)?？梢岳缤ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞原 生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan, 1983， Mo/.說o/. 166: 557-580)或電穿孔(參 見，例如，Dower等，1988, A^c/e/c爿c/cfei 仏16:6127-6145)。可以例如通過 如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA導(dǎo)入鏈霉菌屬細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例 如，Gong等，2004, M/cra&o/. (Pra/z"」49: 399-405)，接合(參見，例如， Mazodier等，1989, J Bacfen'o/. 171: 3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke 等，2001,尸rac. Jcad 5W. USA 98: 6289-6294)。可以例如通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA導(dǎo)入假單胞菌屬細(xì)胞電穿孔(參見，例如，Choi等，2006， Mz'cra6/。/. MeAo^r 64: 391國(guó)397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets, 2005, ^ p/.
Mz'cra&o/. 71: 51-57)?？梢岳缤ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA導(dǎo)入鏈球 菌屬細(xì)胞天然感受態(tài)(參見，例如，Peny和Kuramitsu， 1981，/"/e". /附m柳.32: 1295-1297),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick, 1991, Mz'cra&o;y. 68: 189-207),電穿孑L(參見，例如，Buckley等，1999， jpp/.五"Wra". M/cro&o/. 65: 3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell, 1981，Mz'cra6/o/.及ev. 45:409-436)。然 而，可以使用任何本領(lǐng)域已知用于將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。
生產(chǎn)
在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于具有生物學(xué)活 性的多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞。例如，可以通過在合適的 培養(yǎng)基中以及允許具有生物學(xué)活性的多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行的、在 實(shí)驗(yàn)室中或工業(yè)發(fā)酵罐中的搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分 批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適 的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商 業(yè)供應(yīng)商獲得，或可以根據(jù)已公開的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心(American Type Culture Collection)的目錄中)制備。如果具有生物學(xué)活性的 多肽分泌至營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么能夠直接從培養(yǎng)基中回收所述多肽。如果具 有生物學(xué)活性的多肽不分泌，那么可以從細(xì)胞裂解物中回收所述多肽。
具有生物學(xué)活性的多肽可以使用本領(lǐng)域已知的、特別用于所述具有生物 學(xué)活性的多肽的方法來檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可以包括使用特異性抗體、高效 液相層析、毛細(xì)管層析、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如， 可以使用酶測(cè)定法來測(cè)定酶的活性。對(duì)于許多酶用于測(cè)定酶活性的步驟是本 領(lǐng)i或已知的(參見，例如，D. Schomburg和M. Salzmann (編)，五"zyme i/aw/6ooA:: Springer-Verlag， New York, 1990)。
得到的具有生物學(xué)活性的多肽可以使用本領(lǐng)域7>知的方法分離。例如， 可以通過常規(guī)步驟，包括但不限于，離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或 沉淀從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離具有生物學(xué)活性的多肽。然后可以通過多種本領(lǐng)域已 知的方法進(jìn)一步純化分離的具有生物學(xué)活性的多肽，所述方法包括，但不限 于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)或提取(參見，例如， 尸wny c(3"o", J,C. Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers, New York, 1989)。
在本發(fā)明的方法中，當(dāng)在相同的生產(chǎn)條件下培養(yǎng)時(shí)，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞 相對(duì)于含有與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可操作地連接的 啟動(dòng)子區(qū)和親本mRNA加工/穩(wěn)定化序列(位于所述啟動(dòng)子區(qū)的下游和編碼具 有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)的上游)的細(xì)菌宿主， 優(yōu)選多產(chǎn)生至少15%,優(yōu)選至少25%,更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少75%, 更優(yōu)選至少100%，更優(yōu)選至少150%，更優(yōu)選至少200%,更優(yōu)選至少250%， 甚至更優(yōu)選至少300%,最優(yōu)選至少400%,并且甚至最優(yōu)選至少500%的具 有生物學(xué)活性的多肽。
缺失/破壞
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細(xì)菌宿主細(xì)胞不含選擇標(biāo)記的突變體的方法，包括將 細(xì)菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因缺失，其中所述細(xì)菌細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該 核酸構(gòu)建體包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可操作地連 接的啟動(dòng)子區(qū)，和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽 的多核香酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序 列，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未<奮飾的mRNA加工/穩(wěn)定 化序列相比促使所述多核苦酸序列的更高的表達(dá)。
其它不理想的基因。在這些方法中，選擇標(biāo)記基因的缺失可以使用質(zhì)粒通過 同源重組來完成，將所述質(zhì)粒構(gòu)建成連續(xù)地含有側(cè)翼為選擇標(biāo)記基因的5' 和3'區(qū)。例如，可以將連續(xù)的5'和3'區(qū)與第二選擇標(biāo)記相關(guān)聯(lián)導(dǎo)入芽孢桿菌 屬細(xì)胞中溫度敏感型質(zhì)粒例如pE194上，在允許的溫度下使質(zhì)粒能夠在細(xì)胞 中逐漸確立(become established)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至非允許溫度以選4奪在染 色體中于同源側(cè)翼區(qū)之一整合了質(zhì)粒的細(xì)胞。質(zhì)粒整合的選擇通過選擇第二 選擇標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)。整合之后，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至允許溫度不進(jìn)行選擇地增殖 幾代來刺激第二同源側(cè)翼區(qū)的重組事件。將細(xì)胞鋪板以獲得單菌落，并檢查 菌落的兩種選擇標(biāo)記的缺失(參見，例如，Perego, 1993,于A丄.Sonneshein, J.A. Hoch和R. Losick編，5acz7/ws jm6"/z^ aw<i (9f/zer GV"aw-尸o^Y/ve 5acfenV2， 第42章，American Society of Microbiology, Washington, D.C， 1993)。選擇標(biāo)記基因還可以如下通過同源重組去除將包含缺陷型基因的5' 和3'區(qū)但是缺乏選擇標(biāo)記基因的核酸片段導(dǎo)入突變細(xì)胞，繼而在反選擇培養(yǎng) 基(counter-selectionmedium)上選擇。通過同源重組，將含有選擇標(biāo)記基因的 缺陷型基因用缺乏選擇標(biāo)記基因的核酸片段代替。也可以使用本領(lǐng)域已知的 其它方法。
也可以使用上述步驟來缺失或破壞不理想的基因。美國(guó)專利No. 5,891,701公開了用于缺失包括s/w/"C、 a; r￡、和aw^五的幾種基因的技術(shù)。
其它不理想的生物學(xué)化合物也可以通過上述方法去除，例如由c少pX(登 錄號(hào)BG12580)和/或"mC(登錄號(hào)BG14121)合成的紅色素。
在優(yōu)選的方面，未用任何外源或異源選擇標(biāo)記對(duì)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn) 行標(biāo)記。在另一優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞不產(chǎn)生由c少/ Jf和yvwC 合成的任何紅色素。
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為對(duì)本發(fā) 明范圍的限制。
實(shí)施例 DNA測(cè)序
DNA觀'J序寸吏用 Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA， USA)用染料終止劑化學(xué)(dye terminator chemistry) (Giesecke等，1992, /owma/ o/Wra/. Me^oA 38: 47-60)進(jìn)行。使用 phred/phrap/consed (University of ^Vashington， Seattle, WA， USA)用序列特異 性引物來組裝序列。
菌抹
在枯草芽孢桿菌168A4中構(gòu)建了芽孢桿菌屬質(zhì)粒?？莶菅挎邨U菌168A4 源自枯草芽孢桿菌典型菌抹168 (BGSC 1A1， Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH， USA)并且在s/ o/"C、 a; r五、和am_y￡基因中具有缺失。 這四個(gè)基因的缺失基本上如針對(duì)枯草芽孢桿菌A164A5所描述的來進(jìn)行，其 在美國(guó)專利No. 5,891,701中詳細(xì)描述。培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基每升由10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g NaCl組成。 LB平板由LB培養(yǎng)基和每升15 gBacto瓊脂組成。 LB氨芐青霉素培養(yǎng)基由LB培養(yǎng)基和每毫升100叫氨芐青霉素組成。 LB氨千青霉素平板由LB氨芐青霉素培養(yǎng)基和每升15 g Bacto瓊脂組成。
VY培養(yǎng)基每升由25 g小牛肉浸出物(veal infosion) (BD Diagnostics,
Franklin Lakes, NJ， USA)和5 g酵母提取物組成。
2XYT培養(yǎng)基每升由16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5gNaCl組成。 2X YT氨千青霉素培養(yǎng)基由2X YT培養(yǎng)基和每毫升100 pg氨芐青霉素組成。
2X YT氨芐青霉素平板每升由2X Y,T氨千青霉素培養(yǎng)基和15 gBacto瓊 脂組成。
TBAB培養(yǎng)基由 Difco Tryptose Blood Agar Base (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)組成。
TBAB氯霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升5 ng氯霉素組成。 TBAB新霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升6 新霉素組成。 TBAB紅霉素/林可霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升1 紅霉素和25 林可霉素組成。
TBAB牛奶培養(yǎng)基由用牛奶覆層覆蓋的TBAB培養(yǎng)基組成，所述覆層由 0.6 ml溶于去離子水的無(wú)菌10%奶粉溶液添加至6 ml融化的TBAB瓊脂組成。
PS-l培養(yǎng)基每升由100g蔗糖、40g大豆粉、3.96g磷酸氫二鈉(無(wú)水)、 5 g CaC03和100 |dl Plu賜ic酸組成。
實(shí)施例1:構(gòu)建共有c/j//Z4啟動(dòng)子
構(gòu)建了 c^y///^啟動(dòng)子的共有形式，其中將天然的-35和-10區(qū)變?yōu)楣灿衋 A依賴性啟動(dòng)子的-35和-10區(qū)。共有co^/" (co^4)啟動(dòng)子是通過退火兩個(gè) 互補(bǔ)的97個(gè)核苷酸的寡聚物999555和999556來構(gòu)建的。
寡聚物999555:
5'-CGGGCCTTAAGGGCCCTCGAAACGTAAGATGAAACCTTAGATAAGG畫3'(SEQ ID NO: 7) 寡聚物999556:
5'隱CCTTAATTAATTATAACATTAATAATTCTTCAATGTCAACAAAAA
CCG-3' (SEQ ID NO: 8)
進(jìn)行兩個(gè)20 |il退火反應(yīng)，其分別含有10 ^ (500 pmol)和5 ^ (250 pmol) 的每種寡聚物。將兩個(gè)反應(yīng)在95。C溫育5分鐘，然后將試管逐漸冷卻至室溫。
和-10啟動(dòng)子區(qū)、5'端的胡I限制位點(diǎn)和3'端的尸"cl位點(diǎn)。
將每個(gè)退火產(chǎn)物通過PCR擴(kuò)增，所述PCR使用2 jal (25或12.5 pmol)
退火產(chǎn)物作為模板連同引物999557和999558，按照制造商的說明書使用
EXPAND High Fidelity PLUS PCR System (EXPAND 高保真PLUS PCR系
統(tǒng))(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)。 引物999557:
5'-CGGGCCTTAAGGGCCCTCGAA-3' (SEQ ID NO: 9) 引物999558:
5'-CCTTAATTAATTATAACATT-3' (SEQ ID NO: 10)
將兩個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(它們是相同的)匯集，通過使用50mMTris堿-50 mM硼酸-l mM EDTA 二鈉(TBE)緩沖液的2.0%瓊脂糖電泳分析，并使用 QIAQUICK Gel Extraction Kit (QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒)(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)純化。
然后使用TOPO TA Cloning Kit (TOPO TA克隆試劑盒)(Invitrogen， Carlsbad, CA, USA)將純化的97 bp PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1中，再按照制造 商的說明書轉(zhuǎn)化入ONE SHOT TOP10化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)。使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA,USA)從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA，再通過用五coRI消化繼 之以在TBE緩沖液中進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳來測(cè)驗(yàn)克隆的PCR片段的存在。 將一個(gè)具有大約3.94 kb和115 bp的￡co RI片段的質(zhì)粒命名為pCR2.1-共有 c^///A通過DNA測(cè)序確認(rèn)了克隆的PCR片^殳的DNA序列。
將質(zhì)粒pCR2.1-共有用斬I和尸ac I消化，并且通過在TBE緩沖 液中進(jìn)行2.0。/o瓊脂糖電泳來分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了含有共有啟動(dòng)子的大約82 bp的片段。將質(zhì)粒pNBT2 (pDG268A-PC[yIIIA/cryIIIAstab/SAV,美國(guó)專利No. 6，255，076)用斬I和尸"c I 消化，并且通過在TBE緩沖液中進(jìn)行2.0%瓊脂糖電泳來分析，再使用 QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了含有共有啟動(dòng)子的大約7162 bp的載體片段。將pNBT2載體片段和共有c^y//"啟動(dòng)子片段用T4 DNA連 接酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的說明 書連接起來，并且將大腸桿菌XL 10-GOLD Ultracompetent (超感受態(tài))細(xì)胞 (Stratagene Corporation, La Jolla, CA, USA)用所述連接物(ligation)按照制造商 的說明書轉(zhuǎn)化。使用BIOROBOT 9600從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA,并 且通過用五coRI和^/H消化繼之以在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行 了測(cè)試。將一個(gè)具有大約5799 bp和1446 hp的預(yù)期片段的質(zhì)粒命名為 pGME079 (圖2)。
將質(zhì)粒pGME079通過用I消化來線性化。將枯草芽孢桿菌168A4 用所述線性化的質(zhì)粒"l安照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961, / Sac^n'o/. 81: 741-746的步驟轉(zhuǎn)化，并且在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉 素抗性。將一個(gè)在am少丄基因座插入了 P共有^瓜乂co^/" stab/a;^/f表達(dá)盒的 轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢桿菌GME201。
實(shí)施例2:構(gòu)建修飾型trj/JX4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列
構(gòu)建了》，飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序歹'J,其除了天然co^/WmRNA加工 /穩(wěn)定化序列還包含第二 Shine-Dalgarno序列。
通過PCR從質(zhì)粒pNBT3 (pDG268ANeo-PCI7lIIA/cryinAstab/SAV,美國(guó)專 利No. 6,255,076)擴(kuò)增了包含c^//L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列的大約524 bp 的片段，所述PCR使用下文所示的引物999255和999254。引物999254的 5'端并入了賓頁(yè)夕卜的Shine-Dalgarno序歹'J的4卜體(complement)。
引物999255:
5'-AGCTTAATTAAAGATAATAT-3' (SEQ ID NO: 11) 引物999254:
5 '-GGCTGGATC ACCTCCTTTCTATCC ATTAGACGGTGC AAAT畫3' (SEQIDNO: 12)
從質(zhì)粒pNBT3使用下文所示的引物999253和999256擴(kuò)增了大約596 bp的片段，該片段包含克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(^r/f)的N-末端編碼 區(qū)。引物999253的5'端并入了額外的Shine-Dalgamo序列并且與引物999254 的5'端互補(bǔ)。
引物999253:
5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTATGAAAAATCATTTTAT C-3'(SEQIDNO: 13) 引物999256:
5'-AAGCTTGCGCCACCACGAAT-3' (SEQ ID NO: 14)
兩個(gè)PCR都使用50 ng質(zhì)粒pNBT3模板DNA,每種？ 1物各0.4 pM, dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各200 ^M,含2.5 mM MgCl2的IX PCR緩沖 液II,以及2.5單位的％《DNA聚合酶在50 |Lil反應(yīng)體積中進(jìn)行。將反應(yīng)在 ROBOCYCLER 40熱循環(huán)儀(Stratagene Corporation, Lo Jolla, CA， USA)中 進(jìn)行，程序設(shè)定為1個(gè)循環(huán)的95°C 2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)為95°C 1分鐘， 55°C 1分鐘和72°C 2分鐘；和1個(gè)循環(huán)的72°C 5分鐘。
通過在TBE緩沖液中的0.8。/。瓊脂糖電泳分析了兩個(gè)PCR反應(yīng)，并且使 用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了產(chǎn)物。將兩個(gè)純化的PCR產(chǎn)物用作 模板DNA進(jìn)行第三PCR,其使用引物999255和999256，藉由引物999593 和999594的序列提供的互補(bǔ)端將兩個(gè)片段融合。
使用每種純化的PCR片段50 ng， dATP、 dCTP、dGTP和dTTP各200 |LiM, 含2.5 mM MgCl2的IX PCR緩沖液II,以及2.5單位的DNA聚合酶進(jìn) 行了 PCR。反應(yīng)在ROBOCYCLER 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行，程序設(shè)定為1個(gè) 循環(huán)的95。C 2分鐘；5個(gè)循環(huán)，每個(gè)為95°C 1分鐘，55°C 1分鐘和72°C 2 分鐘；然后向反應(yīng)中加入每種引物各0.4 (iM，再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，每個(gè)為95°C 1分鐘，55°C 1分鐘和72°C 2分鐘；和最終1個(gè)循環(huán)的72°C 5分鐘。通過在 TBE緩沖液中進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳使PCR產(chǎn)物顯影(visualize)。
將獲得的大約1080 bp的PCR產(chǎn)物使用TOPO TA Cloning Kit克隆入 pCR2.1,再按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化入ONE SHOT TOP10化學(xué)感受態(tài)大 腸桿菌細(xì)胞。使用BIOROBOT 9600從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA，并且 通過DNA測(cè)序進(jìn)行了分析以鑒定含有期望的修飾型mRNA加工/穩(wěn) 定化序列的那些。將一個(gè)具有預(yù)期的DNA序列的質(zhì)粒命名為pCR2.1-stabx2。實(shí)施例3:構(gòu)建質(zhì)粒pNBT48
將質(zhì)粒pNBT3 (pDG268MCSAneo-P一^4/co^" stab/SAV;美國(guó)專利 5,955，310)用胡I和Bam ffl消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖 電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了大約6704 bp 的載體片段。將質(zhì)粒pNBT8 (pDG268MCS-P,2/SAV;美國(guó)專利No. 5,955,310) 用和Bam HI消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行
該片段包含解淀粉芽孢桿菌啟動(dòng)子和克勞氏芽孢桿菌a/^/7編碼序列。 將pNBT3載體片段和P。my2-a/^//片段使用T4 DNA連接酶如制造商說明書 所述連接起來，并且將大腸桿菌DH5a細(xì)胞(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)用所述連接物按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化，在2X YT氨千青霉素平板上 在37。C選擇氨爺青霉素抗性。
使用QIAPREP 8 Plasmid Kit (質(zhì)粒試劑盒)(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)從一個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA,并且通過〗吏用Wcol的限制酶消化繼之 以在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。鑒定了一個(gè)產(chǎn)生了大約 6802 bp和1304 bp的預(yù)期DNA片段大小的質(zhì)粒并將其命名為pNBT48 (圖3)。
實(shí)施例4:構(gòu)建fl附3;g啟動(dòng)子-修飾型c/jJ/L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列
構(gòu)建了與修飾型cr>;//L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列連接的awyg啟動(dòng)子。 將質(zhì)粒pCR2.1-stabx2用尸ac I消化，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法用T4 DNA聚合酶和 dNTPs將末端平端化。然后將平端化的質(zhì)粒用7//^/III消化并且通過在TBE 緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1067 bp的片段，該片段含有修飾型mRNA加工/穩(wěn)定 化序列和a卩// N-末端編碼區(qū)。
將質(zhì)粒pNBT48用五c/ 136II和///"J III消化，并且通過在TBE緩沖液 中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 純化了大約7601 bp的載體片段。將pNBT48載體片IS:和^f',飾型 mRNA加工/穩(wěn)定化序列使用T4 DNA連接酶按照制造商的說明書連接起來， 并且將大腸桿菌DH5a細(xì)胞用所述連接物按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化，在2X YT氨芐青霉素平板上在37。C選擇氨芐青霉素抗性。使用BIOROBOT 9600 從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA，并且通過使用iVcoI的限制酶消化繼之以在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了分析。鑒定了一個(gè)產(chǎn)生了大約 1800 bp的預(yù)期DNA片段大小的質(zhì)粒并將其命名為pNBT55 (pDG268ANeo-P鵬^/mod. c7/tt4 stab/a/ r/7)(圖4)。
實(shí)施例5:構(gòu)建flmy2啟動(dòng)子-修飾型c/^/J/J mRNA加工/穩(wěn)定化序列
構(gòu)建了與修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列連接的amyG啟動(dòng)子。將 質(zhì)粒pNBT55通過用Sea I消化來線性化。將枯草芽孢桿菌168A4用所述線性 化的質(zhì)粒按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，見上文的方法轉(zhuǎn)化，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。通過將菌落貼片 (patch)到TBAB牛奶平板上并為澄清區(qū)域評(píng)分來篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的蛋 白酶生產(chǎn)，還通過將菌落貼片到TBAB新霉素平板上在37。C篩選其新霉素壽丈 感性以確認(rèn)DNA通過雙交換插入了枯草芽孢桿菌染色體的flm少五基因中。鑒 定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、產(chǎn)蛋白酶的轉(zhuǎn)化體(具有在"mj^基因座插 入的P，e/mod. stab/apr/f表達(dá)盒)并將其命名為枯草芽孢桿菌BW199。
實(shí)施例6:構(gòu)建"mj;^啟動(dòng)子-野生型c/y//L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列
構(gòu)建了與野生型mRNA加工/穩(wěn)定化序列連接的啟動(dòng)子。 將質(zhì)粒pNBT3用Pac I消化，并使用T4 DNA聚合酶和dNTPs將末端平端 化。然后將平端化的質(zhì)粒用/f/"Jin消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8% 瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約 1067 bp的片段，該片段含有野生型a7j7/j mRNA加工/穩(wěn)定化序列和克勞 氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(q/^/T) N-末端編碼區(qū)。
將大約7601 bp的pNBT48載體片段(實(shí)施例4)和大約1067 bp的野生型 c^//L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列片段使用T4 DNA連接酶按照制造商的說明 書連接起來，并且將大腸桿菌DH5a細(xì)胞用所述連接物按照制造商的說明書 轉(zhuǎn)化，在2X YT氨千青霉素平板上在37。C選擇氨芐青霉素抗性。使用 BIOROBOT 9600從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA,并且通過使用iVco I的 限制酶消化繼之以在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。鑒定了 一個(gè)生成了大約1800 bp的預(yù)期DNA片段大小的質(zhì)粒并將其命名為pNBT56 (pDG268ANeo-P。^e/co^/" stab/a; r//)(圖5)。實(shí)施例7:構(gòu)建fl附j(luò);2啟動(dòng)子-野生型cfy//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列
構(gòu)建了與野生型c^//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列連接的啟動(dòng)子。將 質(zhì)粒pNBT56通過用5ba I消化來線性化。將枯草芽孢桿菌168A4用所述線性 化的質(zhì)粒按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961,見上文的方法轉(zhuǎn)化，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。通過將菌落貼片到 TBAB牛奶平板上并為澄清區(qū)域評(píng)分來篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的蛋白酶生 產(chǎn)，還通過將菌落貼片到TBAB新霉素平板上在37。C篩選其新霉素敏感性， 從而確認(rèn)DNA通過雙交換插入了枯草芽孢桿菌染色體的am少五基因中。鑒定 了氯霉素抗性、新霉素敏感性、產(chǎn)蛋白酶的轉(zhuǎn)化體(具有在am;;五基因座插入 的P^e/cw//" stab/a/^7/表達(dá)盒)并將其命名為枯草芽孢桿菌BW198。
實(shí)施例8:評(píng)估flmj^啟動(dòng)子"務(wù)飾型c/jZr/X mRNA加工/穩(wěn)定化序列
將枯草芽孢桿菌菌抹BW199的克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(AprH)生產(chǎn) 與釆用野生型co///" mRNA加工/穩(wěn)定化序列的同基因##草芽孢桿菌菌林 BW198比較。將兩種菌抹在含有25 ml PS-1培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中在37°C 培養(yǎng)， 一式四份。在第3天(T1)、第4天(T2)和第5天(T3)取1 ml樣品；并 且測(cè)定了澄清上清液的蛋白酶活性。
按照以下步驟測(cè)量蛋白酶活性。將培養(yǎng)物上清液在樣品緩沖液(0.01% TWEEN , 100mMTRISpH8.5)中適當(dāng)?shù)叵♂專浜髮?duì)稀釋的樣品進(jìn)行從1 倍到1/3倍再到1/9倍的系列稀釋(seriesdilution)。將克勞氏芽孢桿菌堿性蛋 白酶標(biāo)準(zhǔn)品(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark; 4,260 NPU/g)相應(yīng)地在樣品 緩沖液中稀釋以建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。將總共20 pl的每種稀釋品(包括標(biāo)準(zhǔn)品) 轉(zhuǎn)移至96孔平底平板。向每孔加入200 (il Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物溶 液(每毫升DMSO 100 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA,按l:55.6稀釋在100 mM TRISpH8.5中)，并且將平板在環(huán)境溫度溫育10分鐘。在溫育過程中，使用 BIOMEK 3000 (Beckman Coulter, Inc， Fullerton CA， USA)在405 nm測(cè)量反 應(yīng)速率。通過從生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推來確定樣品濃度。
相對(duì)結(jié)果示于圖6。含有修飾型c^y/7L4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列的枯草 芽孢桿菌細(xì)胞到第5天為止平均產(chǎn)生了比含有野生型c^y//Z4 mRNA加工/穩(wěn) 定化序列的細(xì)胞多大約65%的克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶。因此，與野生型 cry//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比，修飾型c 7i7" mRNA加工/穩(wěn)定化序列使生產(chǎn)力得到顯著的增加。
實(shí)施例9:構(gòu)建co^JI4啟動(dòng)子4務(wù)飾型cij丌L4 mRNA加工/穩(wěn)、定化序列
構(gòu)建了與修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列連接的co^/"啟動(dòng)子。 將質(zhì)粒pCR2.1-stabx2用尸gc I和I消化，并且通過在TBE緩沖液中的 0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了 大約568 bp的片段，該片段含有修飾型ctj//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列。將 質(zhì)粒pNBT2用尸ac I和Sac I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8°/。瓊脂 糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6704 bp的載體片段。將pNBT2載體片段和修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序 列片段使用T4 DNA連接酶按照制造商的說明書連接起來，并且將大腸軒菌 XLIO-Gold Ultracompetent細(xì)胞用所述連接物按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化，在 2X YT氨千青霉素平板上在37-C選擇氨節(jié)青霉素抗性。使用BIOROBOT 9600從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA，并且通過使用Pac I和￡co RI的消化 繼之以在TBE緩沖液中的0.8°/。瓊脂糖電泳進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)。將一個(gè)具有大約 5882 bp和1388 bp的預(yù)期片段的質(zhì)粒命名為pGME085 (圖7)。
將質(zhì)粒pGME085通過用I和5ba I消化來線性化，并且通過在TBE 緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6851 bp的載體片段。將枯草芽孢桿菌168A4用所述純化的 質(zhì)粒片,殳按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961，見上文的方法轉(zhuǎn)孑匕，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。將一個(gè)在基 因座插入了 P一Wmod. co;//L4 stab/opr/7表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢桿 菌GME202。
實(shí)施例10:構(gòu)建共有啟動(dòng)子"務(wù)飾型c/j/iX4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列
構(gòu)建了與修飾型C0;///」mRNA加工/穩(wěn)定化序列連接的包含共有-35和 -10區(qū)的啟動(dòng)子。將質(zhì)粒pGME079用尸ac I和&c I消化，并且通過 在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6704 bp的載體片段。將pGME079載體片段和大 約568 bp的修飾型c^y//Z4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列片段(實(shí)施例9)使用T4 DNA連接酶按照制造商的說明書連接起來，并且將大腸桿菌XL 10-GOLD Ultracompetent細(xì)胞用所述連接物按照制造商的說明書轉(zhuǎn)4匕，在2X YT氨千 青霉素平板上在37。C選擇氨芐青霉素抗性。使用BIOROBOT 9600從幾個(gè) 轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA，并且通過使用戶ac I和五co RI的消化繼之以在TBE 緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)。將一個(gè)具有大約6704 bp和566 bp 的預(yù)期片段的質(zhì)粒命名為pGME080(圖8)。
將質(zhì)粒pGME085通過用I和Sea I消化來線性化，并且通過在TBE 緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6851 bp的載體片段。將枯草芽孢桿菌168A4用所述純化的 質(zhì)粒片段按照Anagnostopouos和Spizizen, 1961,見上文的方法轉(zhuǎn)化，并且 在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。將一個(gè)在amy丄基 因座插入了 P共有^,似/mod. stab/fl/ ri/表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢 桿菌GME203。
實(shí)施例ll:評(píng)估枯草芽孢桿菌菌抹GME201、 GME202和GME203
創(chuàng)造了含有野生型c^y/ffi4啟動(dòng)子和未修飾的(野生型)mRNA加 工/穩(wěn)定化序列的枯草芽孢桿菌菌抹充當(dāng)基線對(duì)照用于與枯草芽孢桿菌菌抹 GME201、 GME202和GME203比較。按照Pitcher等，1989，^ ; /. M/cra&o/. 8: 151-156的方法，從包含插入在cwn)必基因座的Pco^>^/tt4 stab/apri/盒的枯草芽孢桿菌PL1801 wo/ffi::TnW7 (美國(guó)專利No. 5,955,310) 分離了基因組DNA。將枯草芽孢桿菌168A4用所述基因組DNA按照 Anagnostopoulos和Spizizen， 1961,見上文的方法轉(zhuǎn)化，并且在TBAB氯霉 素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。將一個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體命名為枯草 芽孢桿菌GME200。
將枯草芽孢桿菌菌抹GME200、 GME201、 GME202和GME203在含有 25 ml PS-1培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中在37。C培養(yǎng)， 一式三份。在第3天(T1)、 第4天(T2)和第5天(T3)取1 ml樣品并且測(cè)定了澄清上清液的蛋白酶活性， 如實(shí)施例8中所述。
關(guān)于上述培養(yǎng)物的平均相對(duì)克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶產(chǎn)值示于圖9。 所述結(jié)果證明，從包含共有c^7/"啟動(dòng)子和/或i奮飾型mRNA加工/ 穩(wěn)定化序列的構(gòu)建體表達(dá)蛋白酶的菌抹(枯草芽孢桿菌GME201、 GME202 和GME203)全都產(chǎn)生了比枯草芽孢桿菌GME200更多的蛋白酶，在枯草芽孢桿菌GME200中蛋白酶是從與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列連 接的野生型c^y//"啟動(dòng)子表達(dá)的?？莶菅挎邨U菌GME202與枯草芽孢桿菌 GME200提供了 73%的增加，同時(shí)枯草芽孢桿菌GME203相對(duì)于枯草芽孢桿 菌GME201提供了 13%的增加?？莶菅挎邨U菌GME201與枯草芽孢桿菌 GME200相比提供了 133%的增加，而枯草芽孢桿菌GME203相對(duì)于枯草芽 孢桿菌GME202 4是供了 53%的增加。最高生產(chǎn)力來自啟動(dòng)子變體枯草芽孢 桿菌GME203,其包含共有P^脳和修飾型c^y//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列， 與枯草芽孢桿菌GME200相比其提供了 164%的增加。
實(shí)施例12:構(gòu)建地衣芽孢桿菌宿主菌林MDT283
將地衣芽孢桿菌SJ1904 (WO 94/014968)用C-組分基因缺失質(zhì)粒 (C-component deletion plasmid) pNBT38 (美國(guó)公開申請(qǐng)20050221446)按照 Xue等，1999, / Mz'craWo/. Me決o^y 34(3): 183-191的方法通過電穿孔轉(zhuǎn)化。 簡(jiǎn)言之，使用1-5 ml在LBS中培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌過夜培養(yǎng)物接種50 ml 新鮮LBS培養(yǎng)基，并且在37。C和250 rpm溫育所述培養(yǎng)物。使培養(yǎng)物生長(zhǎng) 至穩(wěn)定期，并且在緩慢生長(zhǎng)期之后培養(yǎng)物經(jīng)歷生長(zhǎng)速率的增加時(shí)(指數(shù)生長(zhǎng) 結(jié)束之后1-3小時(shí))，通過在6500xg離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞用50ml冰冷的 MSG(0.5M甘露醇，0.5M山梨糖醇，10%甘油)洗滌2次，并且重懸在大約 750 MSG中。如下轉(zhuǎn)化細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞儲(chǔ)存在-20。C。將60 pl電感受態(tài)細(xì)胞 與質(zhì)粒DNA在具有l(wèi)-mm電極間隙的電穿孔杯中混合，并使用GENE PULSER⑧進(jìn)行電脈沖，將GENE PULSER⑧設(shè)定為25 200 Q和1.0 kV。 然后將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至每毫升含有0.2 jig紅霉素的950 piLBSM培養(yǎng)基 中來i秀導(dǎo)紅霉素抗性。將轉(zhuǎn)化體在34。C和250 rpm溫育2.5-3小時(shí)，然后在 TBAB紅霉素/林可霉素平板上在34。C選擇紅霉素抗性。
將一個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體在具有紅霉素選擇的TBAB平板上在50。C培養(yǎng)， 以選擇pNBT38向染色體中C-組分基因處的整合。然后將一個(gè)這樣的整合體 在不帶選擇性的VY培養(yǎng)基中在34。C培養(yǎng)，以使整合的質(zhì)粒切下并丟失。將 培養(yǎng)物鋪板在LB平板上，在37。C篩選紅霉素敏感性的菌落，其說明了質(zhì)粒 的丟失。如實(shí)施例2中所述，通過PCR,使用引物991173和991176測(cè)試了 幾個(gè)紅霉素敏感性克隆。
引物991173:5'-GAATTCGACGGCTTCCCGTGCGCC-3， (SEQ ID NO: 15) 引物991176:
5'-AAGCTTCCATTCAAACCTGGTGAGGAAG-3， (SEQ ID NO: 16) 將一個(gè)用PCR擴(kuò)增了大約606 bp的片段的克隆(說明C-組分蛋白酶基因 從染色體缺失)命名為地衣芽孢桿菌MDT283。
實(shí)施例13:構(gòu)建質(zhì)粒栽體pMDT131和pMDT160
構(gòu)建了質(zhì)粒pMDT131和pMDT160以創(chuàng)建賦予氯霉素抗性的溫度敏感
質(zhì)粒o
通過將氯霉素抗性基因插入質(zhì)粒pMRT074 (美茵公開申請(qǐng)20030175902) 構(gòu)建了質(zhì)粒pMDT131。將質(zhì)粒pMRT074用五coRI消化，并且通過在U。C與 T4 DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN， USA)和每種 dNTPs各25 pM—起溫育20分鐘將末端平端化，其后通過在75。C溫育10分 鐘對(duì)聚合酶進(jìn)行熱滅活。然后將質(zhì)粒用I消化，通it^TBE緩沖液中的0.8% 瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約 4355 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBTl (pDG268MCS;美國(guó)專利No. 6,255,076) 用￡co 47III和I消化，通# TBE緩沖液中的0.8°/。瓊脂糖電泳進(jìn)行分析， 并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1222 bp的片段，該片段 含有caf基因和多克隆位點(diǎn)。將pMRT074載體片段與c^片l殳使用T4DNA連 接酶按照制造商的說明書連接，并且將枯草芽孢桿菌168A4用所述連接物按照 Anagnostopoulos和Spizizen, 1961,見上文的方法轉(zhuǎn)化，在TBAB氯霉素平板 上在34。C選擇氯霉素抗性。使用Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc.， Valencia, CA, USA)從一個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,并且通過用HI消化繼之以在TBE 緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了確認(rèn)，其生成了大約3779 bp和1802 bp的 預(yù)期的片段。將所得質(zhì)粒命名為pMDT131(圖10)。
通過去除pMRT074的5aw ffl、 5Vwa I和Ap 718限制位點(diǎn)構(gòu)建了質(zhì)粒 pMDT159。將質(zhì)粒pMRT074用BamHI和v^p718消化，并且通過在11。C與 T4 DNA聚合酶和每種dNTPs各25 , —起溫育20分鐘將末端平端化，其后 通過在75。C溫育10分鐘對(duì)聚合酶進(jìn)行熱滅活。通過在TBE緩沖液中的0.8% 瓊脂糖電泳對(duì)消化的質(zhì)粒進(jìn)行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6022bp的載體片段。將純化的片段用T4DNA連接酶按照制造商的說明書處理，并按照Anagnostopoulos和Spizizen ， 1961 ，見上文的方 法用所述連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌抹168A4,在TBAB紅霉素/林可霉素平 板上在34。C選擇紅霉素抗性。將所得質(zhì)粒命名為pMDT159 (圖11)。通過限 制酶消化確i/v了 5awH、 5"mal和^sp718位點(diǎn)的丟失。
通過將氯霉素抗性基因引入pMDT159構(gòu)建了質(zhì)粒pMDT160。將質(zhì)粒 pMDT159用￡co RI消化，并且通過在11。C與T4 DNA聚合酶和每種dNTPs 各25 |jM —起溫育20分鐘將末端平端化，其后通過在75。C溫育10分鐘對(duì)聚 合酶進(jìn)行熱滅活。然后將質(zhì)粒用M f I消化并且通itt TBE緩沖液中的0.8% 瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約 4354 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBTl用&o47III和A^I消化，通過在TBE 緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1222 bp的片段，該片段含有基因和多克隆位點(diǎn)。 如上所述^吏用T4 DNA連接酶將pMRT074載體片段與pNBTl 片段連接， 并且將枯草芽孢桿菌168A4用所述連接物按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，見上文的方法轉(zhuǎn)化，在TBAB氯霉素平板上在34。C選擇氯霉素抗性。 使用Plasmid Midi Kit /人一個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,并且通過用I消化 繼之以在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了確認(rèn)，其生成了大約2193 bp、 1817bp和1566bp的預(yù)期的片段。將所得質(zhì)粒命名為pMDT160 (圖12)。
實(shí)施例14:構(gòu)建質(zhì)粒pHyGe204
通過將pMRT044 (美國(guó)公開申請(qǐng)20030175902)的地衣芽孢桿菌am少丄片段 插入質(zhì)粒載體pMDT160構(gòu)建了質(zhì)粒pHyGe203。將質(zhì)粒pMDT160用Sma I 和歷w/ III消化并且通過在TAE (40 mM Tris-20 mM乙酸鈉-1 mM EDTA pH7.2)緩沖液中的1.0%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約5531 bp的載體片段。將質(zhì)粒pMRT044使用Sma I 和歷"dm消化并且通過在TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再 使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1072bp的片段，該片段含有 amy丄上游和下游片革殳。將pMDT160載體片,殳和pMRT044 awy丄片段使用 Rapid Ligation Kit (快速連接試劑盒)(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的說明書連接起來，并4姿照Anagnostopoulos 和Spizizen, 1961,見上文的方法用所述連接物轉(zhuǎn)化枯草芽3包桿菌菌^朱168A4,在TBAB氯霉素平板上在34'C選擇氯霉素抗性。將所得質(zhì)粒命名為pHyGe203 (圖13)。通過用iVcoI消化繼之以在TAE緩沖液中的1,0%瓊脂糖電泳確認(rèn)了 所述質(zhì)粒，其生成了大約5343 bp和1260 bp的預(yù)期的片段。
通過將c^/Z/J mRNA加工/穩(wěn)定化序列和pNBT18 (pDG268MCSAneo-long co^/" stab/SAV,美國(guó)專利No. 6,255，076)的克勞氏芽孢桿菌a; /^基因 插入pHyGe203的a附y(tǒng)丄上游和下游片段之間構(gòu)建了質(zhì)粒pHyGe204。將質(zhì)粒 pHyGe203用136II和Bam ffl消化并且通過在TAE緩沖液中的1.0%瓊脂 糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6586 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBT18用尸ac I消化，并且通過在irC與T4 DNA 聚合酶和每種dNTPs各25 |oM —起溫育20分鐘將末端平端化。然后將所述 消化的質(zhì)粒用^W7HI消化并且通過在TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖電泳進(jìn)行 了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1768bp的片段， 該片段含有mRNA加工/穩(wěn)定化序列和克勞氏芽孢桿菌a/^7/基因。使 用Rapid Ligation Kit按照制造商的說明書將pHyGe203載體片段和mRNA加 工/穩(wěn)定化序列/apr//片段連接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961， 見上文的方法用所述連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌抹168A4,在TBAB氯霉素 平板上在34。C選擇氯霉素抗性。將所得質(zhì)粒命名為pHyGe204。通過用iVcoI 和用歷"din的消化繼之以在TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖電泳確認(rèn)了所述質(zhì) 粒，對(duì)于iVcoI其生成了大約6249bp和2103bp的預(yù)期的片段，且對(duì)于/f/w/ III其生成了大約6743 bp和1609 bp的預(yù)期的片段。
實(shí)施例15:構(gòu)建質(zhì)粒pHyGe205
通過將修飾型c^//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列和pGME080的克勞氏芽 孢桿菌apr/Z基因插入pHyGe203的上游和下游片段之間構(gòu)建了質(zhì)粒 pHyGe205。將質(zhì)粒pGME080用尸ac I消化，并且通過在11。C與T4 DNA聚 合酶和每種dNTPs各25 pM —起溫育20分鐘將末端平端化。然后將消化的 質(zhì)粒用Bam HI消化并且通過在TAE緩沖液中的1.0°/。瓊脂糖電泳進(jìn)行了分 析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1793 bp的片段，該 片段含有修飾型cry//Z4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列和克勞氏芽孢桿菌op^基 因。使用Rapid Ligation Kit按照制造商的說明書將pHyGe203 ￡c/ 136II/^wz HI載體片段(上文所述)和修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列/fl/^/f片段連接，并按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961,見上文的方法用所述連接物轉(zhuǎn)化枯 草芽孢桿菌菌株168A4,在TBAB氯霉素平板上在34。C選擇氯霉素抗性。 將所得質(zhì)粒命名為pHyGe205 (圖14)。通過用ATco I和用///"^III的消化繼之 以在TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖電泳確認(rèn)了所述質(zhì)粒，對(duì)于iVco I其生成 了大約6274 bp和2103 bp的預(yù)期的片段，且對(duì)于III其生成了大約6743 bp和1634 bp的預(yù)期的片段。
實(shí)施例16:構(gòu)建質(zhì)粒pHyGe206
通過PCR從地衣芽孢桿菌菌抹MDT220 (美國(guó)公開申請(qǐng)20050221446) 克隆了含有三聯(lián)啟動(dòng)子的片段。按照Pitcher等，1989，見上文的方法從地 衣芽孢桿菌菌抹MDT220分離了基因組DNA。使用寡核苦酸引物994112和 060762 ， 用Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN， USA)按照制造商的說明書，從地衣芽孢桿菌MDT720基因
組DNA用PCR擴(kuò)增了含有P呵L4!99/P短共有呵Q/PcrymA三聯(lián)啟動(dòng)子的片段。所
述PCR在Eppendorf Mastercylcer梯度熱循環(huán)儀中進(jìn)行，程序設(shè)定為1個(gè)循 環(huán)的94°C 2分鐘；11個(gè)循環(huán)，每個(gè)為94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 1分15 秒；15個(gè)循環(huán)，每個(gè)為94。C 30秒，58°C 30秒，72°C 1分15秒(對(duì)每個(gè)連 續(xù)的循環(huán)加5秒)；和1個(gè)循環(huán)的72°C 7分鐘。 引物994112:
5'-GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA-3' (SEQ ID NO: 17) 引物060762:
5'-ATCGATAATAATTTATACACTATTCTATTGG-3， (SEQ ID NO: 18) 使用QIAQUICK PCR Purification Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA)按 照制造商的說明書純化了獲得的大約991 bp的PCR產(chǎn)物，使用TOPO TA Cloning Kit將所述產(chǎn)物克隆入pCR2.1,再按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化入ONE SHOT TOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將所得質(zhì)粒命名為pHyGe201 (圖 15)。通過DNA測(cè)序確認(rèn)了 pHyGe201中的三聯(lián)啟動(dòng)子序列。
通過將來自質(zhì)粒pHyGe201的三聯(lián)啟動(dòng)子插入質(zhì)粒載體pMDT131構(gòu)建 了質(zhì)粒pHyGe206。將質(zhì)粒pMDT131用C7a I和I消化并且通過在TAE 緩沖液的1.0%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約5568 bp的載體片段。將質(zhì)粒pHyGe201用C7a I和iVof I消化并且通過在TAE緩沖液的1.0°/。瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約983 bp的載體片段，該片段含有三聯(lián)啟動(dòng)子。 使用Rapid Ligation Kit按照制造商的說明書將pMDT131載體片^殳和三聯(lián)啟 動(dòng)子片段連4婁，并按照Anagnostopoulos和Spizizen， 1961，見上文的方法用 所述連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌林168A4,在TBAB氯霉素平才反上在34°C 選擇氯霉素抗性。將所得質(zhì)粒命名為pHyGe206 (圖16)。通過用尸ac I消化 繼之以在TAE緩沖液中的1.0%瓊脂糖電泳確認(rèn)了質(zhì)粒，其產(chǎn)生了大約3187 bp、 2490 bp和874 bp的預(yù)期的片段。
實(shí)施例17:構(gòu)建在基因座插入了 mRNA加工/穩(wěn)、定化序列
和克勞氏芽孢桿菌fl/w必基因的地衣芽孢桿菌茵株
將地衣芽孢桿菌菌抹MDT283如實(shí)施例12中所述用質(zhì)粒pHyGe204轉(zhuǎn) 化。然后將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有0.2 ng/ml紅霉素的950 |il LBSM培養(yǎng) 基中來誘導(dǎo)紅霉素抗性。將轉(zhuǎn)化體在34。C和250 rpm溫育2.5-3小時(shí)，然后 在TBAB紅霉素/林可霉素平板上在34。C選擇紅霉素抗性。
將一個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體在具有紅霉素選擇的TBAB平板上在50。C培養(yǎng)， 以選擇pHyGe204向染色體中基因座處的整合。然后將一個(gè)這樣的整 合體在不帶選擇的VY培養(yǎng)基中在34。C培養(yǎng)，以使整合的質(zhì)粒切下并丟失。 將培養(yǎng)物鋪板在LB平板上，在37。C篩選紅霉素敏感性的菌落，其說明了質(zhì) 粒的丟失。篩選在含有0.5。/。淀粉天青(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的 瓊脂上不能形成澄清區(qū)域的紅霉素敏感性菌落，這說明am^基因已經(jīng)由 mRNA加工/穩(wěn)定化序列和克勞氏芽孢桿菌印r/7基因代替。通過PCR 確認(rèn)了在amj/￡基因座處c^/ZW mRNA加工/穩(wěn)定化序列和qpr/Z基因的插 入，所述PCR使用結(jié)合上游的引物950872和結(jié)合在編碼區(qū)內(nèi)的 引物950984。將一個(gè)這樣的菌抹命名為地衣芽孢桿菌HyGe208。
引物950872:
5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3' (SEQ ID NO: 19)
引物950984:
5'-CGACTTCCTCTTCCTCAGAG隱3' (SEQ ID NO: 20) 將地衣芽孢桿菌菌株MDT283用質(zhì)粒pHyGe205通過電穿孔如上所述轉(zhuǎn)化，在TBAB紅霉素/林可霉素平板上在34。C選擇紅霉素抗性。將一個(gè)這樣 的轉(zhuǎn)化體在具有紅霉素選擇的TBAB平板上在50。C培養(yǎng)，以選擇pHyGe205 向染色體中"my丄基因座處的整合。然后將一個(gè)這樣的整合體在不帶選擇的 VY培養(yǎng)基中在34。C培養(yǎng)，以使整合的質(zhì)粒切下并丟失。將培養(yǎng)物在37。C鋪 板在LB平板上，篩選紅霉素敏感性的菌落，其說明了質(zhì)粒的丟失。篩選在 含有0.5%淀粉天青的瓊脂上不能形成澄清區(qū)域的紅霉素敏感性菌落，這說 明am_y￡基因已經(jīng)由修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列和克勞氏芽孢桿 菌qpr/Z基因代替。通過PCR確認(rèn)了在amy丄基因座處c^y//" mRNA加工/ 穩(wěn)定化序列和"/wW基因的插入，所述PCR使用上文所示的引物950872和 950984。將一個(gè)這樣的菌抹命名為HyGe209。
實(shí)施例18:構(gòu)建在fl/wj丄基因座插入了三聯(lián)啟動(dòng)子和克勞氏芽孢桿菌 印rH基因的地衣芽孢桿菌菌林
將地衣芽孢桿菌菌抹HyGe208和HyGe209如實(shí)施例12中所述用質(zhì)粒 pHyGe206轉(zhuǎn)化，在TBAB紅霉素/林可霉素平板上在34。C選擇紅霉素抗性。 將一個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體在具有紅霉素選擇的TBAB平板上在50。C培養(yǎng)，以選
擇pHyGe205向染色體中基因座處的整合。然后將一個(gè)這樣的整合體 在不帶選擇的VY培養(yǎng)基中在34。C培養(yǎng)，以使整合的質(zhì)粒切下并丟失。將培 養(yǎng)物在37。C鋪板在LB平板上，篩選紅霉素敏感性的菌落，其說明了質(zhì)粒的 丟失。篩選在含有1%脫脂奶粉的瓊脂上能夠形成大的澄清區(qū)域的紅霉素敏 感性菌落，這說明三聯(lián)啟動(dòng)子已經(jīng)插入到克勞氏芽孢桿菌ap^基因上游。 通過PCR確認(rèn)了在基因座處a/ r//表達(dá)盒的存在，所述PCR使用上文
個(gè)這樣的源自地衣芽孢桿菌HyGe208并且具有大約3094 bp的預(yù)期PCR產(chǎn) 物的菌抹命名為地衣芽孢桿菌HyGe210;將一個(gè)源自地衣芽孢桿菌HyGe209 并且具有大約3119 bp的預(yù)期PCR產(chǎn)物的菌抹命名為地衣芽孢桿菌 HyGe211。地衣芽孢桿菌菌抹HyGe210在am少丄基因座含有ajw7/表達(dá)盒，
該表達(dá)盒包含PamyL4199/P短共有amyQ/PcryllIA/cO^" Stab啟動(dòng)子。地衣芽孢桿菌菌
抹HyGe211在a附y(tǒng)丄基因座含有a/ r//表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含PamyL4i99/P短共有 呵Q/PcryiiiA/mod. c^/7L4 stab啟動(dòng)子。通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序確認(rèn)了 HyGe210和HyGe211中的opr//表達(dá)盒的序列。實(shí)施例19:評(píng)估三聯(lián)啟動(dòng)子變體
將地衣芽孢桿菌菌抹HyGe210和HyGe211在適合于勞氏芽孢桿菌堿性 蛋白酶(AprH)產(chǎn)生的條件下在標(biāo)準(zhǔn)小發(fā)酵罐中培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基包含水解 馬鈴薯蛋白和礦物鹽，及蔗糖補(bǔ)料(with a sucrose feed)。在發(fā)酵過程中的多 個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定整體培養(yǎng)液樣品的蛋白酶活性。
按照以下步驟測(cè)量蛋白酶活性。將培養(yǎng)物上清液在樣品緩沖液(O.01 % TWEEN , 100 mM TRIS pH 8.5)中適當(dāng)?shù)叵♂專浜髮?duì)稀釋的樣品進(jìn)行從1 倍到1/3倍再到1/9倍的系列稀釋。將克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(AprH)標(biāo) 準(zhǔn)品(Novozymes A/S, Bagsvaerd， Denmark)在樣品緩沖液中使用2倍步驟稀 釋，起始于0.625 NPU/ml的濃度，并以0.078 NPU/ml的濃度結(jié)束。將總共 20 pl的每種稀釋品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)轉(zhuǎn)移至96孔平底板。向每孔加入200 [il Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 底物溶液(每毫升 DMSO 100 mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA,按1:55.6稀釋在100 mM TRIS pH 8.5中)，并且 將平板在環(huán)境溫度溫育10分鐘。在溫育過程中，使用BIOMEK 3000在405 nm測(cè)量反應(yīng)速率。通過從生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推來確定樣品濃度。
結(jié)果示于圖17。所述結(jié)果證明，從包含修飾型co^/Z4mRNA加工/穩(wěn)定 化序列的三重啟動(dòng)子構(gòu)建體表達(dá)蛋白酶的地衣芽孢桿菌HyGe211產(chǎn)生了比 地衣芽孢桿菌HyGe210更多的蛋白酶，在地衣芽孢桿菌HyGe210中蛋白酶 是從包含未修飾的co^tt4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列的三重啟動(dòng)子構(gòu)建體表達(dá) 的。72小時(shí)的發(fā)酵之后，地衣芽孢桿菌HyGe211與地衣芽孢桿菌HyGe210 相比提供了 61%的增加。
實(shí)施例20:構(gòu)建pMDT100
質(zhì)粒pMDT100是一種含有P呵L4w/P短共有抓yQ/PcrymA/crylIIAstab三聯(lián)啟 動(dòng)子的大腸桿菌復(fù)制子，所述三聯(lián)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基 因Op^0的表達(dá)。這種a/^7/表達(dá)盒和pC194 (Horinouchi和Weisblum, 1982, / Ba"m'o/. 150: 804-814)的o /基因的兩側(cè)翼為枯草芽孢桿菌a-淀粉酶(amy^) 基因的片段，這允許a卩//表達(dá)盒和基因藉由兩個(gè)片段通過雙同源 重組插入枯草芽孢桿菌染色體的am;^基因座。用另一基因替代pMDT100 中的a/^7/基因，這允許該基因在枯草芽孢桿菌中插入染色體并表達(dá)。pMDT100的構(gòu)建在下文描述。
質(zhì)粒pNBT51。使用QIAGEN Plasmid Kit (質(zhì)粒試劑盒)(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)按照制造商的說明書從作為宿主的大腸桿菌DH5a分離 了質(zhì)粒pNBTIO (pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV ; 美國(guó)專利No. 6,255,076)，并且將該質(zhì)粒用C7a I和Sea I消化。切割發(fā)生在ap^/編碼序列 中大約在第326密碼子處的C/a I位點(diǎn)，而非在大約第23密碼子處的C7a I 位點(diǎn)，其因大腸桿菌Dam DNA曱基轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致的曱基化而封閉。使用 Klenow片段(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA)和dNTPs按照制 造商的說明書將Cto I末端平端化。將消化的質(zhì)粒通過在TBE緩沖液中的 0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化 了大約6615 bp的載體片段。將質(zhì)粒pOS4301 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, OH， USA)用I和Sea I消化，并且將1 末端使用Klenow片段和dNTPs平端化，如上所述。將消化的質(zhì)粒通過在 TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約840 bp的片段，該片段含有大腸桿菌n77萬(wàn)轉(zhuǎn)錄終 止子。同樣的840 bp IASca I片段可以從載體pKK223-3 (GE Healthcare, Piscataway, NJ， USA)(圖18)分離。使用T4 DNA連接酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)按照制造商的說明書將pNBT10載體片段 和含終止子的片段連接起來，并且將大腸桿菌DH5a細(xì)胞用所述連接物按照 制造商的說明書轉(zhuǎn)化，在2X YT氨千青霉素平板上在37。C選擇氨節(jié)青霉素 抗性。將所得質(zhì)粒命名為pNBT51 (pDG268-PciyIIIA/crymAstab/SAVA)(圖19)。
質(zhì)粒pNBT52。將質(zhì)粒pNBT51用斬I消化，并且通過在11°C與T4 DNA 聚合酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和每種dNTPs各 25 —起溫育20分鐘將末端平端化，其后通過在75。C溫育10分鐘對(duì)聚合 酶進(jìn)行熱滅活。然后將平端化的質(zhì)粒用Dra III消化，并且通過在TBE緩沖 液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 純化了大約5920 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBT20 (pDG268MCS畫P短共有 amy( /SAV;美國(guó)專利No. 6，255，076)用￡>ra III和￡c/ 136II消化，并且使用 QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約1641 bp的片段，該片段含有短
共有a附y(tǒng)2啟動(dòng)子(P短共有呵Q)。如上所述將pNBT51載體片段和P短共有amyQ片
段連接，并且如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，在2X YT氨芐青霉素平板上在37。C選擇氨芐青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Minipr印 Kit (小量制備試劑盒)從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，將所述質(zhì)粒DNA用
I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。將一 個(gè)具有大約4873 bp和2688 bp的預(yù)期限制片段的質(zhì)粒命名為pNBT52 (pDG268-P短共有呵Q/Pcry脆/crylIIAstab/SAVA)(圖20)。
質(zhì)粒。NBT53。將質(zhì)粒pNBT6 (pHP13amp-SAV;美國(guó)專利No. 6,255,076) 用S/ I和Sac I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了 分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6438 bp的載體片 段。將質(zhì)粒pNBT52用胡I和&c I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8% 瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約 727bp的片,殳，該片段含有P短共有卿Q/PcrymA/crymAstab串聯(lián)啟動(dòng)子。如上所 述將pNBT6載體片段和P短共有呵Q/P一nA/crylIIAstab片段連接，并且如上所 述用所述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，在2X YT氨千青霉素平板上在 37°C選擇氨節(jié)青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分 離了質(zhì)粒DNA，將所述質(zhì)粒DNA用尸w II消化，并且通過在TBE緩沖液 中的0.8。/。瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。將一個(gè)具有大約4卯3bp、 1320 bp和942 bp的預(yù)期限制片段的質(zhì)粒命名為pNBT53 (pHP13amp-P短共有 amyQ/PcryI1IA/cryIIIAstab/SAV)(圖21)。
質(zhì)粒pNBT54。將質(zhì)粒pNBTl (pDG268MCS;美國(guó)專利No. 6,255,076) 用^S刀I和Bam HI消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8°/。瓊脂糖電泳進(jìn)行 了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6040 bp的載體 片段。將質(zhì)粒pNBT53用S刀I和Bam HI消化，并且通過在TBE緩沖液中的 0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了 大約1953 bp的片段，該片段含有P短共有呵Q/P一nA/crylIIAstab/SAV表達(dá)盒。 如上所述將pNBTl載體片段和P短共有呵Q/PcrymA/crylIIAstab/SAV片段連接， 并且如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，在2XYT氨千青霉素 平板上在37。C選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè) 轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，將所述質(zhì)粒DNA用鄰I和Btwz HI同時(shí)消化，其 后在TBE緩沖液中進(jìn)行0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳。將一個(gè)具有大約6040 bp和 1953 bp的預(yù)期限制片段的質(zhì)粒命名為pNBT54 (pDG268MCS-P短共有 amyQ/PcrymA/crymAStab/SAV)(圖22)。質(zhì)粒pNBT35。將質(zhì)粒pNBT2 (pDG268MCSA-PreryIIIA/cryniAstab/SAV; 美國(guó)專利No. 6，255,076)用鄰I和Saw HI消化，并且通過在TBE緩沖液中 的0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit 純化了大約5394 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBT54用胡I和HI消化， 并且通過在TBE緩沖液中的0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)^f亍了分析，再使用
共有amyQ/PcrymA/cryniAstab/SAV表達(dá)盒。如上所述將pNBT2載體片段和P短共有 amyQ/PcryiiiA/cryinAstab/SAV片段連接，并且如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5a細(xì)胞，在2X YT氨節(jié)青霉素平板上在37。C選擇氨爺青霉素抗性。 使用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,將所述質(zhì)粒 DNA用iVco I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 了分析。將一個(gè)具有大約5492 bp和1855 bp的預(yù)期限制片段的質(zhì)粒命名為 pNBT35 (pDG268MCSA國(guó)P SMamyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)(圖23)。
質(zhì)粒pNBT30。將質(zhì)粒pNBT30構(gòu)建成含有am_y￡基因啟動(dòng)子(美國(guó)專利 No. 6，100，063)的amyL4199變體的PCR克隆。按照Pitcher等，1989,見上 文的方法分離了地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA。 ^使用下文所示的引物 950872和991151通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴(kuò)增了 amj^W卯啟動(dòng)子(P咖yL，9)基因。引物950872并入了胡I限制位點(diǎn)，而引物 991151并入了 &^1限制位點(diǎn)和？咖^4199的變體核苷酸。
引物950872:
5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT畫3' (SEQ ID NO: 21)
引物991151:
5'誦GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3' (SEQ ID NO: 22) 使用AMPLITAQ Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems， Foster City, CA,USA)按照制造商的推薦進(jìn)行了 PCR，只是MgCl2濃度是3mM,而非標(biāo) 準(zhǔn)的1.5mM。擴(kuò)增反應(yīng)(50^I)由10mMTris-HCl(pH8.3), 50mMKCl， 3.0 mM MgCl2,每種dNTP各200 (iM,每種引物各0.5 (iM， 0.25單位的 AMPLITAQ Gold DNA聚合酶和大約200 ng模板DNA組成。所述PCR在 ROBOCYCLER 40 Temperature Cycler中進(jìn)行，程序設(shè)定為1個(gè)循環(huán)的95°C 9分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95°C 1分鐘，55°C 1分鐘和72°C 1分鐘；和1個(gè)循環(huán)的72 °C 3分鐘。
將獲得的大約625 bp的PCR產(chǎn)物使用TOPO TA Cloning Kit克隆入載 體pCR2.1 ，再按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化入ONE SHOT TOP10化學(xué)感受態(tài) 大腸桿菌細(xì)胞。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒 DNA，并且通過用￡co RI消化繼之以在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分 析了克隆的PCR片段的存在。將一個(gè)具有大約3913 bp和640 bp的預(yù)期的 限制片段的質(zhì)粒命名為pNBT30 (pCR2.1-amyL4199)(圖24)。通過DNA測(cè)序 確認(rèn)了克隆的PCR片段的DNA序列。
質(zhì)粒pNBT31。將質(zhì)粒pNBT3 (pDG268MCSAneo-PrcryIIIA/cryinAstab/SAV; 美國(guó)專利No. 6，255,076)用鄰I和&c I消化，并且通過在TBE緩沖液中的 0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了 大約7931 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBT30用S/H和Sac I消化，并且通過 在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約612 bp的片段，該片段含有P咖yL4199。如上所述將 pNBT3載體片段和P呵i^99片段連接，并且按照制造商的說明書用所述連接 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL 1-Blue細(xì)胞(Stmtagene Corporation, La Jolla, CA, USA), 在2XYT氨節(jié)青霉素平板上在37。C選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，將所迷質(zhì)粒DNA用iVco I消 化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。將一個(gè)具有 大約6802 bp和1741 bp的預(yù)期限制片段的質(zhì)粒命名為pNBT31 (圖25)。
質(zhì)粒pNBT36。將質(zhì)粒pNBT35用胡I消化，并且使用T4 DNA聚合酶 和dNTPs將末端平端化，如上所述。然后將平端化的質(zhì)粒用￡>ra III消化并 且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約5808 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBT31用Dra III 和￡c/ 136II消化，通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，并 且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約2150 bp的片段，該片段
含有P呵L4W。如上所述將pNBT35載體片段和P加yL4,99片段連接，并且按
照制造商的說明書用所述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞(Stratagene Corporation, La Jolla, CA, USA)，在2X YT氨千青霉素平板上在37°C選擇氨 千青霉素抗性。使用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒 DNA,將所述質(zhì)粒DNA用TVco I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析。將一個(gè)具有大約5492 bp和2466 bp的預(yù)期限制片 段的質(zhì)粒命名為pNBT36 (圖26)。
質(zhì)粒pMDT100。將質(zhì)粒pNBT13 (pDG268Aneo-P咖yL/P一nA/crylIIAstab/ SAV;美國(guó)專利No. 6,255,076)用Dra III和Sgc I消化，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約6395 bp的載體片段。將質(zhì)粒pNBT36用Z>a III 和&c I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分析，再 使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了大約2873 bp的片段，該片段含
有P呵L4199/P呵Q(sc/PcrylIIA三聯(lián)啟動(dòng)子。如上所述將pNBT13載體片段和
PamyL4199/PamyQ(sc/PcrymA片段連接，并且如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 SURE⑧細(xì)胞，在2XYT氨千青霉素平板上在37。C選擇氨節(jié)青霉素抗性。使 用QIAPREP 8 Miniprep Kit從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,將所述質(zhì)粒 DNA用I消化，并且通過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了分 析。將一個(gè)具有大約4974 bp和4294 bp的預(yù)期限制片^R的質(zhì)粒命名為 pMDT100 (圖27)。
將質(zhì)粒pMDT100通過用5ba I的消化線性化。按照Anagnostopoulos和 Spizizen， 1961,見上文的方法用所述線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4, 并且在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。通過將菌落 貼片到TBAB牛奶平板上并為澄清區(qū)域評(píng)分來篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的蛋 白酶生產(chǎn)，還通過將菌落貼片到TBAB新霉素平板上在37。C篩選其新霉素 敏感性以確認(rèn)DNA通過雙交換插入了枯草芽孢桿菌染色體的amj;五基因中。 鑒定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、產(chǎn)蛋白酶的轉(zhuǎn)化體(具有在amj必基因座 插入的PamyL4i99/P短共有amyQ/PcrymA/co^/" stab/a;^//盒)并將其命名為枯草芽孢 桿菌MDT130。
實(shí)施例21:構(gòu)建pMDT174
將質(zhì)粒pMDT100和pGME080用戶ac I和Sac I消化。將消化的質(zhì)粒通 過在TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，并且使用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化了含有修飾型穩(wěn)定物的pGME080的大約566 bp 的片段和pMDT100的大約8727 bp的載體片段。如上所述使用T4 DNA連 接酶將純化的片段連接起來，并且將大腸桿菌XL10-GOLD Ultracompetent 細(xì)胞用所述連接物按照制造商的說明書轉(zhuǎn)化。使用BIOROBOT 9600從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體純化了質(zhì)粒DNA，并且通過用F肌4HI消化繼之以在TBE緩沖液 中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行了測(cè)試。預(yù)期對(duì)期望的連接產(chǎn)物進(jìn)行消化將產(chǎn)生 大約36個(gè)片段，包括一個(gè)預(yù)期不從pMDT100產(chǎn)生的大約912 bp的片段， 并且排除一個(gè)預(yù)期從pMDT100產(chǎn)生的大約1045 bp的片段。將一個(gè)具有這 樣的限制圖型的質(zhì)粒命名為pMDT174 (圖28)，其含有包含三聯(lián)啟動(dòng)子的 a^7/表達(dá)盒，及修飾型c^//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列(P呵L4^9/P短共有 amyQ/PcryiiiA/mod. c^y/7Z4 stab)。
將質(zhì)粒pMDT174通過用Sea I消化來線性化。按照Anagnostopoulos和 Spizizen, 1961,見上文的方法用所述線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4， 并且在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗性。通過將菌落 貼片到TBAB牛奶平板上并為澄清區(qū)域評(píng)分來篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的蛋 白酶生產(chǎn)，還通過將菌落貼片到TBAB新霉素平板上在37°C篩選其新霉素 敏感性以確認(rèn)DNA通過雙交換插入了枯草芽孢桿菌染色體的基因中。 鑒定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、產(chǎn)蛋白酶的轉(zhuǎn)化體(具有在"my五基因座
插入的PamyL4199/P短共有amyQ/PcrylIlA/mod. C^y/7L4 Stab/a; r//盒)并將其命名為沖古草
芽孢桿菌MDT131。
實(shí)施例22:評(píng)估枯草芽孢桿菌中的三聯(lián)啟動(dòng)子變體
將質(zhì)粒pMDT100和pMDT174通過用5Wc I消化來線性化。按照 Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，見上文的方法用所述線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌168A4,并且在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯 霉素抗性。通過將菌落貼片到TBAB牛奶平板上并為澄清區(qū)域評(píng)分來篩選氯 霉素抗性轉(zhuǎn)化體的蛋白酶生產(chǎn)，還通過將菌落貼片到TBAB新霉素平板上在 37°C篩選其新霉素敏感性以確認(rèn)DNA通過雙交換插入了枯草芽孢桿菌染色 體的am;^基因中。鑒定了氯霉素抗性、新霉素敏感性、產(chǎn)蛋白酶的轉(zhuǎn)化體；
將一個(gè)源自pMDT100的轉(zhuǎn)化體(具有在基因座插入的P抓yL4!99/P短共有
amyQ/PcryiiiA/c7//Z4 stab/a/^i/盒)命名為枯草芽孢桿菌MDT130,并且將一個(gè)源
自pMDTl74的轉(zhuǎn)化體(具有在"m)必基因座插入的P呵L4199/P短共有呵Q/PcrylIIA/
mod. cry//" stab/a^7/盒)命名為枯草芽孢桿菌MDT131。
按照Pitcher等，1989,見上文的方法從枯草芽孢桿菌菌林MDT130和 MDT131分離了基因組DNA。將枯草芽孢桿菌A164A5 (美國(guó)專利No.5,891,701)用所述基因組DNA按照Anagnostopoulos和Spizizen, 1961,見上 文的方法轉(zhuǎn)化，并且在TBAB氯霉素平板上在37。C選擇轉(zhuǎn)化體的氯霉素抗 性。將一個(gè)源自MDT130 DNA的轉(zhuǎn)化體(具有在基因座插入的 P,L4i99/P短共有呵Q/PcryiiiA/co^/" stab/q^T7盒)命名為MDT134;將一個(gè)源自 MDT131 DNA的轉(zhuǎn)化體(具有在基因座插入的P呵L4,99/P短共有 amyQ/PcryiiiA/mod. C7y/tt4 stab/a; r//盒)命名為MDT135。
將枯草芽孢桿菌菌林MDT134和MDT135在含有50 ml PS-1培養(yǎng)基的 250 ml搖瓶中在37。C培養(yǎng)， 一式三份。在第3天、第4天和第5天取樣， 并且如上所述測(cè)定了整體培養(yǎng)液的蛋白酶活性。
結(jié)果示于圖29。所述結(jié)果證明，從包含修飾型co^/Z4mRNA加工/穩(wěn)定 化序列的三重啟動(dòng)子構(gòu)建體表達(dá)蛋白酶的枯草芽孢桿菌MDT135，.產(chǎn)生了比 枯草芽孢桿菌MDT134更多的蛋白酶，在枯草芽孢桿菌MDT134中蛋白酶 是從包含未修飾的co^/" mRNA加工/穩(wěn)定化序列的三重啟動(dòng)子構(gòu)建體表達(dá) 的。與枯草芽孢桿菌MDT134相比，枯草芽孢桿菌MDT135在3天之后提 供了 87%的增加，在4天之后提供了 100%的增加，并且在5天之后提供了 58%的增力口。
在本文描述并且提出權(quán)利要求的發(fā)明的范圍不受本文公開的多個(gè)具體 方面的限制，因?yàn)檫@些方面旨在例舉本發(fā)明的幾個(gè)方面。本發(fā)明的范圍意圖 包括任何等同的方面。事實(shí)上，除了本文明示和描述的那些之外，本領(lǐng)域技 術(shù)人員根據(jù)前文的描述顯然能想到本發(fā)明的各種修改形式。隨附權(quán)利要求書 的范圍也意圖包括這樣的修改形式。如有沖突，當(dāng)以包括定義在內(nèi)的本申請(qǐng) 公開內(nèi)容為準(zhǔn)。
本申請(qǐng)引用了多篇參考文獻(xiàn)，在此通過引用將它們的公開內(nèi)容完全并入 本申請(qǐng)。
權(quán)利要求
1.一種在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼所述具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高表達(dá)；(b)從培養(yǎng)基分離具有生物學(xué)活性的多肽。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列獲得自 cr_y//Z4 mRNA加工/穩(wěn)定化序列或SP82 mRNA加工/穩(wěn)定^<序列。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列是SEQ ID NO: 6或其保留mRNA穩(wěn)定化功能的部分。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))拷 貝的核酸構(gòu)建體。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含選擇標(biāo)記基因。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞不含外源選擇標(biāo)記基因。
8. —種包含核酸構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含與編碼具有生物 學(xué)活性的多肽的多核苦酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)，和位于所述啟動(dòng)子 區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苦酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn) 上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定 化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更 高表達(dá)。
9. 權(quán)利要求8的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列獲 得自co;//" mRNA加工/穩(wěn)定化序列或SP82 mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
10. 權(quán)利要求8的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列 是SEQ ID NO: 6或其保留mRNA穩(wěn)定化功能的部分。
11. 權(quán)利要求8的細(xì)菌細(xì)胞，其是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求8的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))拷貝 的核酸構(gòu)建體。
13. 權(quán)利要求8的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體還包含選擇標(biāo)記基因。
14. 權(quán)利要求8的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞不含外源選擇標(biāo)記基因。
15. —種用于產(chǎn)生不含選擇標(biāo)記的細(xì)菌細(xì)胞突變體的方法，包括缺失細(xì) 菌細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因，其中所述細(xì)菌細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體 包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子 區(qū)，和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核香酸 序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其中所述修飾 型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所 述多核普酸序列的更高表達(dá)。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列獲得 自mRNA加工/穩(wěn)定化序列或SP82 mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)、定化序列是 SEQIDNO: 6或其保留mRNA穩(wěn)定化功能的部分。
18. 權(quán)利要求15的方法，其所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))拷貝 的核酸構(gòu)建體。
20. 權(quán)利要求15的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含選擇標(biāo)記基因。
21. 權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞不含外源選擇標(biāo)記基因。
22. —種通過權(quán)利要求15的方法獲得的不含選擇標(biāo)記的芽孢桿菌屬細(xì) 胞突變體。
23. —種用于獲得細(xì)菌宿主細(xì)胞的方法，包括向細(xì)菌宿主細(xì)^^導(dǎo)入核酸 構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列可 操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)，和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活 性的多肽的多核香酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化 序列，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn) 定化序列相比促使所述多核苷S吏序列的更高表達(dá)。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列獲得 自co^/" mRNA加工/穩(wěn)定化序列或SP82 mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列是 SEQ ID NO: 6或其保留mRNA穩(wěn)定化功能的部分。
26. 權(quán)利要求23的方法，其所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
27. —種包含修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列的分離的核酸，其中所述 修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列經(jīng)過重組修飾包含至少一個(gè)額外拷貝的 Shine-Dalgamo序列，并且其中在將所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與啟 動(dòng)子區(qū)和編碼生物學(xué)物質(zhì)的多核苷酸可操作地連接時(shí)，所述修-飾型mRNA 加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸 序列的更高表達(dá)。
28. 權(quán)利要求27的分離的核酸，其中所述飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列 獲得自mRNA加工/穩(wěn)定化序列或SP82 mRNA加工/穩(wěn)定化序列。
29. 權(quán)利要求27的分離的核酸，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序 列是SEQ ID NO: 6或其保留mRNA穩(wěn)定化功能的部分。
30. —種核酸構(gòu)建體，其包含與編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸 可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)和權(quán)利要求27的包含修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序 列的核酸，所述核酸位于啟動(dòng)子區(qū)的下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽 的多核苷酸核糖體結(jié)合位點(diǎn)的上游。
31. —種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求30的核酸構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼所述多肽的多核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子區(qū)，和位于所述啟動(dòng)子區(qū)下游和所述編碼具有生物學(xué)活性的多肽的多核苷酸序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其中所述修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列與未修飾的mRNA加工/穩(wěn)定化序列相比促使所述多核苷酸序列的更高的表達(dá)；和(b)從培養(yǎng)基分離具有生物學(xué)活性的多肽。本發(fā)明還涉及這樣的修飾型mRNA加工/穩(wěn)定化序列，核酸構(gòu)建體，和細(xì)菌宿主細(xì)胞，以及獲得這些細(xì)菌宿主細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N15/75GK101611145SQ200780051650
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者威廉·威德納, 格洛麗亞·埃里克森, 邁克爾·托馬斯 申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司