專利名稱：來源于細菌的丙酮酸脫羧酶(pdc)基因的克隆和測序及其用途的制作方法
相關資料本申請要求下列美國申請的優(yōu)先權名稱為“活性胃八疊球菌丙酮酸脫羧酶在重組巨大芽胞桿菌中的高水平產生”的美國臨時申請?zhí)?0/288,638；名稱為“來源于耐酸性厭氧革蘭氏陽性菌胃八疊球菌的丙酮酸脫羧酶的克隆，表達，和表征”的美國臨時申請?zhí)?0/,288,671；名稱為“巴氏醋桿菌丙酮酸脫羧酶生化，遺傳，和生理性質”的美國臨時申請?zhí)?0/288,698；名稱為“來源于醋酸菌巴氏醋桿菌的丙酮酸脫羧酶的生物化學及生物物理特征”的美國臨時申請?zhí)?0/288,622；名稱為“丙酮酸脫羧酶一種利用巴氏醋桿菌氧化代謝乳酸的重要酶”的美國臨時申請?zhí)?0/288,699；以上全部申請都是在2001年5月4日提交的，并全文引入此處作為參考。本說明書自始至終引用的所有專利，專利申請，和參考文獻的內容都全文引入此處作為參考。
政府出資的研究這項工作由U.S.Department of Energy’s National RenewableEnergy Laboratory(ZDH-9-29009-04)，Energy BiosciencesProgram(FG02-96ER20222)，和Florida Agricultural ExperimentStation的基金部分資助。
背景技術：
很多環(huán)境和社會效益都是由于使用從植物材料獲得的可再生燃料代替基于石油的汽車燃料而產生的(Lynd等，(1991)Science2511318-1323；Olson等，(1996)EnzymeMicrob.Technol.181-17；Wyman等，(1995)Amer.Chem.Soc.Symp.618272-290)。美國每年要燃燒掉1200億加侖的汽車燃料，大約相當于進口石油的總量。作為一種可再生的替代燃料，乙醇的開發(fā)可消除美國對進口石油的依賴，改善環(huán)境，并提供新的就業(yè)機會(Sheehan，(1994)ACSSymposium Series No.566，ACS Press，pp 1-53)。
理論上，解決用于汽車燃料的進口石油問題的方法似乎十分簡單。除了使用石油這種有限的資源外，還可通過使植物材料發(fā)酵而有效生產可再生的資源——乙醇。事實上，巴西已經證實了生產乙醇的可行性，以及20多年來，乙醇作為一種主要汽車燃料的使用。同樣，美國每年要生產超過12億加侖的燃料乙醇。目前，燃料乙醇是利用啤酒糖酵母或運動發(fā)酵單胞菌從玉米淀粉或蔗糖生產的。然而，這兩種糖源都不能供給可替換基于石油的汽車燃料所需的量。此外，蔗糖和玉米淀粉屬于相對較貴的起始材料，并具有作為食品的競爭用途。
此外，這些糖底物僅代表植物中全部碳水化合物的一部分。事實上，植物中的絕大部分碳水化合物都是以木質纖維素，即一種含有纖維素，半纖維素，果膠，和木質素的復合結構的聚合物形式存在的。木質纖維素存在于植物的莖，葉，皮，殼，和穗中。這些聚合物水解后釋放出一種含有葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，以及阿拉伯糖的中性糖混合物。目前還沒有天然的生物體能夠迅速而且有效地把所有這些糖代謝成乙醇。
然而，為了努力開發(fā)這種底物來源，Gulf Oil公司研究出一種利用以酵母為基礎的稱作同時糖化和發(fā)酵(SSF)的過程從纖維素生產乙醇的方法(Gauss等，(1976)U.S.P.N.3,990,944)。把真菌纖維素酶制品和酵母加入到單個容器中的纖維素底物勻漿中。乙醇在纖維素水解的同時產生。然而，Gulf’s SSF過程具有某些缺點。例如，酵母的細胞周期時間相對較長(24-36小時)，而且它們不能使復合糖發(fā)酵。此外，還不得不加入真菌纖維素酶，而直到目前為止，這樣做仍然被認為是成本太高，不適于大規(guī)模的生物乙醇生產過程(Himmel等，(1997)Amer.Chem.Soc.pp.2-45；Ingram等，(1987)Appl.Environ.Microbiol.532420-2425；Okamoto等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.42563-568；Philippidis，G.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp.188-217；Saito等，(1990)J.Ferment.Bioeng.69282-286；Sheehan，J.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp1-52；Su等，(1993)Biotechnol.Lett.159779-984)。
此外，利用其它生物體生產乙醇也很難，這是因為丙酮酸脫羧酶(PDC)，這種對于發(fā)酵乙醇而言很重要的酶，只在植物，酵母和真菌中普遍存在；很少存在于細菌中，在動物中則根本沒有(9，25)。
發(fā)明概述進行乙醇發(fā)酵的廉價酶方法的發(fā)展對于改進底物利用效率并使發(fā)酵過程更經濟實用而言具有巨大的潛力。因此，研究酶和生物催化劑將十分有益，所述生物催化劑可生產這種酶，用于使復合糖有效解聚，隨后迅速把糖發(fā)酵成醇。
某些微生物，如革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都可產生許多發(fā)酵酶，它們能催化纖維素和半纖維素解聚，從而產生可發(fā)酵的糖，糖轉化成丙酮酸，底物丙酮酸轉化成乙醛，最終，底物乙醛轉化成乙醇。然而，這種生物很少會以最理想水平產生所有必需的酶。
因此，本發(fā)明提供編碼丙酮酸脫羧酶的基因，它可在各種生物體中高水平表達。因此當在生物體中表達，或與生物體一起培養(yǎng)時，產生乙醇發(fā)酵所需的重要酶，從而產生較高水平的乙醇。這些酶，例如丙酮酸脫羧酶(PDC)，可單獨或與醇脫氫酶(ADH)聯合用作具有所需活性的粗提物，或用作純化的組合物。
此外，生物催化劑，優(yōu)選重組細菌，更優(yōu)選產乙醇(ethanologenic)細菌，可被工程化表達這些酶活性的一種或多種，具體而言，它的量足以使糖發(fā)酵。這種生物催化劑適于有效降解復合糖，隨后利用稱作同時糖化和發(fā)酵(SSF)過程發(fā)酵成醇。
本發(fā)明至少部分是以發(fā)現編碼用于在細菌中發(fā)酵乙醇的重要酶的基因為基礎的。具體而言，已經鑒定了棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，和胃八疊球菌的pdc基因。這些基因已經被確定編碼具有極高的丙酮酸脫羧酶活性，底物親和性，例如對丙酮酸的親和性，和熱穩(wěn)定性，以及在不同pH值下的極高的活性的丙酮酸脫羧酶。此外，本發(fā)明的pdc基因還具有在各種生物體中高水平表達的密碼子使用。
因此，一方面，本發(fā)明提供編碼丙酮酸脫羧酶多肽(PDC)的分離核酸分子及其生物活性部分，以及適于用作檢測編碼PDC的核酸的引物或雜交探針的核酸片段。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明的丙酮酸脫羧酶(pdc)核酸分子是與SEQ ID NO1，3，5所示的核苷酸序列(如，當與核苷酸序列全長進行比較時)具有至少約50％，60％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或更多同一性的核酸分子，或其互補序列。
在具體實施方案中，所述分離核酸分子含有SEQ ID NO1，3，5所示的核苷酸序列，或其互補序列。
在另一實施方案中，pdc核酸分子含有編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2，4或6的氨基酸序列足夠同源。在具體實施方案中，pdc核酸分子含有編碼(PDC)多肽的核苷酸序列，所述多肽與SEQ ID NO2，4和6所示的氨基酸序列(例如，當與氨基酸序列全長進行比較時)具有至少約50％，60％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或更多的同一性。
在其中一個具體實施方案中，分離的核酸分子編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的棕櫚發(fā)酵細菌丙酮酸脫羧酶的氨基酸序列。
在另一具體實施方案中，分離的核酸分子編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的巴氏醋桿菌丙酮酸脫羧酶的氨基酸序列。
在另一具體實施方案中，分離的核酸分子編碼具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的胃八疊球菌丙酮酸脫羧酶的氨基酸序列。
在另一具體實施方案中，所述核酸分子的長度至少約為1600個核苷酸，并編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽(如這里所述)。
在更具體的實施方案中，本發(fā)明提供一種編碼來源于棕櫚發(fā)酵細菌的pdc基因的質粒pJAM3440，所述質粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC______。在相關實施方案中，本發(fā)明提供一種編碼來源于巴氏醋桿菌的pdc基因的質粒pJAM304，所述質粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC______。在另一相關實施方案中，本發(fā)明提供一種編碼來源于胃八疊球菌的pdc基因的質粒pJAM419，所述質粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC______。
本發(fā)明另一實施方案提供核酸分子，優(yōu)選丙酮酸脫羧酶的核酸分子，它可相關于編碼非-丙酮酸脫羧酶(PDC)多肽的核酸分子而特異性檢測丙酮酸脫羧酶的核酸分子(即，pdc基因)。例如，在其中一個實施方案中，這種核酸分子的長度至少約為50，60，70，80，90，100，150，200，300，400，500，500-1000，1000-1500，1500-1500或更多個核苷酸，和/或在嚴格條件下與含有SEQ ID NO1，3，或5所示核苷酸序列的核酸分子，或其互補序列雜交。應當了解，核酸分子的長度可以是用上面所列的其中一個數值作為核苷酸數的下限，用另外一個數值作為核苷酸數的上限，例如，分子的長度可以為60-80，300-1000，或150-400個核苷酸。
在具體實施方案中，核酸分子的長度至少約為15個(例如，連續(xù)的)核苷酸，并在嚴格條件下與SEQ ID NO1，3，或5的核苷酸序列雜交。因此，本發(fā)明提供一種使用前述核酸檢測是否存在本發(fā)明pdc核酸的方法。
在其它具體實施方案中，核酸分子編碼含有SEQ ID NO2，4，或6所示氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所述核酸在嚴格條件下分別與含有SEQ ID NO1，3，或5的核酸分子雜交。
在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子位于載體中，而且可與替代啟動子和/或編碼異源多肽的附加核酸序列可操作性連接。
在具體實施方案中，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明核酸分子的宿主細胞，例如，包含在載體中或穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中。
在其中一個具體實施方案中，所述宿主細胞含有編碼來源于細菌細胞，如棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，或胃八疊球菌的丙酮酸脫羧酶的異源核酸序列，如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示。
在另一實施方案中，含有pdc基因的宿主細胞可以是產乙醇的，例如，天然產乙醇和/或進一步含有編碼醇脫氫酶，葡聚糖酶，分泌酶(secretase)，或其組合的產乙醇基因。在相關實施方案中，該宿主細胞適于從糖發(fā)酵乙醇。在具體實施方案中，該宿主細胞是重組的產乙醇宿主細胞，含有編碼SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示PDC的異源核酸。異源核酸可受到外源替代啟動子的控制。
上述宿主細胞可以是革蘭氏陰性菌細胞或革蘭氏陽性菌細胞。
本發(fā)明的革蘭氏陰性菌宿主細胞是，例如，葡糖桿菌，根瘤菌，慢生根瘤菌，產堿菌，紅細菌，紅球菌，固氮螺菌，紅螺菌，鞘氨醇單胞菌，伯克霍爾德氏菌，脫硫單胞菌，Gepspirillum，琥珀酸單胞菌，氣單胞菌，希瓦氏菌，Halochromatium，檸檬酸桿菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，發(fā)酵單胞菌，發(fā)酵細菌，或醋桿菌。
本發(fā)明的革蘭氏陽性菌宿主細胞是，例如，絲狀桿菌，酸桿菌，擬桿菌，鞘氨醇桿菌，放線菌，棒桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，丙酸桿菌，雙岐桿菌，芽孢桿菌，Geobacillus，類芽孢桿菌，硫化桿菌，梭菌，Anaerobacter，真桿菌，鏈球菌，乳桿菌，明串珠菌，腸球菌，乳球菌，Thermobifida，纖維單胞菌，或八疊球菌。
另一方面，本發(fā)明提供一種分離多肽，它的氨基酸序列與SEQ IDNO2，4或6所示的氨基酸序列(例如，當與氨基酸序列的全長比較時)至少具有約50％，60％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或更多的同一性。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明的分離多肽具有SEQ ID NO2，4，或6的氨基酸序列。
在相關實施方案中，所述分離多肽具有丙酮酸脫羧酶活性。本發(fā)明的丙酮酸脫羧酶是為具有改進的活性，例如，丙酮酸脫羧酶活性，改進的密碼子使用，底物(例如，丙酮酸)親和性，熱穩(wěn)定性，和/或在特定pH值下的活性而選擇的。本發(fā)明這種丙酮酸脫羧酶可以是改變過的或嵌合的多肽，從而獲得上述任何一種性質。此外，所述多肽還可進一步含有異源氨基酸，例如，用于純化或檢測的免疫標記。
另一方面，本發(fā)明提供一種抗體，它可選擇性結合本發(fā)明的多肽(或其片段)，例如，SEQ ID NO2，4，或6所示的丙酮酸脫羧酶。因此，本發(fā)明提供一種使用這種抗體檢測本發(fā)明丙酮酸脫羧酶的方法。
另一方面，本發(fā)明提供一種在適宜培養(yǎng)條件下，通過在宿主細胞中表達本發(fā)明上述其中一種核酸，從而產生本發(fā)明丙酮酸脫羧酶的方法。也可對核酸進行改變或使其突變，從而改進核酸的密碼子使用或所編碼產物的脫羧酶活性(例如，熱穩(wěn)定性，底物親和性，或在不同pH值下的活性)。
另一方面，本發(fā)明提供一種生產乙醛的方法，即在以充分水平表達丙酮酸脫羧酶的條件下培養(yǎng)上述其中一種宿主，這樣就可從丙酮酸生產乙醛。在相關實施方案中，生產乙醛的方法是在從丙酮酸生產乙醛的條件下，接觸從上述宿主細胞獲得的細胞溶解產物而進行的。因此，本發(fā)明提供具有改進的脫羧酶活性，及具有例如熱穩(wěn)定性，在不同pH下的活性，和/或極高的底物親和性的酶提取物。
另一方面，本發(fā)明提供一種生產乙醇的方法，即在以充分水平表達丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的條件下培養(yǎng)上述宿主細胞，使乙醇作為主要的發(fā)酵產物產生。
另一方面，本發(fā)明提供一種選擇具有改進的脫羧酶活性(例如，改進的丙酮酸親和性，熱穩(wěn)定性，在不同pH值下的活性)的丙酮酸脫羧酶的方法，包括把丙酮酸脫羧酶的氨基酸序列與SEQ ID NO2，SEQID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列進行比較；改變丙酮酸脫羧酶的至少一個氨基酸殘基，使其與SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的相應氨基酸殘基具有同一性，這樣就可獲得具有改進的丙酮酸脫羧酶活性的多肽。
在相關實施方案中，本發(fā)明提供一種選擇在受體宿主細胞中表達的丙酮酸脫羧酶的方法，即把編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列與SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的核酸序列進行比較；改變編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的至少一個密碼子，使其與SEQ ID NO1，SEQID NO3，或SEQ ID NO5的相應密碼子具有同一性，這樣就可在所述宿主細胞中獲得所述改變過的、編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的表達的改進。
在另一相關實施方案中，本發(fā)明提供一種選擇在受體宿主細胞中的表達改進的丙酮酸脫羧酶的方法，即把編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列與該受體宿主細胞的密碼子使用進行比較，改變所述編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的至少一個密碼子，使其相應于所述受體宿主細胞的密碼子使用，從而在所述宿主細胞中獲得所述改變過的、編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的表達的改進。
在另一相關實施方案中，本發(fā)明提供一種選擇在受體宿主細胞中的表達改進的丙酮酸脫羧酶的方法，即把編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列與該受體宿主細胞的密碼子使用進行比較；改變所述受體宿主細胞，以便重組產生至少一個相應于編碼所述丙酮酸脫羧酶的核酸的密碼子的tRNA，從而在所述宿主細胞中獲得所述編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的表達的改進。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點可從下列詳細描述及權利要求很明顯地看出。
附圖簡述

圖1表示棕櫚發(fā)酵細菌pdc基因的圖示。質粒pJAM3400攜帶一個6-kb平端的，棕櫚發(fā)酵細菌基因組DNA的BamHI片段，并連接到質粒載體pLITMUS28中。其余質粒來源于pJAM3400，并用于分析含pdc基因的一個2.9kb區(qū)的DNA序列。質粒pJAM3440用于在重組大腸埃希氏菌中生產棕櫚發(fā)酵細菌PDC多肽。箭頭表示pdc基因轉錄的方向。
圖2表示巴氏醋桿菌pdc基因的圖示。質粒pJAM301攜帶一個連接到質粒載體pLITMUS28 XhoI位點中的，6,337-bp的巴氏醋桿菌基因組DNA的AatII片段。由AatII和XhoI產生的3’-和5’-突出端在連接之前用Vent DNA聚合酶加工成平端。其余質粒來源于pJAM301，并用于DNA序列分析。質粒pJAM304用于在重組大腸埃希氏菌中生產巴氏醋桿菌PDC的蛋白。箭頭表示推斷的ORF的轉錄及翻譯方向。
圖3表示胃八疊球菌pdc基因的圖示，為了對pdc基因座進行測序和表征而生產的各種質粒以及含有pdc可讀框的質粒pJAM413，pJAM419，和pJAM418都適于在細菌中高水平表達pdc基因。
圖4表示棕櫚發(fā)酵細菌的pdc基因和基因產物的核酸序列(SEQ IDNO1)及氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖5表示巴氏醋桿菌的pdc基因和基因產物的核酸序列(SEQ IDNO3)及氨基酸序列(SEQ ID NO4)。在pdc核酸序列中，推定啟動子用大寫字母突出顯示，并在下面加雙下劃線，-35和-10啟動子的共有序列則直接標注在PDC預測序列的下面。DNA序列上的箭頭表示轉錄起始位點。加下劃線的堿基表示“Shine-Dalgarno”核糖體結合位點。星號表示轉錄終止密碼子。DNA序列下的箭頭表示莖-環(huán)結構，它可促進ρ-非依賴性轉錄終止。
圖6表示胃八疊球菌的pdc基因和基因產物的核酸序列(SEQ IDNO5)及氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖7表示描述不同細菌PDC酶的熱穩(wěn)定性的曲線圖。在指定溫度下，在含有1mM TPP和ImM MgCl2的pH5.0的50mM檸檬酸鈉緩沖液中，將‘重組的’Zmo(●)，Zpa(■)，Apa(○)和Sve(□)PDC多肽預溫育30分鐘，冷卻至0℃，然后于25℃時，在相同的緩沖液中測定殘留的活性。100％是0℃預溫育后的活性。SvePDC是從重組大腸埃希氏菌BL21-CodonPlus-RIL(pJAM419)純化的。
圖8表示描述pH值對細菌PDC酶活性的作用的曲線圖?！亟M的’ZpaPDC(●)和ApaPDC(■)。‘天然的’ZpaPDC(○)和ApaPDC(□)。25℃時，在pH 4.0-5.0的50mM檸檬酸鈉緩沖液和pH 5.5-8.0的50mM磷酸鈉緩沖液中測量活性。100％是最佳pH值下的活性。
圖9表示棕櫚發(fā)酵細菌的推斷PDC多肽(SEQ ID NO2)與所選擇的PDC多肽，即，運動發(fā)酵單胞菌(SEQ ID NO8)，巴氏醋桿菌(SEQID NO4)，胃八疊球菌(SEQ ID NO6)，玉米(SEQ ID NO9)，和啤酒糖酵母(SEQ ID NO10)的多個氨基酸序列比對。功能上保守的(黑色突出顯示區(qū))和半-保守的(灰色突出顯示區(qū))氨基酸殘基。序列比對中引入的空位(--)。0.4nm Mg2+及酵母和運動發(fā)酵單胞菌PDC多肽的TPP結合位點內的殘基(*)。與丙酮酰胺形成氫鍵的酵母PDC1殘基(■)。加雙下劃線的殘基是TPP-依賴酶中的保守殘基。縮寫詞和GenBank或SwissProt登記號Zpa，棕櫚發(fā)酵細菌，AF474145；Apa，巴氏醋桿菌，AR368435；Sce，啤酒糖酵母，P06169；胃八疊球菌，AF354297；Zma，玉米，P28516；Zmo，運動發(fā)酵單胞菌，P06672。
發(fā)明詳述為了更清楚地理解本發(fā)明的全部范圍，給出下列定義。
I.定義此處所用術語“醇脫氫酶”包括能夠把乙醛轉化成醇，優(yōu)選乙醇的酶。
術語“嵌合”包括突變或改變過的PDC，其中利用基因工程方法，用PDC中的相應結構域對另一PDC的整個結構域進行工程化(融合，交換)。
術語“密碼子使用”包括分析被考慮在受體宿主生物(或其無細胞的提取物)中表達的給定核酸是否存在或“使用”宿主生物所需的(有利的是充足水平的)、用于把核酸翻譯成相應多肽的某些“密碼子。以這種觀察結果為基礎，受體宿主可用任何所需的密碼子重組補充?？蛇x擇性地，其它宿主可用極高的密碼子使用選擇，或把所述核酸(例如，通過引入沉默突變)改變成不再含有限制密碼子。
術語“脫羧酶活性”包括多肽把丙酮酸酶促轉化成乙醛的能力。通常，所選多肽的活性包括與所產生多肽有關的全部酶活性，包括，例如，酶的極高的底物親和性，熱穩(wěn)定性，在不同pH值下的穩(wěn)定性，或這些性質的組合。
術語“來源于”包括從指定來源(完全或部分)分離多核苷酸的片段。該術語包括，例如，從與指定多核苷酸來源有關的序列，或以它們?yōu)榛A直接克隆，PCR擴增，或人工合成。
術語“產乙醇”包括微生物從碳水化合物生產主要的發(fā)酵產物乙醇的能力。該術語包括天然存在的產乙醇生物，具有天然存在或誘導的突變的產乙醇生物，和已經被基因工程改造過的產乙醇生物。
術語“發(fā)酵”包括從碳水化合物生產發(fā)酵的主要產物乙醇的酶過程(例如，細胞或無細胞的，例如，溶解產物或純化的多肽混合物)。
術語“參與產乙醇的基因”包括能夠賦予細胞產乙醇特性或能夠改進細胞產乙醇任一方面，如，底物攝取，底物加工，乙醇耐受等的任何基因。參與產乙醇的基因是，例如，醇脫氫酶，丙酮酸脫羧酶，分泌多肽，和多糖酶的基因，這些基因或它們的同源物可來源于任何適宜的生物體。
術語“葡聚糖酶”包括能夠催化任何相連糖部分的降解或解聚的多肽，所述糖部分為，例如，二糖，三糖，低聚糖，包括，復合碳水化合物，這里也稱作復合糖，例如，纖維寡糖和木質纖維素，木質纖維素包括纖維素，半纖維素，和果膠。該術語包括纖維素酶，如葡聚糖酶，優(yōu)選包括內葡聚糖酶，此外還包括，例如，外葡聚糖酶，β-糖苷酶，纖維生物水解酶，內-1，4-β-木聚糖酶，β-木糖苷酶，α-葡糖醛酸糖苷酶，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶，乙酰木聚糖酯酶，α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶，支鏈淀粉酶，β-葡聚糖酶，半纖維素，阿拉伯糖苷酶，mannanase，果膠酸鹽水解酶，果膠酸鹽裂合酶或這些纖維素酶的任意組合。
術語“革蘭氏陰性菌細胞”包括該術語本領域公認的定義。通常，革蘭氏陰性菌包括葡糖桿菌，根瘤菌，慢生根瘤菌，產堿菌，紅細菌，紅球菌，固氮螺菌，紅螺菌，鞘氨醇單胞菌，伯克霍爾德氏菌，脫硫單胞菌，Gepspirillum，琥珀酸單胞菌，氣單胞菌，希瓦氏菌，Halochromatium，檸檬酸桿菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，發(fā)酵單胞菌(例如，運動發(fā)酵單胞菌)，發(fā)酵細菌(例如棕櫚發(fā)酵細菌)，和醋桿菌(例如，巴氏醋桿菌)。
術語“革蘭氏陽性菌”包括該術語本領域公認的定義。通常，革蘭氏陽性菌包括絲狀桿菌，酸桿菌，擬桿菌，鞘氨醇桿菌，放線菌，棒桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，丙酸桿菌，雙岐桿菌，芽孢桿菌，Geobacillus，類芽孢桿菌，硫化桿菌，梭菌，Anaerobacter，真桿菌，鏈球菌，乳桿菌，明串珠菌，腸球菌，乳球菌，Thermobifida，纖維單胞菌，八疊球菌(例如，胃八疊球菌)。
術語“異源多肽”包括由任何來源，例如，真核生物，原核生物，病毒的異源核酸，或合成的核酸片段編碼的多肽或其一部分。
術語“同源”是指第一個氨基酸或核苷酸序列與第二個氨基酸或核苷酸序列相比，含有充足或最少數目的相同或相等的氨基酸殘基或核苷酸，例如，具有相似側鏈的氨基酸殘基，這樣才能使第一和第二個氨基酸或核苷酸序列共有共同的結構域和/或共同的功能活性。
術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”包括適于遺傳操作的細胞，例如，可摻入異源多核苷酸序列，例如，可被轉染。所述細胞可以是微生物或高級真核生物的細胞，如動物細胞或植物細胞。該術語包括最初轉染的細胞的子代。在具體實施方案中，所述細胞是細菌細胞，例如，革蘭氏陰性菌細胞或革蘭氏陽性菌細胞。具體而言，術語重組宿主細胞包括已經被選擇或改造成具有某些所希望的性質并適于利用本發(fā)明的組合物和方法進一步修飾的細胞。
術語“分離的多肽”(例如，分離的或純化的生物合成酶)基本上沒有來源于衍生所述多肽的微生物的細胞物質或其它污染多肽，或基本上沒有化學合成時的化學前體或其它化學物質。
術語“核酸”包括核酸分子，例如含有編碼多肽的可讀框的多核苷酸，還可進一步包括非-編碼調節(jié)序列，和內含子。此外，該術語還包括作圖于功能基因座的一個或多個基因。此外，該術語包括用于選擇目的的特異基因。該基因對于宿主細胞而言可以是內源性的，或被重組引入到宿主細胞中，例如，作為游離維持的質?；蚍€(wěn)定整合到基因組中的質粒(或其片段)。在其中一個實施方案中，多核苷酸片段的基因涉及碳水化合物生物轉化成乙醇中的至少一個步驟。因此，該術語包括編碼多肽的任何基因，所述多肽包括丙酮酸脫羧酶，醇脫氫酶，分泌多肽，或多糖酶，例如，葡聚糖酶，或其組合。
術語“突變核酸分子”或“突變基因”是指所含核苷酸序列包括至少一次改變(例如，取代，插入，缺失)的核酸分子或基因，這樣由所述突變體編碼的多肽就會顯示出不同于由野生型核酸分子或基因編碼的多肽的活性。
術語“可操作性連接”是指目標核酸分子或基因的核苷酸序列以允許表達核苷酸序列(例如，增強的，增加的，組成型，基礎的，減弱的，降低的或阻抑的表達)，優(yōu)選表達由該核苷酸序列編碼的基因產物(例如，當重組核酸分子包含在重組載體中時，如此處所定義的，或被引入到微生物中時)表達的方式與調節(jié)序列連接。
術語“pH”包括本領域公認的含義。通常，本發(fā)明的丙酮酸脫羧酶在約pH 4-8，更優(yōu)選約pH 5-7，甚至更優(yōu)選約pH 5.5-6.0時顯示脫羧酶活性。
術語“丙酮酸脫羧酶”包括這里所述能夠把丙酮酸脫羧成乙醛的酶。通常，術語“pdc”是指丙酮酸脫羧酶的基因，而術語“PDC”則是指pdc基因的產物，即丙酮酸脫羧酶的多肽或酶。
術語“重組核酸分子”包括已經改變，修飾或工程化的核酸分子(例如，DNA分子)，這樣它的核苷酸序列就不同于衍生(例如，通過加成，缺失或取代一個或多個核苷酸)該重組核酸分子的天然核酸分子。優(yōu)選，重組核酸分子(例如，重組DNA分子)包括與調節(jié)序列可操作性連接的本發(fā)明的分離核酸分子或基因(例如，分離的pdc基因)。
術語“分泌酶”包括單獨與其它多肽結合，促進另外的多肽從細胞的胞內區(qū)轉運到胞外環(huán)境的任何多肽。在其中一個實施方案中，分泌多肽包括足以賦予革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌宿主細胞分泌活性的所有必需的分泌多肽。
術語“同時糖化和發(fā)酵”或“SSF”包括一個或多個重組宿主(或其提取物，包括純化或未純化的提取物，如果需要，加入其它酶，例如，來自于一個或多個不同的來源)使復合糖同時降解或解聚，并使該糖殘基生物轉化成乙醛，以及隨后如果需要，通過發(fā)酵生物轉化成乙醇的用途。
術語“底物親和性”是指酶對底物的結合動力學，例如，丙酮酸脫羧酶對其底物丙酮酸(或其類似物)的KM。通常，本發(fā)明丙酮酸脫羧酶的底物親和性(例如，對丙酮酸)KM約為0.1-1，更優(yōu)選約0.1-0.5，甚至更優(yōu)選約0.2-0.4。
術語“糖”包括含有糖部分的任何碳水化合物源。這種糖是根據本發(fā)明的產品和方法進行解聚(如果需要)，隨后生物轉化成乙醛，然后再通過發(fā)酵生物轉化成乙醇的可能糖源。
術語“替代啟動子”包括可轉錄控制目標基因，例如，丙酮酸脫羧酶基因，但又不會完全轉錄控制的多核苷酸片段。在其中一個實施方案中，替代啟動子的轉錄控制導致目標基因的表達水平增加。在另一實施方案中，替代啟動子位于目標基因的5’端。替代啟動子可用于替換天然啟動子，或在除天然啟動子之外的情況下使用。替代啟動子對于使用它的宿主細胞而言可以是內源性的，或它可以是引入到宿主細胞中的異源多核苷酸序列，例如對于使用它的宿主細胞而言是外源性的。適合用于細菌中的其它啟動子包括，例如，lacZ，T7，和SP6(見，例如，Ausubel等)。
術語“熱穩(wěn)定性”與“耐熱性”可互換使用，是指酶(例如，在細胞中表達，存在于細胞提取物，細胞溶解產物中，或是純化或部分純化的形式)至少在約20℃，優(yōu)選約25-35℃。更優(yōu)選約37℃或更高，特別是約50℃或更高，例如，至少約60℃或更高的溫度下，催化反應(例如，丙酮酸到乙醛的轉化)的能力。
II.分離的核酸分子和基因本發(fā)明提供含有編碼丙酮酸脫羧酶多肽(PDC)的丙酮酸脫羧酶基因(pdc)的核酸分子，其中所述核酸是從革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，例如革蘭氏陰性菌棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌和革蘭氏陽性菌胃八疊球菌中分離出來的。本發(fā)明還提供了不但含有上述任何一種丙酮酸脫羧酶基因(即，pdc)，而且含有其它側翼區(qū)的分離基因組核酸，其中所述側翼區(qū)含有調節(jié)區(qū)(例如，啟動子及核糖體結合位點)和參與產乙醇的其它相關基因，例如，醇脫氫酶(adh)。
所述核酸分子包括DNA分子(例如，線狀，環(huán)狀，cDNA或染色體DNA)和RNA分子(例如，tRNA，rRNA，mRNA)以及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈的DNA。本發(fā)明的分離核酸分子包括這樣一種核酸分子，即它沒有天然側翼于衍生所述核酸的生物的染色體DNA中的核酸分子的序列(即，位于核酸分子5’和3’端的序列)。在不同的實施方案中，分離的核酸分子可含有少于約10kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然側翼于衍生所述核酸分子的微生物的染色體DNA中的核酸分子。此外，“分離的”核酸分子，如cDNA分子，當通過重組技術產生時，基本上沒有其它細胞物質，或當化學合成時，基本上沒有化學前體或其它化學物質。
這里所述的pdc基因(用斜體字表示)包括這樣一種核酸分子(例如，DNA分子或其片段)，例如，一種編碼多肽或RNA的核酸分子，它是利用基因間DNA(即，間插或間隔DNA，它天然側翼于和/或分開生物染色體DNA中的基因)從生物體中的另外一個基因或其它基因中分離的?；蚩芍笇富蚱渌嚯姆肿拥暮铣?例如，可含有編碼序列，如，編碼多肽的連續(xù)可讀框(ORF))或其本身在生物體中是功能性的。生物體中的基因可在操縱子中簇集，其中所述操縱子是利用基因間DNA從其它基因和/或操縱子中分離的。操縱子內所含的各個基因可在沒有基因間DNA的情況下，在各基因之間重疊。
這里所述的分離基因包括這樣一種基因，它基本上沒有天然側翼于衍生該基因的生物的染色體DNA中的基因的序列(即，沒有編碼第二種或不同多肽或RNA分子的相鄰編碼序列，相鄰結構序列等)，而且可選擇性地含有5’和3’調節(jié)序列，例如啟動子序列和/或終止子序列。在其中一個實施方案中，分離基因包括多肽的優(yōu)勢編碼序列(例如，編碼PDC多肽的序列)。
在另一實施方案中，分離基因包括多肽(例如，PDC多肽)的編碼序列和來源于衍生該基因的生物染色體DNA的相鄰5’和/或3’調節(jié)序列(例如，相鄰的5’和/或3’pdc調節(jié)序列)。優(yōu)選，分離基因含有少于約10kb，5kb，2kb，1kb，0.5kb，0.2kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然側翼于衍生該基因的生物的染色體DNA中的基因。
一方面，本發(fā)明提供分離的pdc核酸序列或基因，分離的醇脫氫酶(adh)核酸序列或基因，優(yōu)選來源于革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。優(yōu)選，所述pdc核酸或基因來源于革蘭氏陰性菌，如葡糖桿菌，根瘤菌，慢生根瘤菌，產堿菌，紅細菌，紅球菌，固氮螺菌，紅螺菌，鞘氨醇單胞菌，伯克霍爾德氏菌，脫硫單胞菌，Gepspirillum，琥珀酸單胞菌，氣單胞菌，希瓦氏菌，Halochromatium，檸檬酸桿菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，發(fā)酵單胞菌(例如，運動發(fā)酵單胞菌)，發(fā)酵細菌(例如棕櫚發(fā)酵細菌)，和醋桿菌(例如，巴氏醋桿菌)。
在另一實施方案中，所述pdc核酸或基因來源于革蘭氏陽性菌，如絲狀桿菌，酸桿菌，擬桿菌，鞘氨醇桿菌，放線菌，棒桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，丙酸桿菌，雙岐桿菌，芽孢桿菌，Geobacillus，類芽孢桿菌，硫化桿菌，梭菌，Anaerobacter，真桿菌，鏈球菌，乳桿菌，明串珠菌，腸球菌，乳球菌，Thermobifida，纖維單胞菌，八疊球菌(例如，胃八疊球菌)。
在其中一個實施方案中，所述pdc核酸或基因來源于革蘭氏陰性菌棕櫚發(fā)酵細菌。
在另一實施方案中，所述pdc核酸或基因來源于革蘭氏陰性菌巴氏醋桿菌。
在另一實施方案中，所述pdc核酸或基因來源于革蘭氏陽性菌胃八疊球菌。
在另一實施方案中，本發(fā)明分離核酸分子所含的核苷酸序列與SEQID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示的核苷酸序列至少具有約60-65％，優(yōu)選至少約70-75％，更優(yōu)選至少約80-85％，甚至更優(yōu)選至少約90-95％或更多的同一性。
在另一實施方案中，分離核酸分子在嚴格條件下與具有SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的核酸分子雜交。這種嚴格條件對于本領域那些技術人員而言是已知的，可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。嚴格(例如，高度嚴格)雜交條件的具體非限制性例子是約45℃時在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50-65℃時，在0.2XSSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次。優(yōu)選，在嚴格條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示序列雜交的本發(fā)明分離核酸分子相應于天然存在的核酸分子。通常，天然存在的核酸分子包括具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
本發(fā)明的核酸分子(例如，具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的核酸分子)可使用標準的分子生物學技術和這里提供的序列信息分離。例如，核酸分子可使用標準的雜交和克隆技術分離(例如，在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中所述)或使用以SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示序列為基礎設計的合成寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應分離。本發(fā)明的核酸可使用cDNA，mRNA或可選擇性地，基因組DNA作為模板，以及適宜的寡核苷酸引物，按照標準PCR擴增技術擴增。在另一實施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子含有這樣一種核酸分子，它是SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的互補序列。
其它pdc核酸序列是含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ IDNO5所示核苷酸序列的那些，其編碼具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽同源物(例如，編碼與具有SEQID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽具有至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多同一性的多肽)，在嚴格條件下與具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的核酸分子的全部或一部分雜交，或與編碼具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或一部分雜交，或與這里所示的pdc核苷酸序列互補。
在另一實施方案中，分離的pdc核酸分子或基因編碼具有SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示氨基酸序列的PDC多肽同源物。通常，術語“同源物”包括這樣的多肽，它與野生型多肽或這里所述多肽的氨基酸序列具有至少約30-35％，優(yōu)選至少約35-40％，更優(yōu)選至少約40-50％，甚至更優(yōu)選至少約60％，70％，80％，90％或更多的同一性，而且具有與野生型多肽或這里所述多肽基本上相同的功能或生物活性。例如，PDC同源物與具有SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，或SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽具有至少約30-35％，優(yōu)選至少約35-40％，更優(yōu)選至少約40-50％，甚至更優(yōu)選至少約60％，70％，80％，90％或更多的同一性，而且它的功能或生物活性與具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽(即，功能等同物)基本上相同(如，具有基本上相同的丙酮酸脫羧酶活性)。
在另一實施方案中，分離的pdc核酸分子或基因含有編碼SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6任何一個所示多肽的核苷酸序列。
在另一實施方案中，分離的pdc核酸分子與具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的核酸分子的全部或一部分雜交，或與具有編碼多肽的核苷酸序列的核酸分子的全部或一部分雜交，所述多肽具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6任何一個所示的氨基酸序列。
這種雜交條件對于本領域那些技術人員而言是已知的，可在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等，eds.，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，sections 2，4和6中找到。其它嚴格條件可在Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，chapters 7，9和11中找到。嚴格雜交條件的具體非限制性例子包括約65-70℃時在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交(或約42-50℃時，在4XSSC加50％甲酰胺中雜交)，然后約65-70℃時，在1XSSC中洗滌一次或多次。高度嚴格雜交條件的具體非限制性例子包括約65-70℃時在1XSSC中雜交(或約42-50℃時，在1XSSC加50％甲酰胺中雜交)，然后約65-70℃時，在0.3XSSC中洗滌一次或多次。還原嚴格雜交條件的具體非限制性例子包括約50-60℃時在4XSSC中雜交(或約40-45℃時，在6XSSC加50％甲酰胺中雜交)，然后約50-60℃時，在2XSSC中洗滌一次或多次。上面列舉值的中間范圍，例如65-70℃或42-50℃也包括在本發(fā)明內?？捎肧SPE(1XSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA)替換雜交中的SSC(1XSSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)和洗滌緩沖液；每次雜交完成后，洗滌15分鐘。長度小于50個堿基對的雜交體的雜交溫度應為5-10℃，低于雜交體的解鏈溫度(Tm)，其中Tm是根據下列公式確定的。對于長度小于18個堿基對的雜交體而言，Tm(℃)＝2(A+T的堿基#)+4(G+C的堿基#)。對于長度在18-49個堿基對之間的雜交體而言，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C％)-(600/N)，其中N是雜交體中的堿基數，[Na+]是雜交緩沖液中的鈉離子濃度(1XSSC的[Na+]＝0.165M)。
本領域的技術人員應當認識到，還可把其它試劑加入到雜交和/或洗滌緩沖液中，以降低核酸分子與膜，例如，硝酸纖維素或尼龍薄膜的非特異性雜交，這些試劑包括但不限制于封閉劑(例如，BSA或鮭魚或鯡魚精子的載體DNA)，去污劑(例如SDS)，螯合劑(例如，EDTA)，Ficoll，PVP等。當使用尼龍薄膜時，嚴格雜交條件具體的非限制性例子是約65℃時，在0.25-0.5M NaH2PO4，7％SDS中雜交，然后于65℃時，在0.02M NaH2PO4，1％SDS中洗滌一次或多次，見，例如，Church和Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811991-1995，(或可選擇性的，0.2XSSC，1％SDS)。在另一實施方案中，分離核酸分子所含的核苷酸序列與這里所示的pdc核苷酸序列互補(例如，它是SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5所示核苷酸序列的完全互補序列)。
本發(fā)明另一實施方案提供突變或嵌合的pdc核酸分子或基因。通常，這里所述的突變核酸分子或突變基因包括具有下列核苷酸序列的核酸分子或基因，即所述核苷酸序列包括至少一個改變(例如，取代，插入，缺失)，這樣由所述突變體編碼的多肽就會顯示出與野生型核酸分子或基因編碼的多肽不同的活性。通常，嵌合pdc含有來源于另外一個PDC的完整結構域，其中所述另外一個PDC已經用PDC中的相應結構域改造過(融合，交換)。優(yōu)選，突變核酸分子或突變基因(例如，突變pdc基因)編碼具有改進的活性，例如，脫羧酶活性(例如底物親和性(例如，對于丙酮酸))；熱穩(wěn)定性；在不同pH值下的活性；或密碼子使用(例如，在受體宿主細胞中的表達改進)的PDC多肽。
III.重組核酸分子和載體本發(fā)明還提供重組核酸分子(例如，重組DNA分子)，它含有這里所述的核酸分子和/或基因(例如，分離的核酸分子和/或基因)，優(yōu)選pdc基因，更優(yōu)選來源于革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌的pdc基因。
本發(fā)明進一步提供含有這里所述的核酸分子(例如，分離或重組的核酸分子和/或基因)的載體(例如重組載體)。具體而言，提供含有核酸序列的重組載體，所述核酸序列編碼這里所述的細菌基因產物，優(yōu)選pdc基因產物，更優(yōu)選革蘭陰性菌或革蘭氏陽性菌的pdc基因產物，甚至更優(yōu)選棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，或胃八疊球菌的pdc基因產物。
還可對重組載體(例如，質粒，噬菌體，噬菌粒，病毒，粘粒或其它純化核酸載體)進行改變，修飾或工程化，這樣與衍生該重組載體的天然核酸分子中所含的那些相比，它就含有更多，更少或不同的核酸序列。優(yōu)選，所述重組載體包括pdc基因或含有這種pdc基因的重組核酸分子，其中該pdc基因與這里所述的調節(jié)序列，例如，啟動子序列，終止子序列和/或人工核糖體結合位點(RBS)可操作性連接。
通常，pdc基因以使核苷酸序列表達(例如，增強的，增加的，組成型，基礎的，減弱的，降低的或阻抑的表達)，優(yōu)選使核苷酸序列編碼的基因產物表達(例如，當重組核酸分子包含在重組載體中時，如此處所定義的，或引入到微生物中時)的方式與調節(jié)序列可操作性連接。
所述調節(jié)序列包括影響(例如，調控或調節(jié))其它核酸序列表達的核酸序列。在其中一個實施方案中，調節(jié)序列包含在重組核酸分子或重組載體中，其位置和/或方向與相對于調節(jié)序列觀察到的特定目標基因以及天然存在的目標基因相似或相同，例如，處于天然的位置和/或方向。舉例來說，目標基因可包含在與調節(jié)序列可操作性連接的重組核酸分子或重組載體中，其中調節(jié)序列與天然生物體中的目標基因相伴或相鄰(例如，與“天然”調節(jié)序列可操作性連接，例如，與“天然”啟動子可操作性連接)?？蛇x擇性地，目標基因可包含在與調節(jié)序列可操作性連接的重組核酸分子或重組載體中，其中調節(jié)序列與天然生物體中另外的(例如，不同的)基因相伴或相鄰。可選擇性地，目標基因可包含在與其它生物體的調節(jié)序列可操作性連接的重組核酸分子或重組載體中。例如，其它微生物的調節(jié)序列(例如，其它細菌調節(jié)序列，噬菌體調節(jié)序列等)可與特定的目標基因可操作性連接。
在其中一個實施方案中，調節(jié)序列是非天然存在的序列(例如，已經修飾，突變，取代，衍生，缺失的序列，包括化學合成的序列)。優(yōu)選的調節(jié)序列包括啟動子，增強子，終止信號，抗終止信號以及其它表達控制元件(例如，結合阻抑物或誘導物的序列和/或轉錄和/或翻譯調節(jié)多肽的結合位點，例如，在轉錄的mRNA中)。這種調節(jié)序列在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular CloningALaboratory Manual，2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。調節(jié)序列包括指導核苷酸序列在微生物中組成型表達的那些(例如，組成型啟動子和強組成型啟動子)；指導核苷酸序列在微生物中誘導型表達的那些(例如，誘導型啟動子，如木糖誘導型啟動子)；和減弱或阻抑核苷酸序列在微生物中表達的那些(例如，衰減信號或阻抑序列)。本發(fā)明的范圍還包括通過使調節(jié)序列除去或缺失而調節(jié)目標基因的表達。例如，可除去涉及轉錄負調節(jié)的序列，如此可改進目標基因的表達。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子或重組載體包括編碼至少一個與啟動子或啟動子序列可操作性連接的細菌pdc基因產物的核酸序列或基因。本發(fā)明的優(yōu)選啟動子包括天然啟動子，替代啟動子和/或噬菌體啟動子。在其中一個實施方案中，啟動子是與生化管家基因有關的啟動子或與產乙醇途徑有關的啟動子。在另一實施方案中，啟動子是噬菌體啟動子。其它啟動子包括tef(翻譯延伸因子(TEF))和pyc(丙酮酸羧酶(PYC)啟動子)，它們可促進在桿菌(例如，枯草桿菌)中的高水平表達。其它優(yōu)選啟動子，例如，用于革蘭氏陽性菌中的，包括但不限制于amyE啟動子或噬菌體SP02啟動子。其它優(yōu)選啟動子，例如，用于革蘭氏陰性菌中的，包括但不限制于，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL。
在另一實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子或重組載體含有終止序列(例如，轉錄終止序列)。通常，終止序列是指可終止基因轉錄的調節(jié)序列。終止序列(或串聯轉錄終止子)可進一步穩(wěn)定mRNA(例如，通過向mRNA中加入結構)，例如，可抗核酸酶。
在另一實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子或重組載體含有這種序列，即它可檢測含所述序列(即，可檢測和/或可選擇性標記)的載體，例如，克服營養(yǎng)缺陷型突變的序列，例如，ura3或ilvE，熒光標記，和/或比色標記(例如，lacZ/β-半乳糖苷酶)，和/或抗生素抗性基因(例如，bla或tet)。
應當理解，可被引入到載體中的本發(fā)明任何一種pdc基因還可含有一種或多種產乙醇基因(例如，醇脫氫酶(即，adh))和/或編碼基因產物的基因，所述基因產物適于使糖發(fā)酵或降解，隨后接著發(fā)酵，例如在實施例8和9中所述，以及美國專利號5,821,093；5,482,846；5,424,202；5,028,539；5,000,000；5,487,989；5,554,520和5,162,516中所述。這兩種或多種基因可使用獨立調節(jié)元件(例如，啟動子)，共有調節(jié)元件，天然調節(jié)元件，或其組合獨立表達。
IV.分離的多肽本發(fā)明另一方面提供分離的多肽(例如，分離的產乙醇酶，如丙酮酸脫羧酶(PDC))。在其中一個實施方案中，PDC多肽是利用重組DNA技術生產的，而且可使用標準的多肽純化技術，利用適宜的純化方法從本發(fā)明的微生物中分離。在另一實施方案中，多肽是使用標準的肽合成技術化學合成的。
分離或純化的多肽(例如，分離或純化的PDC)基本上沒有來源于衍生該多肽的微生物的細胞物質或其它污染多肽，或基本上沒有化學合成時的化學前體或其它化學物質。在其中一個實施方案中，分離或純化的多肽含有少于約30％(干重)的污染多肽或化學物質，更優(yōu)選少于約20％的污染多肽或化學物質，更優(yōu)選少于約10％的污染多肽或化學物質，最優(yōu)選少于約5％的污染多肽或化學物質。
在其中一個實施方案中，PDC多肽或基因產物來源于革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。優(yōu)選PDC多肽或基因產物來源于革蘭氏陰性菌，如葡糖桿菌，根瘤菌，慢生根瘤菌，產堿菌，紅細菌，紅球菌，固氮螺菌，紅螺菌，鞘氨醇單胞菌，伯克霍爾德氏菌，脫硫單胞菌，Gepspirillum，琥珀酸單胞菌，氣單胞菌，希瓦氏菌，Halochromatium，檸檬酸桿菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，發(fā)酵單胞菌(例如，運動發(fā)酵單胞菌)，發(fā)酵細菌(例如棕櫚發(fā)酵細菌)，和醋桿菌(例如，巴氏醋桿菌)。
在另一實施方案中，PDC多肽或基因產物來源于革蘭氏陽性菌，如絲狀桿菌，酸桿菌，擬桿菌，鞘氨醇桿菌，放線菌，棒桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，丙酸桿菌，雙岐桿菌，芽孢桿菌，Geobacillus，類芽孢桿菌，硫化桿菌，梭菌，Anaerobacter，真桿菌，鏈球菌，乳桿菌，明串珠菌，腸球菌，乳球菌，Thermobifida，纖維單胞菌，八疊球菌(例如，胃八疊球菌)。優(yōu)選基因產物來源于選自革蘭氏陰性菌棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，和革蘭氏陽性菌胃八疊球菌的微生物。
包括在本發(fā)明范圍內的PDC多肽或基因產物是由天然存在的細菌基因編碼的，棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，或胃八疊球菌衍生的多肽或基因產物。進一步包括在本發(fā)明范圍內的是細菌衍生的多肽或基因產物，它們不同于天然存在的細菌和/或棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，或胃八疊球菌的基因(例如，pdc)，例如，該基因具有已經突變，插入或缺失的核酸，但仍然編碼與本發(fā)明天然存在的基因產物基本相似的多肽，例如，含有丙酮酸脫羧酶活性。
例如，應當理解，本領域的技術人員可使核酸突變(例如，取代)，由于遺產密碼的簡并性，它編碼與天然存在基因編碼的相同的氨基酸。這可能是我們所希望的，以便改進在特定生物體中表達的核酸的密碼子使用。此外，應當理解，本領域的技術人員可使編碼保守氨基酸取代的核酸突變(例如，取代)。還應當理解，本領域的技術人員可使氨基酸取代，加成或缺失到一定程度，與天然存在的基因產物相比，基本上不會影響基因產物的功能(例如，脫羧酶活性)，它的每個例子都包括在本發(fā)明的范圍之內。使用這里所述的測定法可很容易地測定脫羧酶活性和，例如，酶/底物親和性，酶熱穩(wěn)定性，和/或酶在各種pH值下的活性。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明的分離多肽(例如，分離的丙酮酸脫羧酶)，如分離的PDC多肽具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQID NO6，或SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。在其它實施方案中，本發(fā)明的分離多肽是至少一個SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，或SEQ ID NO8所示多肽的同源物(例如，所含的氨基酸序列與SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，或SEQ ID NO8的氨基酸序列具有至少約30-40％，優(yōu)選約40-50％，更優(yōu)選約50-60％，甚至更優(yōu)選約60-70％，70-80％，80-90％，90-95％或更多的同一性)，而且所具有的活性與分別由SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，或SEQ ID NO8所示氨基酸序列編碼的多肽基本相似。
為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分比，將序列進行比對(例如，可把空位引入到第一個氨基酸或核酸序列中，與第二個氨基酸或核酸序列進行最佳序列比對)。當第一個序列中的位置被與第二個序列相應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，那么分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置數的函數(即，同一性％＝相同位置數#/總位置數#×100)，優(yōu)選考慮空位數和產生最佳序列比對所需的該空位的大小。
序列比對和兩個序列之間同一性百分比的測定可利用數學算法完成。用于序列比對的數學算法具體的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68的算法，并對這種算法所作的改進Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77。可把這種算法結合到Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程序進行，分值＝100，字長＝12，從而獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST多肽檢索可用XBLAST程序進行，分值＝50，字長＝3，從而獲得與本發(fā)明多肽分子同源的氨基酸序列。為了對空位進行序列比對，可利用Altschul等，(1997)Nucleic Acids Research 25(17)3389-3402描述的有空位的BLAST。當利用BLAST和有空位的BLAST程序時，可使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省參數。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于進行序列比對的數學算法其它具體的非限制性例子是Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.411-17的算法。將這種算法結合到ALIGN程序中，例如，在GENESTREAM網絡服務器，IGH Montpellier，FRANCE或ISREC服務器上。當利用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表，數值為12的空位長度罰分，和數值為4的空位罰分。
在另一實施方案中，兩個氨基酸序列之間的同一性百分比可使用GCG軟件包中的GAP程序，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，數值為12，10，8，6，或4的空位權重和數值為2，3，或4的長度權重測定。在另一實施方案中，兩個核酸序列之間的同一性百分比可使用GCG軟件包中的GAP程序(可在http//www.gcg.com獲得)，使用數值為50的空位權重和數值為3的長度權重測定。
以上述分離的PDC多肽為基礎，可使用這里所述的標準技術，相對于PDC多肽，或其一部分培養(yǎng)免疫特異性抗體。
V.使用方法生產乙醛的方法所需產物乙醛的潔凈有效的生產具有廣泛的商業(yè)和工業(yè)用途。例如，乙醛可用于醋酸，調味料，食品，飲料，香料，塑料，苯胺染料的生產，合成橡膠制造業(yè)，鏡子的鍍銀，明膠纖維的硬化和實驗室的研究。此外，乙醛可作為通過發(fā)酵生產乙醇的底物。
因此，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的PDC酶把底物，例如丙酮酸或丙酮酸類似物轉化成乙醛的方法。在其中一個實施方案中，本發(fā)明提供使用表達pdc基因和基因產物(PDC)的微生物(例如，重組微生物)從丙酮酸生產乙醛的方法。所述方法還包括生物過程，該過程可產生(例如，轉換或轉化)丙酮酸，或其可轉化的類似物，該類似物可被轉化或脫羧成乙醛，或其類似物。
該方法包括使微生物與糖接觸，其中所述微生物表達本發(fā)明的pdc基因和基因產物，且可選擇性地表達一個或多個產乙醇基因，使糖的碳骨架轉化成丙酮酸或其類似物，在培養(yǎng)條件下產生乙醛(或其類似物)。
在本發(fā)明另一實施方案中，上述微生物可被加工成進行上述轉化反應的酶溶解產物。在另一實施方案中，pdc基因產物是按照這里所述純化的，用于進行轉化反應。
轉化反應所用的微生物和/或酶(例如，溶解產物形式的，部分純化，或純化形式的)是以能夠執(zhí)行它們預定功能(例如，生產所需的化合物，如乙醛)的形式存在的。所述微生物可以是完整的細胞，或僅僅是獲得預期結果所需的細胞的一部分。所述微生物可以是混懸的(例如，混懸在適宜的溶液，如緩沖液或培養(yǎng)基中)，洗過的(例如，洗至沒有培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基)，丙酮-干燥的，固定的(例如，用聚丙烯酰胺凝膠或k-角叉菜膠固定或固定在合成支持物，例如，珠子，基質等上)，固定的，交聯的或滲透的(例如，具有滲透膜和/或壁，這樣化合物，例如底物，中間體或產物可更容易地通過該膜或壁)。
純化或未純化PDC的酶(單獨或與其它產乙醇酶結合)也可用于轉化反應。該酶應以能夠執(zhí)行其預定功能(例如，獲得所需化合物，如乙醛，或，存在必需的產乙醇基因產物，乙醇)的形式存在。例如，該酶可以是游離的形式或固定的。
生產乙醇的方法在本發(fā)明其中一個實施方案中，具有上述性質的宿主細胞也是產乙醇的。因此，本發(fā)明提供使用這種宿主細胞(或從其衍生的提取物/酶)生產乙醇的方法。此外，宿主細胞可用于把復合糖協同降解或解聚為單糖。隨后，細胞可通過發(fā)酵把更簡單的糖分解代謝成乙醇。同時把復合糖解聚成更小的糖殘基，然后發(fā)酵的過程稱作同時糖化和發(fā)酵(SSF)。
通常，要對發(fā)酵條件進行選擇，以便提供最佳的pH值和溫度，促進生產者宿主細胞株的最佳生長動力學以及培養(yǎng)所產生酶的催化條件(Doran等，(1993)Biotechnol.Progress 9533-538)。例如，對于克雷白氏菌，對于P2株而言，最佳條件被確定為35-37℃和pH5.0-5.4。在這些條件下，甚至是外源性加入的真菌內葡聚醣酶和外葡聚糖酶也十分穩(wěn)定，并在很長一段時間內繼續(xù)發(fā)揮作用。其它條件在實施例中討論。此外，本領域的技術人員僅僅需要常規(guī)實驗，使用本領域已知的技術，就可優(yōu)化本發(fā)明的已知發(fā)酵反應。見，例如，美國專利號5,424,202和5,916,787，它們引入此處作為參考。
本發(fā)明可通過下列實施例進一步舉例說明，但這些實施例不應被解釋為對本發(fā)明的限制。
示例除非另有說明，在實施例中使用下列原料和方法?？s寫詞如下PDC，丙酮酸脫羧酶；ADH，醇脫氫酶；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳；TPP，二磷酸硫胺素；PCMS，對-氯汞苯基-磺酸；PCMB，對-氯汞苯甲酸；DTT，二硫蘇糖醇；Apa，巴氏醋桿菌；Sve，胃八疊球菌；Zpa，棕櫚發(fā)酵細菌；Zmo，運動發(fā)酵單胞菌。
材料和方法菌株和培養(yǎng)基-棕櫚發(fā)酵細菌的菌株T109(IAM 14233，ATCC51623)是26℃(200rpm)時，在ATCC 1956 MY培養(yǎng)基(每升含有10g酵母提取物，20g麥芽糖，2g KH2PO4，和5g NaCl)中培養(yǎng)的。巴氏醋桿菌的菌株NCIB8618(ATCC 12874)是25℃時，在基本培養(yǎng)基(pH 5.0-5.5)中通氣生長的，其中按先前所述(3，13)向基本培養(yǎng)基中補充了2％(v/v)D-L-乳酸鹽，每升又加入了0.1ml的1％(v/v)止泡劑。大腸埃希氏菌的菌株ER1648 F-fhuA2Δ(lacZ)rl supE44trp31 mcrA1272Tn10(Tetr)his-1 rpsL104(Strr)xyl-7 mtl-2 metB1Δ(mcrC-mrr)102Tn10(Tetr)(New England Biolabs，Beverly，MA)，DH5α F-recA1 endA1 hsdR17(rk-mk+)supE44 thi-1gyrA relA1(Life Technologies，Rockville，MD)，BL21-CodonPlus-RIL F-ompT hsdS(rB-mB-)dcm+Tetrgalλ(DE3)endAHte[argU ileY leuW Camr](一種大腸埃希氏菌的B菌株)(Stratagene，LaJolla，CA)，和Rosetta(DE3)F-ompT hsdSB(rB-MB-)gal dcm lacY1(pRARE)(Novagen，Madison，WI)用于重組DNA的實驗。大腸埃希氏菌的菌株是37℃(200rpm)時，在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中生長的。如果需要，可向培養(yǎng)基中補充2％(w/v)葡萄糖和抗生素，包括氨芐西林(100mg/升)，卡那霉素(100mg/升)，和氯霉素(30mg/升)。
DNA的分離和克隆-質粒DNA是用BioRad(Hercules，CA)的Quantum Prep Plasmid Miniprep試劑盒分離的。DNA片段是用Qiagen(Valencia，CA)的QIAquick凝膠提取試劑盒，使用1XTAE緩沖液(40mM Tris醋酸鹽，2mM EDTA，pH 8.5)從0.8％Seakem GTG瓊脂糖(FMC Bioproducts，Rockland，ME)凝膠洗脫下來的?；蚪MDNA是用Harwood和Cutting(17)描述的方法分離的。
棕櫚發(fā)酵細菌的DNA和多肽序列的分析-質粒是使用LICOR測序儀(DNA測序設備，Department of Microbiology and Cell Science，University of Florida)利用Sanger雙脫氧方法(42)進行測序的。Genpro 5.0(Hoefer Scientific，San Francisco，CA)，1.81版本的ClustalW(46)，1.5版本的Treeview(39)，和MultiAln(12)用于DNA和多肽序列的比對和比較。使用BLAST網絡服務器把GenBank，EMBL，和位于National Center for BiotechnologyInformation(Bethesda，MD)的SwissProt中的多肽序列與推斷氨基酸序列進行比較。
PDC多肽的純化-PDC的純化是按照表2進行的。除非另有說明，所有過程都是室溫進行的，所有純化緩沖液都含有1mM TPP和1mMMgCl2。胃八疊球菌的PDC是按照先前所述(45)從重組大腸埃希氏菌BL21-CodonPlus-RIL(pJAM419)和Rosetta(DE3)(pRARE，pJAM419)純化的。運動發(fā)酵單胞菌的PDC是按照下面棕櫚發(fā)酵細菌PDC的純化所述，使用熱處理，Q-瓊脂糖凝膠，和Superdex 200過程從重組大腸埃希氏菌DH5α(pLOI276)(11)純化的，區(qū)別在于運動發(fā)酵單胞菌的PDC是以0.22-0.32M NaCl從Q-瓊脂糖凝膠上洗脫下來的。
(i)棕櫚發(fā)酵細菌PDC的純化-使棕櫚發(fā)酵細菌和大腸埃希氏菌DH5α(pJAM3440)細胞生長至穩(wěn)定期，10,000Xg離心采集(10分鐘，4℃)。把細胞(12-15g濕重)重懸浮在6個體積，含有1mM TPP和1mM MgCl2的pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液(緩沖液A)中，以20,000lb/in2通過冷卻了的弗氏細胞壓器。16,000Xg(20分鐘，4℃)離心除去細胞碎片。把細胞溶解產物60℃加熱30分鐘，在冰上冷卻15分鐘，16,000Xg(30分鐘，4℃)離心除去變性多肽。把上清液加入在50mM緩沖液A中平衡的HiLoad Q-瓊脂糖凝膠26/10柱(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用200ml 50mM的緩沖液A洗滌柱子，以4.0ml/分鐘的速率把400ml線性的0-1M的NaCl梯度加在柱上。在0.4-0.5M NaCl之間洗脫PDC活性的峰，并收集。以0.2ml/分鐘的速率把等分試樣(0.5ml)注射到用50mM緩沖液A平衡的Superdex 200 10/30柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，從而把來源于大腸埃希氏菌的重組棕櫚發(fā)酵細菌的PDC純化至均一，其中所述緩沖液A含有150mMNaCl和10％甘油。
棕櫚發(fā)酵細菌“天然”PDC的純化還需要其它步驟。把熱處理過的溶解產物加在用10mM緩沖液A平衡的羥磷灰石CHT5-1柱(BioRad)上。用30ml 10mM的緩沖液A洗滌柱子，并以0.5ml/分鐘的速率把30ml線性的10mM-1M的磷酸鈉梯度加在柱子上。在0.45-0.5M磷酸鈉之間洗脫PDC活性的峰，并收集。按照前面所述使用Superdex 200 10/30進一步純化等分試樣。向混合活性部分加固體硫酸銨至1M，然后上樣到用含有1M硫酸銨的50mM緩沖液A平衡的苯基瓊脂糖凝膠6FastFlow(low sub)柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。15-ml的洗滌之后，以0.5ml/分鐘的速率用15-m11-0M遞逐漸線性梯度的硫酸銨展開柱子。“天然”PDC活性的峰是在0.55-0.3M鹽之間洗脫的。
(ii)巴氏醋桿菌PDC的純化-對棕櫚發(fā)酵細菌PDC的純化方法進行下列改進后，使用熱處理，Q-瓊脂糖凝膠，Superdex 200，和羥磷灰石從巴氏醋桿菌及大腸埃希氏菌ER1648(pJAM304)中純化PDC。細胞以30,000lb/in2通過弗氏壓器。收集在0.17-0.26M NaCl之間，從Q-瓊脂糖凝膠柱洗脫下來的PDC活性，并在上樣到Superdex 200柱之前，通過相對于PEG8000透析而濃縮。
棕櫚發(fā)酵細菌和巴氏醋桿菌的PDC可在液氮下的10％甘油中貯存1個月而不會損失活性。胃八疊球菌和運動發(fā)酵單胞菌的PDC在4℃貯存。
PDC的量化和酶活性的測定-多肽濃度是使用含有牛血清白蛋白的Bradford試劑作為標準(BioRad)測定的。PDC活性是按照先前所述(11)通過使用面包酵母醇脫氫酶(ADH)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的偶聯測定法測量的。反應混合物在pH 5.0的50mM檸檬酸鈉緩沖液中含有0.15mM NADH，5mM MgCl2，0.1mM TPP，5mM丙酮酸，和10U ADH，除非另有說明，測量是在25℃進行的。一個單位的酶活性被定義為每分鐘生產1μmol乙醛的酶的量。
PDC多肽的分子量和氨基酸序列的測定-亞單位的分子量和酶純度是用考馬斯藍R-250(26)染色的12％聚丙稀酰胺凝膠，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定的。SDS-PAGE的分子量標準如下磷酸化酶b(97.4kDa)，血清白蛋白(66.2kDa)，卵清蛋白(45kDa)，碳酸酐酶(31kDa)，胰蛋白酶抑制劑(21.5kDa)，和溶菌酶(14.4kDa)。對于天然分子量的測定而言，是把樣品加在Superdex 200 10/30柱上，該柱子已經在含有150mM NaCl的pH 6.5的50mM磷酸鈉緩沖液中平衡。分子量標準包括血清白蛋白(66kDa)，醇脫氫酶(150kDa)，α-淀粉酶(200kDa)，脫鐵鐵蛋白(443kDa)，和甲狀腺球蛋白(669kDa)。
純化PDC多肽的N-末端序列是在進行了SDS-PAGE，并把多肽電印跡在聚偏二氟乙烯薄膜(PVDF-PLUS)(Micron Separations Inc.，Westborough，MA)上測定的。序列是利用自動Edman降解，在Polypeptide Chemistry Core Facility of the University ofFlorida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research上測定的。
脫輔酶的制備-用pH 9.0的1.5ml 50mM磷酸鈉緩沖液稀釋純化的PDC(0.75mg/0.5ml)，然后立即使用Centricon YM30濃縮器(Millipore，Bedford，MA)濃縮8倍。調節(jié)體積至0.5ml之后，25℃溫育該多肽45分鐘。PDC是通過加在Superdex 200 10/30柱上而從未結合的輔因子中純化的，其中該柱子用含有10％甘油和150mMNaCl的pH 9.0的50mM磷酸鈉緩沖液平衡。立即洗脫后，把脫輔酶在pH 5.0的50mM檸檬酸鈉緩沖液中稀釋5倍，4℃貯存，并在16小時內用于進行重構測定。TPP是使用15％NaOH中的K3Fe(CN)6，利用氧化成thichrome二磷酸鹽后的熒光測量的(15)。激發(fā)和發(fā)射波長分別為375nm和430nm。為進行重構，把脫輔酶(755ng)稀釋在1ml含有1mM TPP和/或1mM MgCl2的pH 5.0的50mM檸檬酸鈉緩沖液中。在相同的緩沖液中測定混合物的PDC活性。
原料-生化制品是從Sigma-Aldrich購買的。其它有機和無機的分析級化學物質是從Fisher Scientific(Atlanta，GA)購買的。限制性內切核酸酶和DNA-修飾酶來源于New England BioLabs。洋地黃毒苷-11-dUTP(通過11-原子的間隔區(qū)與洋地黃毒苷偶聯的2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸)，相對于洋地黃毒苷培養(yǎng)的堿性磷酸酶偶聯抗體，菌落與噬斑雜交所用的尼龍薄膜來源于Roche MolecularBiochemicals。進行DNA雜交的正電尼龍薄膜來源于Ambion(Austin，TX)。
實施例1來源于革蘭氏陰性菌棕櫚發(fā)酵細菌的PDC基因的鑒定和表征在這個實施例中，描述了來源于革蘭氏陰性菌棕櫚發(fā)酵細菌的PDC基因的鑒定和表征。
簡單地說，丙酮酸脫羧酶(pdc)操縱子是使用基于純化蛋白N-末端氨基酸序列的簡并寡核苷酸探針，從棕櫚發(fā)酵細菌的基因組文庫中分離出來的(圖1)。該片段(pJAM3440)1.7-kb的PstI到BamHI的亞克隆是重組大腸埃希氏菌中PDC活性所需的。以DNA序列為基礎，在該區(qū)中鑒定了一個1668-bp的ORF(55mol％G+C含量)，其編碼推定的PDC多肽(圖1)。規(guī)范Shine-Dalgarno序列(GGAGG)是翻譯起始密碼子(ATG)的10bp上游。此外，推定的-35和-10啟動子(TTcACt-N17-atTAAT，其中N是任意的核苷酸，大寫字母與細菌啟動子共有序列相對應)位于起始密碼子的16-44bp上游(18)。翻譯終止密碼子的下游(21bp)是一個62bp的序列，經預測它可形成兩個莖-環(huán)結構和一個16bp富含AT的區(qū)，與ρ-非依賴性轉錄終止相一致(18)。全部四個細菌pdc基因，包括來源于運動發(fā)酵單胞菌，胃八疊球菌和巴氏醋桿菌的那些，都被預測是從單順反操縱子獨立轉錄的(11，40，45)。
棕櫚發(fā)酵細菌的推斷PDC多肽(ZpaPDC)含有556個氨基酸(包括N-末端甲硫氨酸)，無水分子量為60,113Da(圖4)。它與其余三種細菌PDC相似，它們含有552-568個氨基酸，無水分子量為59,830-61,809Da。棕櫚發(fā)酵細菌序列的GenBank登記號為AF474145。
實施例2來源于革蘭氏陰性菌巴氏醋桿菌的PDC基因的鑒定和表征在這個實施例中，描述了來源于革蘭氏陰性菌巴氏醋桿菌的PDC基因的鑒定和表征。
簡單地說，染色體DNA是用Harwood等描述的方法從巴氏醋桿菌的細胞中分離出來的(17)。為進行DNA分析，用限制酶(AatII，BamHI，ClaI，EcoRI，和HincII)裂解基因組DNA(1-2μg/泳道)，通過凝膠電泳(0.8％瓊脂糖)分離，并通過向下的毛細作用轉移到帶正電的尼龍薄膜上。60℃時，在含有1％封閉試劑，0.1％N-十二酰肌氨酸，和0.02％十二烷基硫酸鈉(SDS)的5XSSC(1XSSC是0.15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉)中平衡該薄膜2小時。使用運動發(fā)酵單胞菌pdc基因的0.7-kb KpnI片段作為模板，隨機引物可用于標記具有洋地黃毒苷-11-dUTP的探針。加入標記過的探針(1ng/ml)后，60℃培養(yǎng)薄膜14小時，用含有2XSSC和0.1％SDS的溶液(每次5ml)洗滌兩次，用含有0.5XSSC和0.1％SDS的溶液(每次15ml，60℃)洗滌兩次。使用X-射線膠片利用化學發(fā)光觀察信號。
亞-基因組文庫是使用巴氏醋桿菌染色體DNA的5-到7-kb AatII片段產生的。使用Vent DNA聚合酶把突出端轉化成平頭端，并連接到平頭端(Vent DAN聚合酶)，pLITMUS28的脫磷酸化(牛小腸堿性磷酸酶)XhoI位點中。轉化后，使用與DNA分析相似的條件，通過雜交篩選重組體，分離含有全長pdc和aldI基因的質粒pJAM301(圖2)。
然后亞克隆pJAM301中的巴氏醋桿菌DNA片段(4.2kb)，并使用LICOR測序儀(DNA測序設備，Department of Microbiology and CellScience，University of Florida)，通過Sanger雙脫氧方法進行測序(42)。該序列的GenBank等級號為AF368435。
Genepro 5.0(Riverside Scientific，Seattle，WA)，1.81版本的ClustalW(Thompson等，1994)，1.5版本的Treeview(Page，1996)，和MultiAln(Corpet，1988)用于DNA和/或多肽序列的比對和比較。使用BLAST網絡服務器把推斷的氨基酸序列和GenBank，EMBL，及National Center for Biotechnology Information(Bethesda，MD)SwissProt數據庫中的多肽序列進行比較。
運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶(pdc)基因片段可被用作DNA雜交的探針，從而自巴氏醋桿菌基因組DNA中分離出一個6,337bp的，具有58.5％G+C含量的AatII片段(圖2)。以DNA序列的BLAST分析為基礎，可鑒定pdc基因。經預測該基因編碼的多肽具有548個氨基酸(包括N-末端的甲?；?甲硫氨酸)，計算出的pI為5.49，無水分子量為58,873Da(圖5)。pdc基因的密碼子使用是通過把兩個其它的細菌pdc基因，運動發(fā)酵假單胞菌(11，34，Reynen和Sahm，J.Bacteriol.1703310-3313(1998))和胃八疊球菌與大腸埃希氏菌K-12的基因組進行比較而獲知的(表1)。與巴氏醋桿菌pdc基因較高的G+C含量(60.4％)相一致，除Glu，His，和Tyr那些之外，密碼子在第3個堿基位置中主要含有C和/或G(表1)。這一點與運動發(fā)酵假單胞菌(52.4％)和胃八疊球菌(30.9％)pdc基因較低的G+C含量正好相反，而且它們的密碼子使用也不同。
對巴氏醋桿菌pdc基因5’末端的分析揭示，規(guī)范Shine-Dalgarno序列是GTG預測翻譯起始密碼子的8bp上游。此外，pdc基因上游的72-101bp區(qū)與σ70-依賴性啟動子的真細菌-35和-10共有序列高度相同。pdc翻譯終止密碼子的下游(17bp)是一組預測的發(fā)夾環(huán)狀結構，然后是富含AT的區(qū)，表明pdc轉錄的ρ-非依賴性終止。因此而確定巴氏醋桿菌pdc基因可被轉錄為像運動發(fā)酵單胞菌(11)和胃八疊球菌pdc基因那樣的單順反操縱子。
其它可讀框(ORF)是在pdc基因區(qū)中鑒定的，所述pdc基因區(qū)中含有以aldI表示的ORF，它是從pdc背馳轉錄的(圖2)。經預測，推定aldI基因編碼的多肽具有357個氨基酸(包括N-末端甲?；?甲硫氨酸)，計算出的分子量為38,108Da，pI為6.32。推斷的多肽序列(AldI)與Zn2+-和NAD+-依賴性培養(yǎng)基-鏈ADH家族(III類)的成員非常相似，與谷胱甘肽-依賴性甲醛脫氫酶(GSH-FDH)最相似(Jornvall等，Eur.J.Biochem 167195-201(1987))。氨基酸殘基是保守的，它是對于GSH-FDH活性很重要的結構(C-92，C-95，C-98，和C-106)及催化(C-40，H-62，和C-169)鋅離子的可能配體。還存在Rossman折疊共有序列(殘基194-GLGGIG-199)，表明AldI可結合NAD(P)+。預測的巴氏醋桿菌AldI多肽與醋桿菌中乙醇氧化所必需的膜結合ALD或ADH酶三個亞單位的序列同一性非常小(Thurner等，1997；Kondo和Horinouchi，J.Bacteriol.1775048-5055(1997))。該預測多肽被確定具有與GSH-FDH多肽接近的進化帶。最為顯著的是，由aldI聚簇編碼的巴氏醋桿菌多肽與醋酸菌的分類相一致，具有α-蛋白細菌，藍細菌屬鏈魚腥藍細菌的GSH-FDH酶，很少具有β-和γ-蛋白細菌的GSH-FDH酶。
通過ADH偶聯測定法分析巴氏醋桿菌AatII6.3-kb基因組片段的亞克隆的PDC活性，其中的基因組片段在高拷貝數質粒上攜帶pdc基因。只檢測了攜帶質粒pJAM304菌株的PDC活性顯著水平，除了該基因124bp的上游和236bp的下游之外，它還具有完整的pdc可讀框(圖2和5)。巴氏醋桿菌序列的GenBank登記號為AR368435。
實施例3來源于革蘭氏陽性菌胃八疊球菌的PDC基因的鑒定和表征在這個實施例中，描述了來源于革蘭氏陽性菌胃八疊球菌的PDC基因的鑒定和特性。
簡并寡核苷酸5’-AARGARGTNAAYGTNGARCAYATGTTYGGNGT-3’(SEQID NO11)是以從胃八疊球菌純化的PDC的N-末端氨基酸序列為基礎合成的(Lowe和Zeikus，1992)(其中，R是A或G；N是A，C，G，或T；Y是C或T)。該寡核苷酸是使用供應商(Roche MolecularBiochemicals)推薦的具有洋地黃毒苷-11-dUTP和dATP的末端轉移酶在3’端標記的。
為進行DNA分析，用BglI，EcoRI，或HincII消化基因組DNA，通過0.8％瓊脂糖電泳分離，并轉移到帶正電的尼龍薄膜(Southern，1975)上。薄膜是58℃時，在含有1％封閉試劑(Roche MolecularBiochemicals)，0.1％N-十二酰肌氨酸，和0.02％SDS的5XSSC(1XSSC是0.15M NaCl加0.015M檸檬酸鈉)中平衡的。加入探針(0.2pmol/ml)和Poly(A)(0.01mg/ml)后，58℃培養(yǎng)薄膜18.5小時。25℃用含有0.1％SDS的2XSSC洗滌薄膜2次(每次5分鐘)，58℃用含有0.1％SDS的0.5XSSC洗滌薄膜2次(每次15分鐘)。按照供應商(Roche Molecular Biochemicals)的建議，利用比色檢測觀察信號。
為了在質粒pBR322中生產亞基因組文庫，用HincII消化染色體DNA，并通過電泳分離。把2.5-到3.5-kb的HincII DNA片段連接到pBR322的EcoRV位點中，然后轉化到大腸埃希氏菌SE2309中。通過比色檢測，用簡并寡核苷酸篩選菌落。通過該方法可分離出攜帶HincII片段的質粒pJAM400，其中所述HincII片段含有1,350bp的pdc基因(圖3)。
λBlueSTAR載體系統(Novagen)用于建造其它亞基因組文庫，從而促進從胃八疊球菌中分離全長pdc基因。用BclI消化基因組DNA，通過在0.8％瓊脂糖中電泳分離，然后將6.5-到8.5-kb的片段與λBlueSTAR BamHI臂連接。噬菌體的體外包裝和平板接種是按照供應商(Novagen)的方法進行的。DNA探針是使用來源于pJAM400pdc基因的一個800-bp EcoRI片段生產的，并已經用供應商(Roche MolecularBiochemicals)推薦的隨機引物方法使用洋地黃毒苷-11-dUTP標記。利用比色檢測篩選噬斑。Cre-loxP介導的亞克隆可通過平板接種具有表達Cre重組酶(Novagen)的大腸埃希氏菌BM25.8的λBlueSTAR噬菌體，而用于環(huán)化陽性噬斑的DNA。然后純化環(huán)化的質粒pJAM410，并把它電穿孔到大腸埃希氏菌DH5α中。
為了產生pdc表達載體，在通過聚合酶鏈反應(PCR)從pJAM413(圖3)擴增后，把promoterless pdc基因亞克隆到pET21d中。設計引物從而使用BspHI(寡核苷酸1)和XhoI(寡核苷酸2)限制位點定向插入。把所得片段連接到pET21d(Novagen)的適合NcoI和XhoI位點中，產生pJAM419(圖3)。pdc基因的保真度是通過DNA測序加以證實的。
為了確定胃八疊球菌丙酮酸脫羧酶的操縱子，使用從胃八疊球菌純化的PDC多肽的N-末端氨基酸序列(Lowe和Zeikus，1992)生產用于和基因組DNA雜交的簡并寡核苷酸。該方法可促進從胃八疊球菌中分離7.0-kb的BclI基因組DNA片段。進一步亞克隆該片段，以便對與寡核苷酸探針雜交的3,886bp HincII-to-HincII區(qū)的兩個鏈進行測序(圖3)。DNA序列的分析揭示，1,656bp的可讀框(ORF)編碼具有與先前純化的胃八疊球菌PDC相同的N-末端的多肽(圖6)。因此把ORF命名為pdc。規(guī)范Shine-Dalgarno序列位于pdc翻譯起始密碼子的7bp上游。此外，pdc上游的82-110bp區(qū)與真細菌的-35和-10啟動子共有序列的同一性有限。經預測，pdc翻譯終止密碼子的下游(43bp)區(qū)可形成莖環(huán)結構，然后是富含AT的區(qū)，與ρ-非依賴性轉錄終止子相一致。因此，胃八疊球菌pdc可被轉錄為像運動發(fā)酵單胞菌pdc基因那樣的單順反操縱子(Conway等，1987)。
部分ORF被鑒定為pdc的722bp上游，它編碼一個177氨基酸的多肽片段(ORF1*)(圖3)。ORF1*與很多假擬膜多肽(GenBank登記號CAC11620，CAC24018，CAA22902)具有同一性(28-29％)，并被預測可形成很多跨膜結構域(沒有給出數據)。經預測，編碼ORF1*的基因不會從pdc操縱子的推定-35和-10啟動子轉錄。
以上述研究為基礎，確定了胃八疊球菌pdc基因可編碼具有552個氨基酸(包括N-末端甲硫氨酸)的多肽，經計算其pI為5.16，無水分子量為61,737Da。胃八疊球菌序列的GenBank登記號為AF354297。
實施例4生產特異性結合PDC多肽的抗體的方法在這個實施例中，描述了生產丙酮酸脫羧酶的免疫特異性抗體的方法。
簡單地說，通過SDS-PAGE分離純化的重組巴氏醋桿菌PDC多肽(300μg)。在用考馬斯藍R-250染色前，切下含有PDC蛋白的凝膠片段。按照供應商(Cocalico Biologicals，Reamstown，Penn.)的建議，它可用作在兔中產生的多克隆抗體的抗原(抗-ApPDC)。為進行免疫印跡分析，通過SDS-PAGE分離蛋白，并于4℃20伏時，轉移到含10％甲醇，pH 6.0的10mM MES中的PVDF薄膜中16小時。為了檢測抗原，免疫印跡過程和比色檢測使用標準技術。一級抗體，抗ApPDC是以1∶7,000的比例稀釋的。使用上述方法，可鑒定特異性結合PDC多肽的多克隆抗血清。
如果需要，可從哺乳動物(例如，血液)中分離PDC的抗體分子，并利用本領域熟知的技術，如A蛋白層析進一步純化，從而獲得IgG部分。此外，在免疫后的適宜時間，例如，當抗-PDC抗體滴定度達到最高時，可從受試者獲得產生抗體的細胞，并用于通過標準技術制備單克隆抗體，如Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497最初描述的雜交瘤技術；還可見，例如，使用抗體實驗室手冊，Harlow等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999))。
實施例5鑒定不同宿主細胞中PDC基因的密碼子使用的方法在這個實施例中，描述了以密碼子使用為基礎，鑒定適于改進表達的PDC多肽的方法。
細菌PDC可用于工程化各種生物體中的乙醇途徑。然而，優(yōu)選確定密碼子使用的適合模式，從而確保在異源系統中功能性表達(4，14，16，22)。G+C含量的簡單列表可作為初步指導。這4個pdc基因的G+C含量從巴氏醋桿菌的60％到胃八疊球菌的31％不等。大腸埃希氏菌ORF的平均G+C含量為52％，與運動發(fā)酵單胞菌pdc的(52％)相同，與棕櫚發(fā)酵細菌pdc的(55％)相似。對于絕大多數氨基酸而言，這兩種生物體的密碼子使用模式彼此十分相似，而且與大腸埃希氏菌也十分相似。棕櫚發(fā)酵細菌的pdc在重組大腸埃希氏菌中高水平功能性表達(活性大約為多肽的1/3)。運動發(fā)酵單胞菌的pdc和巴氏醋桿菌的pdc表達水平較低(活性為多肽的7-9％)，胃八疊球菌的pdc在重組大腸埃希氏菌中的表達更低(活性低于多肽的0.3％)(45)。
為了產生更大量的功能性重組胃八疊球菌PDC，使用含有罕用密碼子，如AGA(精氨酸)，GGA(甘氨酸)，AUA(異亮氨酸)，和CUA(亮氨酸)的其它tRNA基因的修飾大腸埃希氏菌宿主證實對于高水平多肽的產生很重要(活性幾乎為多肽的1/4)(45)。胃八疊球菌pdc中密碼子使用的模式可特別用于G+C含量較低的革蘭氏陽性菌中乙醇途徑的基因工程改造，這一點可通過與胃八疊球菌ORF的比較舉例說明(表1)。相反，巴氏醋桿菌的pdc可被選擇用于工程化G+C含量較高的纖維素解質細菌，如Thermobifidia sp.(23)或纖維單胞菌(35)中的homoethanol途徑。
表1.細菌pdc基因的密碼子使用
pdc(*)和基因組DNA(+)的密碼子使用以每千對堿基的頻率表示。每個氨基酸的密碼子使用百分比在圓括號中表示。不包括終止密碼子?？s寫詞(GenBank登記號)Apa，巴氏醋桿菌pdc(AF368435)；Zpa，棕櫚發(fā)酵細菌pdc(AF474145)；Zmo，運動發(fā)酵單胞菌(M15393)；Sve，(AF354297)；Eco，大腸埃希氏菌；Bsu，胃八疊球菌。
實施例6PDC活性的生化特性在這個實施例中，描述了若干代表性PDC多肽的生化特性。
四個代表性細菌FDC多肽的純化是按照下面表2所述進行的。ZpaPDC是從棕櫚發(fā)酵細菌和重組大腸埃希氏菌純化至均一的。為了進行比較，其它三種細菌PDC是從重組大腸埃希氏菌純化的。PDC還可從巴氏醋桿菌純化。通常，‘天然’PDC的純化還需要其它步驟(即，苯基瓊脂糖和羥磷灰石層析)。這是因為與‘重組’細胞溶解產物相比，‘天然’PDC活性的水平要低10-到250-倍。所有PDC多肽都具有分子量55-60kDa的亞單位，這是由還原SDS-PAGE測定的，與根據推斷多肽序列計算的分子量相一致。
從棕櫚發(fā)酵細菌純化的PDC的N-末端氨基酸序列(MYTVGMYLAE)與根據基因推斷且含有N-末端甲硫氨酸的序列相同。先前的研究已經證實，從胃八疊球菌純化的PDC也保留有N-末端甲硫氨酸，它是賴氨酸殘基的氨基(28，45)。相反，從巴氏醋桿菌純化的PDC的N-末端序列(TYTVGMYLAERL)則缺少N-末端甲硫氨酸，表明已經被天然甲硫氨酸氨肽酶裂解。經測定，從運動發(fā)酵單胞菌純化的PDC也被裂解，顯露出一個N-末端絲氨酸(34)。這些結果與P1’殘基描述的甲硫氨酸氨肽酶的高度保守底物的特異性相一致(5)。如果第二個殘基很小而且不帶電荷，則僅僅除去N-末端甲硫氨酸。該底物的優(yōu)先與多肽降解的‘N-末端規(guī)則’相反(47)。
還進行了PDC多肽四級結構的測定。甚至在除去輔因子TPP和Mg2+之后，ZmoPDC締合為240kDa的四聚物(15)。同樣，SvePDC和ZpaFDC也在輔因子解離后，締合成240kDa的四聚物(沒有給出數據)。有趣的是，ApaPDC可形成具有相似比活性的四聚物和八聚物(224和447kDa)，并在提取輔因子后，解離成二聚物(120kDa)。在加入分別具有3.1μM和5.8μM半飽和常數及1.17-1.22Hill常數的Mg2+和TPP之后，可完全恢復ApaPDC脫輔酶的活性及四聚構型。所有四個細菌PDC的四聚構型都與絕大部分真核PDC的四級結構相一致。然而，在絲狀真菌粗糙鏈孢霉的PDC中，已經觀察到類似ApaPDC的高級結構，其締合為8-10nm的均聚絲(1)。同樣，在植物(玉蜀黍，豌豆，和小麥胚)中，PDC形成1MDa的復合物(24，27，32)。除去輔因子后，ApaPDC到二聚物的解離也與真核PDC相一致(25)。
表2.細菌PDC多肽的純化
PDC-R，從重組大腸埃希氏菌純化的PDC。SvePDC-R表示從大腸埃希氏菌Rosetta(DE3)(pRARE，pJAM419)純化的多肽。在大腸埃希氏菌BL21-CodonPlus-RIL(pJAM419)的細胞溶解產物中沒有檢測到SvePDC-R的活性。圓括號表示最后的純化步驟。Q-瓊脂糖凝膠和Superdex 200是所有細菌PDC共同的純化步驟。
實施例7PDC熱穩(wěn)定性的描述在這個實施例中，描述了若干代表性PDC多肽的熱穩(wěn)定性。
人們已經觀察到，在有輔因子(TPP和Mg2+)存在的條件下，把細胞溶解產物加熱至60℃后，ZmoPDC是熱穩(wěn)定的(11)。為了進一步描述這種現象，在有飽和輔因子存在時，在暴露于各種溫度下之后，分析純化細菌PDC的活性(圖7)。所有三個革蘭氏陰性菌的PDC都是相對熱穩(wěn)定的，并在加熱至60℃30分鐘后，仍然保留有60-100％的活性。相反，在暴露于50℃或更高的溫度下后，純化的SvePDC完全滅活。雖然氨基酸組成不能被用作熱穩(wěn)定性的通用指標(30，31，48)，但還是可以觀察到三個熱穩(wěn)定的PDC都含有較高水平的丙氨酸和半胱氨酸，以及較低水平的苯丙氨酸。這些改變與基于同源酶組成比對的熱穩(wěn)定性的增加相一致(2，31)。丙氨酸水平的增加可通過促進螺旋及更緊密多肽核心的形成而使革蘭氏陰性菌的PDC多肽穩(wěn)定在較高溫度。因此，本發(fā)明還包括已經被改變表達PDC多肽的pdc基因，所述PDC多肽含有相應的半胱氨酸和/或丙氨酸改變，從而獲得熱穩(wěn)定性的改進。此外，對革蘭氏陰性菌的熱穩(wěn)定性PDC的分析揭示，與室溫相比，當在60℃的溫度最優(yōu)值進行測定時，活性增加了2.5倍。以阿侖尼烏斯圖為基礎，經測定，這些酶具有12.6-14.2kJmol-1的活化焓及-92.8到-98.2Jmol-1K-1的熵。
實施例8PDC底物親和性及pH最優(yōu)值的表征在這個實施例中，描述了若干代表性PDC多肽的底物親和性及pH最優(yōu)值。
具體而言，在細菌PDC多肽中觀察到了pH最優(yōu)值的顯著性差異。ZpaPDC在pH 5.5-6.0時活性最高(圖8)，與pH最優(yōu)值為6.0的ZmoPDC相似(34)。然而，ApaPDC的pH最優(yōu)值明顯比其它兩個革蘭氏陰性菌PDC的更低，為5.0-5.5(圖8)。革蘭氏陽性菌SvePDC的pH最優(yōu)值(pH 6.3-7.6)比革蘭氏陰性菌PDC的范圍更寬，而且更偏中性(28)。這表明，在活性位點處或附近，帶電殘基的構象和/或組成有所不同。
真核及細菌SvePDC在有底物丙酮酸存在的條件下，顯示出肯定的協同動力學(9，25，28)。然而，ZpaPDC和ApaPDC則顯示出對丙酮酸的0.2-0.4mM Km值的標準米-曼動力學，和20,500-30,500分-1的Kcat值(pH最優(yōu)值，25℃)(表3)。關于丙酮酸缺少別構調節(jié)，是在革蘭氏陰性菌PDC酶中觀察到的，與運動發(fā)酵單胞菌的高水平相關PDC建立的相似(7，34)。作為進一步的比對，在pH最優(yōu)值和pH7.0下測定所有四種細菌PDC多肽的動力學常數(表3)。該方法被選擇用來分析細菌PDC酶，從而更準確反映先前用于高水平乙醇生產的重組宿主的中性細胞溶膠(例如，大腸埃希氏菌，歐文氏桿菌)。這些適當的pH改變對所有四種細菌PDC多肽的反應最大速率只有輕微的影響。相反，pH可顯著影響革蘭氏陰性菌PDC對丙酮酸的親和性。最顯著的是，當ApaPDC從其pH最優(yōu)值轉換到中性條件下時，觀察到Km增加了13倍。
表3.重組細菌PDC酶的動力學參數
縮寫詞N，標準米-曼動力學；S，S形動力學。SvePDC是從大腸埃希氏菌Rosetta(DE3)(pRARE，pJAM419)純化的。
這些結果表明，所有三種革蘭氏陰性菌PDC具有的氨基酸殘基都可使酶在質子化(pH最優(yōu)值)時，比在去質子化(中性pH)時更有效地結合丙酮酸。然而，該殘基的質子化狀態(tài)不會影響脫羧作用從頭到尾的速率。因為革蘭氏陰性菌PDC的Km改變是在pH 5-7之間觀察到的，因此對于所有三種酶而言，很可能調節(jié)底物結合的殘基是組氨酸。游離組氨酸的pKa為6.04；而，丙酮酸和其它離子化氨基酸殘基(即，Asp，Glu，Lys，和Arg)的pKa不落在此pH范圍之內。
一個或多個組氨酸的質子化對于通過與丙酮酸的羧基形成離子對，或通過制造更多底物接近的活性位點來促進底物結合而言非常重要。也有可能是不同的殘基涉及調節(jié)底物結合；然而，其pKa是通過多肽環(huán)境改變的。
相對于運動發(fā)酵單胞菌的PDC酶而言，pH對kcat/Km和對kcat的作用是用滴定曲線確定的，滴定曲線的pKa值是相對于調節(jié)底物結合的殘基，在6.23-6.45評估的(21，43)。His113的去質子化可導致構象改變，從而產生在催化過程中遮蔽活性位點的可彎曲環(huán)(殘基105-112)(43)。His113和His114在已經描述過的所有PDC多肽中都是保守的。因此，對于在所有三種革蘭氏陰性菌PDC中觀察到的Km的pH-依賴性改變而言，His113是合理的侯選物。然而，可將具有伸進運動發(fā)酵單胞菌PDC活性位點中的離子化側鏈的5個重要殘基(Asp27，Glu50，His113，His114，和Glu473)改變成非離子化或具有改變pKa值的殘基(21)。kcat/Km的pH-依賴性相對不受這些改變的影響，表明與這些殘基，包括His113無關。重要地是，在這種相同的研究中，把His113改變成具有明顯更高pKa值的殘基(即，Arg和Lys)可使ZmoPDC對丙酮酸的親和性增加20倍。
這些結果表明，His113帶正電的形式保存有對底物結合開放的活性位點。
實施例9來源于不同生物體的PDC基因的序列比對在這個實施例中，比較了來源于不同生物體的丙酮酸脫羧酶(PDC)的氨基酸序列。
棕櫚發(fā)酵細菌的推斷PDC多肽(ZpaPDC)含有556個氨基酸(包括N-末端甲硫氨酸)，無水分子量為60,113Da。它與其它三個細菌PDC相似，它們含有552-568個氨基酸，無水分子量為59,830-61,809Da。經計算，ZpaPDC的pI為4.93，與實驗測定的運動發(fā)酵單胞菌PDC的pI(4.87-5.3)相似(7，33)。ZpaPDC中相對較高的丙氨酸含量(13.1％)與革蘭氏陰性菌運動發(fā)酵單胞菌和巴氏醋桿菌PDC(Zmo和ApaPDC)的相似，但幾乎比革蘭氏陽性菌胃八疊球菌PDC(SvePDC)(6.9％)高2倍。多個氨基酸序列的序列比對(圖9)和樹狀聚簇的分析揭示，ZpaPDC與ApaPDC最相關(72％的同一性)，與ZmoPDC高度相關(62％的同一性)。所有三種革蘭氏陰性菌PDC的序列都與植物PDC的序列相似(例如，玉米的PDC；39-40％的同一性)。
相反，革蘭氏陽性菌SvePDC與革蘭氏陰性菌的PDC僅僅30-31％相同，可與絕大部分絲狀真菌和酵母的PDC替換(例如，啤酒糖酵母的PDC1；38％相同)。所有四種細菌PDC都缺少植物界PDC共有的N-末端延伸。以運動發(fā)酵單胞菌和酵母PDC的晶體結構為基礎，涉及TPP和Mg2+結合的殘基在所有四種細菌PDC中都是保守的。相反，以結合丙酮酸類似物丙酮酰胺為基礎(29)，涉及底物活化的酵母PDC1的殘基(Tyr157和Arg224)僅在細菌SvePDC中是保守的，在其余三種細菌PDC中則沒有找到。
把推斷巴氏醋桿菌PDC的氨基酸序列與運動發(fā)酵單胞菌和酵母的PDC序列(PDC1)進行比較，兩者都是通過X-射線晶體照相術分析的(Dyda等，1993；Arjunan等，1996；Lu等，2000；Dobritzsch等，1998)，還有玉米(圖9)。多個序列比對揭示，巴氏醋桿菌的PDC與運動發(fā)酵單胞菌的PDC最相似(62％的同一性和74％的相似性)。與其它植物PDC共有的，玉米PDC的N-末端延伸在真菌或細菌PDC多肽，包括巴氏醋桿菌的PDC多肽中都沒有找到。經證實位于酵母和運動發(fā)酵單胞菌PDC酶的0.4nm TPP和Mg2+結合位點內的殘基在巴氏醋桿菌的PDC多肽序列(V24，D27，E50，T72，V75，N82，H113，H114，T384，D386，G408，I410，D435，S437，L440，I460，N462，G464，I467，E468)中是高度保守的。此外，由Hawkins等(1989)在TPP-依賴性酶中鑒定的，涉及Mg2+和TPP結合的花邊序列在巴氏醋桿菌的PDC多肽序列(G435-N462)中也是保守的。涉及別構調節(jié)，且被證實可結合丙酮酸類似物丙酮酰胺(Lu等，2000)的酵母PDC1的殘基(Tyr157和R224)在巴氏醋桿菌，運動發(fā)酵單胞菌，或玉米的PDC多肽中不是保守的。這些殘基的替換被限制在絕大部分真菌的PDC和來源于革蘭氏陽性菌胃八疊球菌的相關PDC多肽，這些PDC多肽是底物活化的(Lowe和Zeikus，1992)。以在醋酸菌細胞溶解產物中觀察到的，從丙酮酸生產CO2的動力學為基礎(King和Cheldelin，1953)，推斷巴氏醋桿菌的PDC多肽與運動發(fā)酵單胞菌的PDC相似，不是底物活化的。然而，植物PDC不含這些保守殘基，但可由底物調節(jié)，表明PDC多肽之間的別構調節(jié)機理存在著某些不同之處。
以PDC多肽的聚簇分析為基礎，巴氏醋桿菌的PDC與運動發(fā)酵單胞菌的PDC最相關。這一點與這兩種細菌作為革蘭氏陰性α-蛋白細菌的分類相一致。與G+C含量較低的革蘭氏陽性菌胃八疊球菌的PDC形成對照，其中胃八疊球菌的PDC與絕大部分真菌PDC共有近似的進化根，來源于α-蛋白細菌的PDC多肽與植物更相關，而且是一對外類群真菌PDC。
等同物本領域那些技術人員僅僅使用常規(guī)實驗就可認識到，或能夠確定這里所述的本發(fā)明具體實施方案的很多等同物。這種等同物將包括在下列權利要求內。此外，美國專利號5,821,093；5,482,846；5,424,202；5,028,539；5,000,000；5,487,989；5,554,520，和5,162,516中描述的任意數量的遺傳構建體，宿主細胞，和方法都可用于進行本發(fā)明，這些專利引入此處作為參考。
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序列表<110>佛羅里達大學等<120>來源于細菌的丙酮酸脫羧酶(PDC)基因的克隆和測序及其用途<130>BCI-029CPPC<150>60/288,638<151>2001-05-04<150>60/288,671<151>2001-05-04<150>60/288,698<151>2001-05-04<150>60/288,622<151>2001-05-04<150>60/288,699<151>2001-05-04<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1671<212>DNA<213>棕櫚發(fā)酵細菌(Zymobacter palmae)<400>1atgtataccg ttggtatgta cttggcagaa cgcctagccc agatcggcct gaaacaccac 60tttgccgtgg ccggtgacta caacctggtg ttgcttgatc agctcctgct gaacaaagac 120atggagcagg tctactgctg taacgaactt aactgcggct ttagcgccga aggttacgct 180cgtgcacgtg gtgccgccgc tgccatcgtc acgttcagcg taggtgctat ctctgcaatg 240aacgccatcg gtggcgccta tgcagaaaac ctgccggtca tcctgatctc tggctcaccg 300aacaccaatg actacggcac aggccacatc ctgcaccaca ccattggtac tactgactat 360aactatcagc tggaaatggt aaaacacgtt acctgcgcac gtgaaagcat cgtttctgcc 420gaagaagcac cggcaaaaat cgaccacgtc atccgtacgg ctctacgtga acgcaaaccg 480gcttatctgg aaatcgcatg caacgtcgct ggcgctgaat gtgttcgtcc gggcccgatc 540aatagcctgc tgcgtgaact cgaagttgac cagaccagtg tcactgccgc tgtagatgcc 600gccgtagaat ggctgcagga ccgccagaac gtcgtcatgc tggtcggtag caaactgcgt 660gccgctgccg ctgaaaaaca ggctgttgcc ctagcggacc gcctgggctg cgctgtcacg 720atcatggctg ccgaaaaagg cttcttcccg gaagatcatc cgaacttccg cggcctgtac 780tggggtgaag tcagctccga aggtgcacag gaactggttg aaaacgccga tgccatcctg 840
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Gln Asn Val Val Met Leu Val Gly Ser Lys Leu Arg Ala Ala Ala Ala210 215 220Glu Lys Gln Ala Val Ala Leu Ala Asp Arg Leu Gly Cys Ala Val Thr225 230 235 240Ile Met Ala Ala Glu Lys Gly Phe Phe Pro Glu Asp His Pro Asn Phe245 250 255Arg Gly Leu Tyr Trp Gly Glu Val Ser Ser Glu Gly Ala Gln Glu Leu260 265 270Val Glu Asn Ala Asp Ala Ile Leu Cys Leu Ala Pro Val Phe Asn Asp275 280 285Tyr Ala Thr Val Gly Trp Asn Ser Trp Pro Lys Gly Asp Asn Val Met290 295 300Val Met Asp Thr Asp Arg Val Thr Phe Ala Gly Gln Ser Phe Glu Gly305 310 315 320Leu Ser Leu Ser Thr Phe Ala Ala Ala Leu Ala Glu Lys Ala Pro Ser325 330 335Arg Pro Ala Thr Thr Gln Gly Thr Gln Ala Pro Val Leu Gly Ile Glu340 345 350Ala Ala Glu Pro Asn Ala Pro Leu Thr Asn Asp Glu Met Thr Arg Gln355 360 365Ile Gln Ser Leu Ile Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ala Glu Thr Gly370 375 380Asp Ser Trp Phe Asn Ala Ser Arg Met Pro Ile Pro Gly Gly Ala Arg385 390 395 400Val Glu Leu Glu Met Gln Trp Gly His Ile Gly Trp Ser Val Pro Ser405 410 415Ala Phe Gly Asn Ala Val Gly Ser Pro Glu Arg Arg His Ile Met Met420 425 430Val Gly Asp Gly Ser Phe Gln Leu Thr Ala Gln Glu Val Ala Gln Met435 440 445Ile Arg Tyr Glu Ile Pro Val Ile Ile Phe Leu Ile Asn Asn Arg Gly450 455 460Tyr Val Ile Glu Ile Ala Ile His Asp Gly Pro Tyr Asn Tyr Ile Lys465 470 475 480Asn Trp Asn Tyr Ala Gly Leu Ile Asp Val Phe Asn Asp Glu Asp Gly485 490 495His Gly Leu Gly Leu Lys Ala Ser Thr Gly Ala Glu Leu Glu Gly Ala500 505 510Ile Lys Lys Ala Leu Asp Asn Arg Arg Gly Pro Thr Leu Ile Glu Cys515 520 525Asn Ile Ala Gln Asp Asp Cys Thr Glu Thr Leu Ile Ala Trp Gly Lys530 535 540Arg Val Ala Ala Thr Asn Ser Arg Lys Pro Gln Ala545 550 555<210>3<211>1674
<212>DNA<213>巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)<400>3gtgacctata ctgttggcat gtatcttgca gaacgccttg tacagatcgg gctgaagcat 60cacttcgccg tgggcggcga ctacaatctc gttcttctgg atcagttgct cctcaacaag 120gacatgaaac agatctattg ctgcaatgag ttgaactgtg gcttcagcgc ggaaggctac 180gcccgttcta acggggctgc ggcagcggtt gtcaccttca gcgttggcgc catttccgcc 240atgaacgccc tcggcggcgc ctatgccgaa aacctgccgg ttatcctgat ttccggcgcg 300cccaacagca atgatcaggg cacaggtcat atcctgcatc acacaatcgg caagacggat 360tacagctacc agcttgaaat ggcccgtcag gtcacctgtg ccgccgaaag cattaccgac 420gctcactccg ccccggccaa gattgaccac gtcattcgca cggcgctgcg cgagcgtaag 480ccggcctatc tggacatcgc gtgcaacatt gcctccgagc cctgcgtgcg gcctggccct 540gtcagcagcc tgctgtccga gcctgaaatc gaccacacga gcctgaaggc cgcagtggac 600gccacggttg ccttgctgaa aaatcggcca gcccccgtca tgctgctggg cagcaagctg 660cgggccgcca acgcactggc cgcaaccgaa acgctggcag acaagctgca atgcgcggtg 720accatcatgg cggccgcgaa aggctttttc cccgaagacc acgcgggttt ccgcggcctg 780tactggggcg aagtctcgaa ccccggcgtg caggaactgg tggagacctc cgacgcactg 840ctgtgcatcg cccccgtatt caacgactat tcaacagtcg gctggtcggg catgcccaag 900ggccccaatg tgattctggc tgagcccgac cgcgtaacgg tcgatggccg cgcctatgac 960ggctttaccc tgcgcgcctt cctgcaggct ctggcggaaa aagcccccgc gcgcccggcc 1020tccgcacaga aaagcagcgt cccgacgtgc tcgctcaccg cgacatccga tgaagccggt 1080ctgacgaatg acgaaatcgt ccgtcatatc aacgccctgc tgacatcaaa cacgacgctg 1140gtggcagaaa ccggcgattc atggttcaat gccatgcgca tgaccctggc cggtgcgcgc 1200gtggaactgg aaatgcagtg gggccatatc ggctggtccg tgccctccgc gttcggcaat 1260gccatgggct cgcaggaccg ccagcatgtg gtgatggtag gcgatggctc cttccagctt 1320accgcgcagg aagtggctca gatggtgcgc tacgaactgc ccgtcattat ctttctgatc 1380aacaaccgtg gctatgtcat tgaaatcgcc attcatgacg gcccgtacaa ctatatcaag 1440aactgggatt acgccggcct gatggaagtc ttcaacgccg gagaaggcca tggacttggc 1500ctgaaagcca ccaccccgaa ggaactgaca gaagccatcg ccagggcaaa agccaatacc 1560cgcggcccga cgctgatcga atgccagatc gaccgcacgg actgcacgga tatgctggtt 1620caatggggcc gcaaggttgc ctcaaccaac gcgcgcaaga ccactctggc ctga 1674<210>4<211>557<212>PRT<213>巴氏醋桿菌<400>4Met Thr Tyr Thr Val Gly Met Tyr Leu Ala Glu Arg Leu Val Gln Ile1 5 10 15Gly Leu Lys His His Phe Ala Val Gly Gly Asp Tyr Asn Leu Val Leu20 25 30Leu Asp Gln Leu Leu Leu Asn Lys Asp Met Lys Gln Ile Tyr Cys Cys35 40 45Asn Glu Leu Asn Cys Gly Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Asn50 55 60
Gly Ala Ala Ala Ala Val Val Thr Phe Ser Val Gly Ala Ile Ser Ala65 70 75 80Met Asu Ala Leu Gly Gly Ala Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Ile Leu85 90 95Ile Ser Gly Ala Pro Asn Ser Asn Asp Gln Gly Thr Gly His Ile Leu100 105 110His His Thr Ile Gly Lys Thr Asp Tyr Ser Tyr Gln Leu Glu Met Ala115 120 125Arg Gln Val Thr Cys Ala Ala Glu Ser Ile Thr Asp Ala His Ser Ala130 135 140Pro Ala Lys Ile Asp His Val Ile Arg Thr Ala Leu Arg Glu Arg Lys145 150 155 160Pro Ala Tyr Leu Asp Ile Ala Cys Asn Ile Ala Ser Glu Pro Cys Val165 170 175Arg Pro Gly Pro Val Ser Ser Leu Leu Ser Glu Pro Glu Ile Asp His180 185 190Thr Ser Leu Lys Ala Ala Val Asp Ala Thr Val Ala Leu Leu Lys Asn195 200 205Arg Pro Ala Pro Val Met Leu Leu Gly Ser Lys Leu Arg Ala Ala Asn210 215 220Ala Leu Ala Ala Thr Glu Thr Leu Ala Asp Lys Leu Gln Cys Ala Val225 230 235 240Thr Ile Met Ala Ala Ala Lys Gly Phe Phe Pro Glu Asp His Ala Gly245 250 255Phe Arg Gly Leu Tyr Trp Gly Glu Val Ser Asn Pro Gly Val Gln Glu260 265 270Leu Val Glu Thr Ser Asp Ala Leu Leu Cys Ile Ala Pro Val Phe Asn275 280 285Asp Tyr Ser Thr Val Gly Trp Ser Gly Met Pro Lys Gly Pro Asn Val290 295 300Ile Leu Ala Glu Pro Asp Arg Val Thr Val Asp Gly Arg Ala Tyr Asp305 310 315 320Gly Phe Thr Leu Arg Ala Phe Leu Gln Ala Leu Ala Glu Lys Ala Pro325 330 335Ala Arg Pro Ala Ser Ala Gln Lys Ser Ser Val Pro Thr Cys Ser Leu340 345 350Thr Ala Thr Ser Asp Glu Ala Gly Leu Thr Asn Asp Glu Ile Val Arg355 360 365His Ile Asn Ala Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Leu Val Ala Glu Thr370 375 380Gly Asp Ser Trp Phe Asn Ala Met Arg Met Thr Leu Ala Gly Ala Arg385 390 395 400Val Glu Leu Gln Met Gln Trp Gly His Ile Gly Trp Ser Val Pro Ser405 410 415Ala Phe Gly Asn Ala Met Gly Ser Gln Asp Arg Gln His Val Val Met420 425 430Val Gly Asp Gly Ser Phe Gln Leu Thr Ala Gln Glu Val Ala Gln Met
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ttcaaagtta caactgaaaa agaattagca gctgcaatgg aagaaataaa caaaggaaca 1560gaaggtattg cttttgttga agtagtaatg gataaaatgg atgctccaaa atcattaaga 1620caagaagcaa gtctatttag ttctcaaaat aactactaa1659<210>6<211>552<212>PRT<213>胃八疊球菌<400>6Met Lys Ile Thr Ile Ala Glu Tyr Leu Leu Lys Arg Leu Lys Glu Val1 5 10 15Asn Val Glu His Met Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gly Phe20 25 30Leu Asp Tyr Val Glu Asp Ser Lys Asp Ile Glu Trp Val Gly Ser Cys35 40 45Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Leu Arg50 55 60Gly Phe Gly Val Ile Leu Thr Thr Tyr Gly Val Gly Ser Leu Ser Ala65 70 75 80Ile Asn Ala Thr Thr Gly Ser Phe Ala Glu Asn Val Pro Val Leu His85 90 95Ile Ser Gly Val Pro Ser Ala Leu Val Gln Gln Asn Arg Lys Leu Val100 105 110His His Ser Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp Thr Phe Glu Arg Met Phe115 120 125Arg Glu Ile Thr Glu Phe Gln Ser Ile Ile Ser Glu Tyr Asn Ala Ala130 135 140Glu Glu Ile Asp Arg Val Ile Glu Ser Ile Tyr Lys Tyr Gln Leu Pro145 150 155 160Gly Tyr Ile Glu Leu Pro Val Asp Ile Val Ser Lys Glu Ile Glu Ile165 170 175Asp Glu Met Lys Pro Leu Asn Leu Thr Met Arg Ser Asn Glu Lys Thr180 185 190Leu Glu Lys Phe Val Asn Asp Val Lys Glu Met Val Ala Ser Ser Lys195 200 205Gly Gln His Ile Leu Ala Asp Tyr Glu Val Leu Arg Ala Lys Ala Glu210 215 220Lys Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ile Pro Val Asn Thr225 230 235 240Leu Ser Ile Gly Lys Thr Ala Val Ser Glu Ser Asn Pro Tyr Phe Ala245 250 255Gly Leu Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Asp Leu Val Lys Glu Leu Cys260 265 270Lys Ala Ser Asp Ile Val Leu Leu Phe Gly Val Lys Phe Ile Asp Thr275 280 285Thr Thr Ala Gly Phe Arg Tyr Ile Asn Lys Asp Val Lys Met Ile Glu
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ccagaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgattaaaa ctgctcttcg tgagaagaag 480ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc cctgcgccgc tcctggaccg 540gcaagcgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagctt ctttgaatgc agcggttgaa 600gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg tcctcgtcgg cagcaagctg 660cgcgcagctg gtgctgaaga agctgctgtc aaatttgctg atgctctcgg tggcgcagtt 720gctaccatgg ctgctgcaaa aagcttcttc ccagaagaaa acccgcatta catcggtacc 780tcatggggtg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga tgaaagaagc cgatgcggtt 840atcgctctgg ctcctgtctt caacgactac tccaccactg gttggacgga tattcctgat 900cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgtcg ttaacggcgt tcgcttcccc 960agcgttcatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga aagtttccaa gaaaaccggt 1020gctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140accacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acatcggttg gtccgttcct 1260gcegccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtc gctcagatgg ttcgcctgaa actgccggtt 1380atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500ggttatgaca gcggtgctgg taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707<210>8<211>568<212>PRT<213>運動發(fā)酵單孢菌<400>8Met Ser Tyr Thr Val Gly Thr Tyr Leu Ala Glu Arg Leu Val Gln Ile1 5 10 15Gly Leu Lys His His Phe Ala Val Ala Gly Asp Tyr Asn Leu Val Leu20 25 30Leu Asp Asn Leu Leu Leu Asn Lys Asn Met Glu Gln Val Tyr Cys Cys35 40 45Asn Glu Leu Asn Cys Gly Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Lys50 55 60Gly Ala Ala Ala Ala Val Val Thr Tyr Ser Val Gly Ala Leu Ser Ala65 70 75 80Phe Asp Ala Ile Gly Gly Ala Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Ile Leu85 90 95Ile Ser Gly Ala Pro Asn Asn Asn Asp His Ala Ala Gly His Val Leu100 105 110His His Ala Leu Gly Lys Thr Asp Tyr His Tyr Gln Leu Glu Met Ala115 120 125Lys Asn Ile Thr Ala Ala Ala Glu Ala Ile Tyr Thr Pro Glu Glu Ala130 135 140
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<223>primer<221>misc_特征<222>3，6，18<223>r＝a或g<221>misc_特征<222>12，21，27<223>y＝c或t
<221>misc_特征<222>9，15，30<223>n＝任意核苷酸堿基<400>11aargargtna aygtngarca yatgttyggn gt3權利要求
1.一種分離的核酸分子，選自a)所含核苷酸序列與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的核苷酸序列至少60％同源的核酸分子，或其互補序列；b)含有一種核酸的至少000個核苷酸的片段的核酸分子或其互補序列，前一種核酸含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5的核苷酸序列；c)編碼一種多肽的核酸分子，該多肽所含的氨基酸序列與SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列至少約50％同源；d)編碼一種多肽的片段的核酸分子，該多肽含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列；其中該片段含有SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列的至少15個連續(xù)氨基酸殘基；和e)編碼一種多肽的天然存在的等位基因變體的核酸分子，該多肽含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列；其中所述核酸分子在嚴格條件下與含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的核酸分子的互補序列雜交。
2.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，選自a)含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5的核苷酸序列的核酸分子，或其互補序列；和b)編碼一種多肽的核酸分子，該多肽含有SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的核酸分子，它進一步含有載體核酸序列。
4.根據權利要求1所述的核酸分子，它與替代啟動子可操作性連接。
5.根據權利要求1所述的核酸分子，它進一步含有編碼異源多肽的核酸序列。
6.一種含有權利要求1所述的核酸分子的宿主細胞。
7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自革蘭氏陰性菌細胞和革蘭氏陽性菌細胞。
8.根據權利要求6所述的宿主細胞，其中所述革蘭氏陰性菌細胞選自葡糖桿菌，根瘤菌，慢生根瘤菌，產堿菌，紅細菌，紅球菌，固氮螺菌，紅螺菌，鞘氨醇單胞菌，伯克霍爾德氏菌，脫硫單胞菌，Gepspirillum，琥珀酸單胞菌，氣單胞菌，希瓦氏菌，Halochromatium，檸檬酸桿菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，發(fā)酵單胞菌，發(fā)酵細菌，和醋桿菌。
9.根據權利要求6所述的宿主細胞，其中所述革蘭氏陽性菌細胞選自絲狀桿菌，酸桿菌，擬桿菌，鞘氨醇桿菌，放線菌，棒桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，丙酸桿菌，雙岐桿菌，芽孢桿菌，Geobacillus，類芽孢桿菌，硫化桿菌，梭菌，Anaerobacter，真桿菌，鏈球菌，乳桿菌，明串珠菌，腸球菌，乳球菌，Thermobifida，纖維單胞菌，和八疊球菌。
10.一種分離的多肽，選自a)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽的片段，其中該片段含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的至少15個連續(xù)氨基酸；b)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中該多肽由在嚴格條件下與含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的核酸分子的互補序列雜交的核酸分子編碼；c)由一種核酸分子編碼的多肽，該核酸分子所含的核苷酸序列與含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的核苷酸序列的核酸至少50％同源；d)所含氨基酸序列與SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列至少30％同源的多肽。
11.根據權利要求10所述的分離多肽，它含有SEQ ID NO2，SEQID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列。
12.根據權利要求10或11任何一項所述的多肽，其中所述多肽具有改進的脫羧酶活性。
13.根據權利要求10或11任何一項所述的多肽，其中所述多肽具有改進的熱穩(wěn)定性。
14.根據權利要求10或11任何一項所述的多肽，其中所述多肽具有改進的底物親和性。
15.根據權利要求10或11任何一項所述的多肽，它進一步含有異源氨基酸序列。
16.一種選擇性結合權利要求10或11所述多肽的抗體。
17.一種生產多肽的方法，包括在表達核酸分子的條件下培養(yǎng)權利要求6所述的宿主細胞，所述多肽選自a)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽；b)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽的片段，其中該片段含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的至少15個連續(xù)氨基酸；c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中該多肽由在嚴格條件下與含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的核酸分子的互補序列雜交的核酸分子編碼。
18.一種檢測樣品中是否存在權利要求10或11所述多肽的方法，包括a)使樣品接觸選擇性結合所述多肽的化合物；并b)確定所述化合物是否結合樣品中的多肽，由此檢測樣品中是否存在權利要求10所述的多肽。
19.根據權利要求18所述的方法，其中結合多肽的化合物是抗體。
20.一種檢測樣品中是否存在權利要求1所述的核酸分子的方法，包括a)使樣品接觸與核酸分子的互補序列選擇性雜交的核酸探針或引物；并b)確定所述核酸探針或引物是否結合樣品中的核酸分子，由此檢測樣品中是否存在權利要求1所述的核酸分子。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述樣品含有mRNA分子，并與核酸探針接觸。
22.一種試劑盒，它含有與權利要求1所述的核酸分子互補序列選擇性雜交的化合物，以及使用說明。
23.一種含有編碼丙酮酸脫羧酶的異源核酸序列的重組宿主細胞，其中的核酸序列是為改進所述宿主細胞中的密碼子使用而選擇的。
24.一種含有編碼丙酮酸脫羧酶的異源核酸序列的重組宿主細胞，其中的核酸序列是為改進脫羧酶活性而選擇的。
25.一種含有編碼丙酮酸脫羧酶的異源核酸序列的重組宿主細胞，其中的核酸序列是為改進熱穩(wěn)定性而選擇的。
26.根據權利要求23所述的宿主細胞，其中所述編碼丙酮酸脫羧酶的異源核酸序列與替代啟動子可操作性連接。
27.根據權利要求23所述的宿主細胞，其中所述編碼丙酮酸脫羧酶的異源核酸序列來源于選自棕櫚發(fā)酵細菌，巴氏醋桿菌，和胃八疊球菌的細菌細胞。
28.根據權利要求23-26任何一項所述的宿主細胞，其中所述異源核酸序列選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO5。
29.根據權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步含有編碼選自醇脫氫酶，葡聚糖酶，和分泌酶的多肽的核酸。
30.根據權利要求29所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步含有編碼醇脫氫酶的核酸。
31.根據權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是產乙醇的。
32.根據權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞適于從糖發(fā)酵乙醇。
33.根據權利要求23-26任何一項所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞是選自革蘭氏陰性菌細胞和革蘭氏陽性菌細胞的細菌細胞。
34.根據權利要求33所述的宿主細胞，其中所述革蘭氏陰性菌細胞選自葡糖桿菌，根瘤菌，慢生根瘤菌，產堿菌，紅細菌，紅球菌，固氮螺菌，紅螺菌，鞘氨醇單胞菌，伯克霍爾德氏菌，脫硫單胞菌，Gepspirillum，琥珀酸單胞菌，氣單胞菌，希瓦氏菌，Halochromatium，檸檬酸桿菌，埃希氏菌，克雷伯氏菌，發(fā)酵單胞菌，發(fā)酵細菌，和醋桿菌。
35.根據權利要求33所述的宿主細胞，其中所述革蘭氏陽性菌細胞選自絲狀桿菌，酸桿菌，擬桿菌，鞘氨醇桿菌，放線菌，棒桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，丙酸桿菌，雙岐桿菌，芽孢桿菌，Geobacillus，類芽孢桿菌，硫化桿菌，梭菌，Anaerobacter，真桿菌，鏈球菌，乳桿菌，明串珠菌，腸球菌，乳球菌，Thermobifida，纖維單胞菌，和八疊球菌。
36.一種含有編碼PDC的異源核酸的重組產乙醇宿主細胞，該PDC選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO6，其中所述核酸受到外源替代啟動子的轉錄控制。
37.一種生產乙醛的方法，包括在以充分水平表達丙酮酸脫羧酶的條件下培養(yǎng)權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞，從而自丙酮酸生產乙醛。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述宿主細胞進一步含有選自醇脫氫酶，分泌酶，和葡聚糖酶的產乙醇基因。
39.一種生產乙醛的方法，包括在從丙酮酸生產乙醛的條件下，接觸從權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞獲得的細胞溶解產物。
40.一種生產乙醇的方法，包括在以充分水平表達丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的條件下，培養(yǎng)權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞，從而生產作為主要發(fā)酵產物的乙醇。
41.根據權利要求38所述的方法，其中所述方法是在水溶液中進行的。
42.根據權利要求40所述的方法，其中所述方法是在水溶液中進行的。
43.一種酶提取物，它含有可檢測水平的丙酮酸脫羧酶，所述丙酮酸脫羧酶來源于權利要求6和23-26任何一項所述的宿主細胞。
44.根據權利要求37所述的酶提取物，其中所述丙酮酸脫羧酶具有改進的脫羧酶活性。
45.根據權利要求40所述的酶提取物，其中所述丙酮酸脫羧酶具有改進的脫羧酶活性。
46.根據權利要求43所述的酶提取物，其中所述丙酮酸脫羧酶具有改進的熱穩(wěn)定性。
47.根據權利要求43所述的酶提取物，其中所述丙酮酸脫羧酶具有改進的底物親和性。
48.一種選擇具有改進的脫羧酶活性的丙酮酸脫羧酶的方法，包括把丙酮酸脫羧酶的氨基酸序列與SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的氨基酸序列進行比較；并改變所述丙酮酸脫羧酶的至少一個氨基酸殘基，使其與SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6的相應氨基酸殘基具有同一性；從而獲得改進的丙酮酸脫羧酶活性。
49.根據權利要求48所述的方法，其中所述的丙酮酸脫羧酶活性包括改進的，對丙酮酸的丙酮酸脫羧酶親和性。
50.根據權利要求48所述的方法，其中所述的丙酮酸脫羧酶活性包括改進的熱穩(wěn)定性。
51.一種選擇在受體宿主細胞中的表達改進的丙酮酸脫羧酶的方法，包括把編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列與SEQ ID NO1，SEQ ID NO 3，或SEQ ID NO5的核酸序列進行比較；并改變所述編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的至少一個密碼子，使其與SEQID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的相應密碼子具有同一性，從而在所述宿主細胞中獲得所述改變過的、編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的表達的改進。
52.一種選擇在受體宿主細胞中的表達改進的丙酮酸脫羧酶的方法，包括把編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列與該受體宿主細胞的密碼子使用進行比較；改變所述編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的至少一個密碼子，使其相應于所述受體宿主細胞的密碼子使用，從而在所述宿主細胞中獲得所述改變過的、編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的表達的改進。
53.一種選擇在受體宿主細胞中的表達改進的丙酮酸脫羧酶的方法，包括把編碼丙酮酸脫羧酶的核酸序列與該受體宿主細胞的密碼子使用進行比較；改變所述受體宿主細胞，以便重組產生至少一個相應于編碼所述丙酮酸脫羧酶的核酸的密碼子的tRNA，從而在所述宿主細胞中獲得所述編碼丙酮酸脫羧酶的核酸的表達的改進。
54.編碼來源于棕櫚發(fā)酵細菌的pdc基因的質粒pJAM3440，其中所述質粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATTC------。
55.編碼來源于巴氏醋桿菌的pdc基因的質粒pJAM304，其中所述質粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATTC------。
56.編碼來源于胃八疊球菌的pdc基因的質粒pJAM419，其中所述質粒保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATTC------。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼丙酮酸脫羧酶的分離核酸分子，所述丙酮酸脫羧酶具有改進的脫羧酶活性，底物親和性，熱穩(wěn)定性，和在不同pH值下的活性。本發(fā)明的核酸還具有允許在各種宿主細胞中高水平表達的密碼子使用。因此，本發(fā)明提供含有這種核酸分子的重組表達載體，含有該表達載體的重組宿主細胞，進一步含有其它產乙醇酶的宿主細胞，以及使用這種宿主細胞生產有用物質，如乙醛和乙醇的方法。
文檔編號C12N9/10GK1678735SQ02813514
公開日2005年10月5日 申請日期2002年4月29日 優(yōu)先權日2001年5月4日
發(fā)明者J·A·毛平－福爾羅, L·A·塔拉里科, K·C·拉, L·O·因格拉姆 申請人:佛羅里達大學研究基金會有限公司