本發(fā)明屬于生物信息學及分子細胞遺傳學領(lǐng)域，尤其涉及一種棉花體細胞染色體Oligo-FISH方法。

背景技術(shù)：

染色體涂染技術(shù)是細胞遺傳學研究領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一，是準確識別和區(qū)分染色體及其區(qū)段的重要手段。探針的選擇是染色體涂染技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。典型的涂染探針多來自于克隆的基因組片段或流式分揀的染色體，經(jīng)過缺刻平移或者PCR擴增直接或間接熒光標記。標記后的探針長度多在150～250bp，這樣在雜交過程中易于滲透到固定的細胞。由于許多基因組克隆和流式分揀的染色體富含基因組重復序列，雜交過程通常需要使用未標記的基因組重復序列(Cot1DNA)進行封阻。染色體上順序排列的克隆混合成的探針也可以用來涂染較大的染色體區(qū)域，但這種方法通常都具有挑戰(zhàn)性，因為雜交之前每個克隆需要分別進行DNA提取與標記，這些探針的效率由于隨機標記和片段化的原因穩(wěn)定性難以保障，在復雜植物基因組中的應(yīng)用更表現(xiàn)了很大局限性，因此多在基因組相對較小、復雜度低的植物物種中應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種棉花體細胞染色體Oligo-FISH方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明設(shè)計oligos的基因組是二倍體D基因組野生種雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)基因組(Paterson et al.2012)；原位雜交所用棉花材料為二倍體D基因組雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)，種植于海南三亞中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所海南野生棉花種植園，并且在河南安陽中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所溫室有備份；具體方法包括雷蒙德氏棉第1號染色體的寡核苷酸混合池設(shè)計和寡核酸探針的標記；

所述雷蒙德氏棉第1號染色體的寡核苷酸混合池設(shè)計包括以下步驟：

(1)用RepeatMasker系統(tǒng)去除雷蒙德氏棉基因組第1號染色體序列中所有重復序列；

(2)去重復的染色體序列分成含有48個堿基的寡核苷酸片段(每個片段間步移5個堿基)；

(3)獲得的寡核苷酸片段通過BLAT系統(tǒng)與D₅參考基因組進行匹配；

(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)來計算Tm值和發(fā)卡Tm值，留下dTm(dTm＝Tm–發(fā)卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；

(5)利用Python和R系統(tǒng)識別并排除非單一序列，獲得染色體特異、基因組中唯一的序列組成該染色體寡核苷酸混合池；

所述寡核酸探針的標記包括以下步驟：

1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列為模板進行乳化PCR擴增，擴增程序：98℃2min；接著30個循環(huán)的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；

2)體外轉(zhuǎn)錄，擴增產(chǎn)物作為模版進行體外(T₇)轉(zhuǎn)錄；

3)反轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA用新的5’端帶有生物素或地高辛標記的R引物進行反轉(zhuǎn)錄；

4)酶解去除RNA；獲得帶標記的單鏈ssDNA分子，即標記好的寡核苷酸探針；1.2.3Oligo-FISH

5)取材及預處理：取種子在溫水中浸泡過夜，種植于滅菌潮濕的沙土中，然后在光照培養(yǎng)箱里28～30℃培養(yǎng)，待根長至1～2cm時，截取根尖用25ppm放線菌酮25℃下處理2h，然后用蒸餾水沖洗，用卡諾固定液固定24h以上，備用；

6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸餾水沖洗數(shù)次，混合酶液(2％纖維素酶+1％果膠酶)處理，37℃，45min；

7)制片：用60％乙酸進行壓片，保留下好的制片在-80℃冷凍4h以上；-80℃取出，迅速揭掉蓋片，80℃烤干，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

8)熒光原位雜交流程，參照王春英等(2001)介紹的方法；地高辛標記的探針在熒光顯微鏡下觀察顯示紅色；生物素標記在熒光顯微鏡下觀察顯示為綠色；染色體用DAPI襯染在熒光顯微鏡下觀察顯示藍色；

9)熒光顯微鏡觀察：用Zeiss熒光顯微鏡觀察熒光信號，用Zeiss-Isis成像系統(tǒng)軟件進行熒光原位雜交圖像的獲取、采集、加工。

具體的，所述步驟1)中每個寡核苷酸合成的oligo含有48個基因組序列堿基，5’F引物，包括T₇RNA多聚酶啟動子序列和3’R引物；通過乳化PCR的方法進行擴增。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種棉花體細胞染色體Oligo-FISH方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明根據(jù)公布的棉花基因組序列信息，設(shè)計單染色體的寡核苷酸混合池，寡核苷酸混合池經(jīng)過乳化PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄，獲得熒光標記的ssDNA混合池，即目標染色體的寡核苷酸混合探針。以此探針對棉花體細胞中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，建立棉花寡核苷酸FISH方法(Oligo-FISH)，為棉花染色體DNA重排、染色體配對、親緣關(guān)系分析、異源染色質(zhì)鑒定等提供技術(shù)支持。

附圖說明

圖1乳化PCR產(chǎn)物和標記探針的電泳檢測。a-1，對照1(空白)；a-2，對照2(非乳化PCR產(chǎn)物)；a-3，乳化PCR產(chǎn)物；b-1，標記的探針。

圖2雷蒙德氏棉有絲分裂中期染色體Oligo-FISH。a，DAPI襯染；b，生物素標記的45S rDNA信號；c，地高辛標記的oligos探針信號；d，整合圖片；a和d中白色箭頭指示的為D₅01染色體。Bar＝5μm。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

如圖1所示：本發(fā)明設(shè)計oligos的基因組是二倍體D基因組野生種雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)基因組(Paterson et al.2012)；原位雜交所用棉花材料為二倍體D基因組雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)，種植于海南三亞中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所海南野生棉花種植園，并且在河南安陽中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所溫室有備份；具體方法包括雷蒙德氏棉第1號染色體的寡核苷酸混合池設(shè)計和寡核酸探針的標記；

所述雷蒙德氏棉第1號染色體的寡核苷酸混合池設(shè)計包括以下步驟：

(1)用RepeatMasker系統(tǒng)去除雷蒙德氏棉基因組第1號染色體序列中所有重復序列；

(2)去重復的染色體序列分成含有48個堿基的寡核苷酸片段(每個片段間步移5個堿基)；

(3)獲得的寡核苷酸片段通過BLAT系統(tǒng)與D₅參考基因組進行匹配；

(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)來計算Tm值和發(fā)卡Tm值，留下dTm(dTm＝Tm–發(fā)卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；

(5)利用Python和R系統(tǒng)識別并排除非單一序列，獲得染色體特異、基因組中唯一的序列組成該染色體寡核苷酸混合池；

所述寡核酸探針的標記包括以下步驟：

1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列為模板進行乳化PCR擴增，擴增程序：98℃2min；接著30個循環(huán)的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；

2)體外轉(zhuǎn)錄，擴增產(chǎn)物作為模版進行體外(T₇)轉(zhuǎn)錄；

3)反轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA用新的5’端帶有生物素或地高辛標記的R引物進行反轉(zhuǎn)錄；

4)酶解去除RNA；獲得帶標記的單鏈ssDNA分子，即標記好的寡核苷酸探針；1.2.3Oligo-FISH

5)取材及預處理：取種子在溫水中浸泡過夜，種植于滅菌潮濕的沙土中，然后在光照培養(yǎng)箱里28～30℃培養(yǎng)，待根長至1～2cm時，截取根尖用25ppm放線菌酮25℃下處理2h，然后用蒸餾水沖洗，用卡諾固定液固定24h以上，備用；

6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸餾水沖洗數(shù)次，混合酶液(2％纖維素酶+1％果膠酶)處理，37℃，45min；

7)制片：用60％乙酸進行壓片，保留下好的制片在-80℃冷凍4h以上；-80℃取出，迅速揭掉蓋片，80℃烤干，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

8)熒光原位雜交流程，參照王春英等(2001)介紹的方法；地高辛標記的探針在熒光顯微鏡下觀察顯示紅色；生物素標記在熒光顯微鏡下觀察顯示為綠色；染色體用DAPI襯染在熒光顯微鏡下觀察顯示藍色；

9)熒光顯微鏡觀察：用Zeiss熒光顯微鏡觀察熒光信號，用Zeiss-Isis成像系統(tǒng)軟件進行熒光原位雜交圖像的獲取、采集、加工。

具體的，所述步驟1)中每個寡核苷酸合成的oligo含有48個基因組序列堿基，5’F引物，包括T₇RNA多聚酶啟動子序列和3’R引物；通過乳化PCR的方法進行擴增。

實驗結(jié)果

通過RepeatMaster軟件先去除該染色體上的重復序列，然后根據(jù)oligo的長度、序列相似性、Tm值等的選擇，去除不符合要求的序列，保留染色體特異、序列唯一的該染色體oligos。我們得到的D₅01染色體oligos有19,786個，根據(jù)基因組數(shù)據(jù)，該染色體長度62,769,430bp，因此可以計算在染色體的密度是每kb有0.315個oligos。

通過乳化PCR方法擴增所設(shè)計的oligos，使之大量擴增(圖1a-3)，對照1(空白)沒有擴增出條帶(圖1a-1)，對照2(非乳化PCR)擴增出非乳化PCR產(chǎn)物(圖1a-2)。反轉(zhuǎn)錄引物帶有生物素或地高辛標記，所以去除RNA后的單鏈DNA可以作為探針，片段大小在68bp左右(圖1b-1)，直接作為探針進行FISH研究。

以雷蒙德氏棉體細胞有絲分裂中期染色體為靶DNA，生物素標記的45S rDNA和地高辛標記的雷蒙德氏棉D(zhuǎn)₅01染色體oligos為探針，進行了雙色熒光原位雜交。所設(shè)計和標記的探針在雷蒙德氏棉有絲分裂中期染色體上產(chǎn)生1對特異的彌散信號，實現(xiàn)D₅01染色體的準確識別(圖2)。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。