本發(fā)明涉及與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的Sipa1(signal-induced proliferation-associating 1)基因啟動子甲基化水平的檢測，具體地說，涉及一種利用一對特異性引物進(jìn)行Sipa1基因啟動子區(qū)域甲基化水平的檢測，進(jìn)而推斷Sipa1蛋白在測定樣本中的表達(dá)水平，將為乳腺癌等癌癥的早期檢測與發(fā)現(xiàn)、新藥篩選與研制、治療與效果評價提供一種技術(shù)方法，可以用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及腫瘤生物學(xué)等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥是當(dāng)今對人類傷害最大的疾病，人群多，存活率低，難以治療。其中乳腺癌是女性中最常被診斷的癌癥，早期診斷和精準(zhǔn)治療是提高生存率、降低復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。已有研究表面，Sipa1蛋白與多種正常組織的病變和癌細(xì)胞的增殖、粘附、浸潤、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，會促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、浸潤與轉(zhuǎn)移，同時也有報道證明Sipa1蛋白與結(jié)直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌和黑色素瘤等癌癥的轉(zhuǎn)移、浸潤、增殖或移動等相關(guān)。

Sipa1蛋白即信號誘導(dǎo)增殖相關(guān)蛋白1，Sipa1基因由16個外顯子組成，其翻譯的蛋白由1042個氨基酸構(gòu)成，是一個Rap1GAP(Rap1GTPase activating protein)蛋白，它可以催化Rap1蛋白從活化的Rap1GTP形式轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ頡ap1GDP形式，實現(xiàn)對Rap1蛋白功能的調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的粘附、細(xì)胞內(nèi)激酶的活性、以及對細(xì)胞核內(nèi)基因的調(diào)控等。

此外，Sipa1蛋白除了與癌癥特征相關(guān)外，研究者們還發(fā)現(xiàn)Sipa1基因上存在兩個單核苷酸多態(tài)性SNP位點，即rs931127和rs3741378，它們與宮頸癌的轉(zhuǎn)移、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌的存活及發(fā)病密切相關(guān)。

關(guān)于Sipa1蛋白的檢測，一直限于傳統(tǒng)的免疫印跡(Western Blotting)，實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)等方法，這些方法的優(yōu)點是能夠準(zhǔn)確檢測到Sipa1蛋白的表達(dá)水平，但存在對儀器精密程度要求高、檢測所需時間長等問題，而本發(fā)明所提供的方法具有準(zhǔn)確度高、耗時短的優(yōu)點，將為Sipa1蛋白表達(dá)水平提供一種新的低成本檢測方法，為乳腺癌等癌癥的檢測與發(fā)現(xiàn)、新藥篩選與研制、治療與效果評價提供一種新的技術(shù)方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平的方法，以克服上述不足。

所述用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平的方法包含一對特異引物序列設(shè)計(圖5)。

所述引物序列具有三重結(jié)合特異性，它可以與沒有經(jīng)過任何處理的DNA序列相互結(jié)合延伸，也可以和經(jīng)過甲基化試劑處理的發(fā)生甲基化的DNA序列或是沒有發(fā)生甲基化的DNA序列相互結(jié)合延伸，從而可以識別位于CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生甲基化，進(jìn)一步判斷Sipa1基因的甲基化水平，然后推斷Sipa1蛋白的表達(dá)水平。

引物序列設(shè)計的原理是首先觀察目的產(chǎn)物所在的序列區(qū)域，然后根據(jù)理想的甲基化DNA序列設(shè)計引物序列，所設(shè)計的引物具有與正常DNA序列相互互補的堿基，也有與經(jīng)過甲基化試劑處理的發(fā)生甲基化的DNA序列或是沒有發(fā)生甲基化的DNA序列堿基相補，同時也有與上述三者不相互補的堿基結(jié)構(gòu)，但是相互互補的堿基占大多數(shù)，不相互補的堿基占少數(shù)，這樣可以確保所設(shè)計的引物與上述三類的模板都相互結(jié)合延伸。

所述引物能夠與Sipa1基因啟動子序列特征靶位結(jié)合，而對其它基因序列無特異性結(jié)合。

所述用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平的方法包含一套相適應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和步驟，它確保檢測的準(zhǔn)確性和檢測效率。

上述標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與步驟包含如下5步：

(1)提取人基因組DNA樣本，DNA濃度為500ng/μL，純度介于1.8<DNA260/280<2.0之間；

(2)設(shè)計合成一對特異性引物，它應(yīng)遵循上面所述的引物設(shè)計原則；

(3)將提取到的DNA樣本按照EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit的說明書進(jìn)行甲基化處理；

(4)以步驟(3)中處理后的DNA樣本為模板，采用步驟(2)合成的特異性引物，按圖6給定的體系和圖7給定的條件進(jìn)行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，識別擴增產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小一致；

所述用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平方法的PCR擴增體系為：

基因組DNA模板濃度為500ng/μL，體積為4μl，

特異性引物Sipa1-Meth-F濃度為10μM，體積為1μl，

特異性引物Sipa1-Meth-R濃度為10μM，體積為1μl，

MIX溶液體積為10μl，

ddH2O體積為4μl。

所述用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平方法的PCR反應(yīng)條件為：

i.預(yù)變性溫度為95℃，維持時間10min；

ii.變性溫度為95℃，維持時間20s；

iii.退火溫度為59℃，維持時間20s；

iv.延伸溫度為72℃，維持時間20s；

v.重復(fù)(ii)-(iv)操作不低于35個循環(huán)；

vi.維持溫度為72℃，維持時間10min；

vii.保持溫度為4℃，維持時間小于20h。

進(jìn)一步，只有采用步驟(i)-(vii)的流程方法才可擴增出特征明顯的高產(chǎn)量的PCR產(chǎn)物，用于序列確定及甲基化水平檢測。

(5)將擴增后的PCR產(chǎn)物回收、純化，進(jìn)行DNA測序，將所得序列與已公開數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對，確定此DNA片段為Sipa1基因啟動子區(qū)域，進(jìn)而獲取Sipa1基因甲基化信息。

本發(fā)明簡單快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可高通量檢測腫瘤病人樣本中Sipa1基因啟動子的甲基化水平，將為乳腺癌等惡性腫瘤的早期檢測與發(fā)現(xiàn)、新藥篩選與研制、治療與效果評價提供一種技術(shù)方法，適用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及腫瘤生物學(xué)等領(lǐng)域。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說明。

圖1是MDA-MB-231和MDA-MB-361細(xì)胞系PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。

圖2是MDA-MB-231細(xì)胞Sipa1基因啟動子甲基化序列測定結(jié)果。

圖3是MDA-MB-361細(xì)胞Sipa1基因啟動子甲基化序列測定結(jié)果。

圖4是MDA-MB-231和MDA-MB-361細(xì)胞的SIPA1蛋白表達(dá)結(jié)果。

圖5為特異性引物序列。

圖6為PCR擴增體系。

圖7為PCR反應(yīng)條件。

具體實施方式

下面借助實例和附圖更加詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明上述主題內(nèi)容僅局限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想和所公開精神的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識與慣用手段，做出各種等效、替換、修改或變更，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為說明本技術(shù)發(fā)明，以乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-361細(xì)胞系為例來具體闡述具體實施方式。

第一步：從MDA-MB-231和MDA-MB-361細(xì)胞系里提取它們的基因組，調(diào)整DNA濃度為500ng/μL，純度介于1.8<DNA260/280<2.0之間；

第二步：合成圖5中特定DNA序列的引物，通過PCR進(jìn)行引物特異性檢測，模板為MDA-MB-231和MDA-MB-361細(xì)胞系基因組DNA；

第三步：將提取到的DNA樣本按照EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit的說明書進(jìn)行甲基化處理；

第四步：以第三步中處理后的MDA-MB-231和MDA-MB-361DNA樣本為模板，采用第二步中合成的特異性引物，按照圖6和圖7給出的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，識別擴增產(chǎn)物，得到片段如附圖1所示。

所述用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平方法的PCR擴增體系為：

基因組DNA模板濃度為500ng/μL，體積為4μl，

特異性引物Sipa1-Meth-F濃度為10μM，體積為1μl，

特異性引物Sipa1-Meth-R濃度為10μM，體積為1μl，

MIX溶液體積為10μl，

ddH2O體積為4μl，

所述用于檢測Sipa1基因啟動子甲基化水平方法的PCR反應(yīng)條件為：

i.預(yù)變性溫度為95℃，維持時間10min；

ii.變性溫度為95℃，維持時間20s；

iii.退火溫度為59℃，維持時間20s；

iv.延伸溫度為72℃，維持時間20s；

v.重復(fù)(ii)-(iv)操作不低于35個循環(huán)；

vi.維持溫度為72℃，維持時間10min；

vii.保持溫度為4℃，維持時間小于20h。

采用步驟(i)-(vii)的流程方法才可擴增出特征明顯的高產(chǎn)量的PCR產(chǎn)物，用于序列確定及甲基化水平檢測。

第五步：將擴增后的PCR產(chǎn)物回收、純化，進(jìn)行DNA測序，將所得序列與已公開數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對，確定此DNA片段為Sipa1基因啟動子區(qū)域，進(jìn)而獲取Sipa1基因甲基化信息，其結(jié)果如附圖2、附圖3所示。

第六步：檢測MDA-MB-231和MDA-MB-361細(xì)胞對應(yīng)的SIPA1蛋白的表達(dá)水平，得到結(jié)果如附圖4所示。

圖2所示：

模板：經(jīng)過甲基化試劑盒處理的MDA-MB-231基因組(低甲基化)

Sequence 0：NCBI提供的Sipa1基因的序列；

Sequence 1：理想的甲基化狀態(tài)(如果CpG的C是被甲基化，那么經(jīng)甲基化試劑處理，則不改變，仍為C，反之如果沒有甲基化，則經(jīng)處理后變?yōu)門)；

Sequence 2:用所設(shè)計引物的測序結(jié)果。

黑色箭頭所指是非CpG島的胞嘧啶，灰色箭頭所指是沒有發(fā)生甲基化的CpG島的胞嘧啶。

圖3所示：

模板：經(jīng)過甲基化試劑盒處理的MDA-MB-361基因組(高甲基化)

Sequence 0：NCBI提供的Sipa1基因的序列；

Sequence 1：理想的甲基化狀態(tài)(如果CpG的C是被甲基化，那么經(jīng)甲基化試劑處理，則不改變，仍為C，反之如果沒有甲基化，則經(jīng)處理后變?yōu)門)；

Sequence 2:用所設(shè)計引物的測序結(jié)果。

黑色箭頭所指是非CpG島的胞嘧啶，淡灰色箭頭所指是沒有發(fā)生甲基化的CpG島的胞嘧啶，深灰色箭頭所指是發(fā)生甲基化的CpG島的胞嘧啶。

從附圖2和3中，識別出MDA-MB-231基因組是Sipa1基因啟動子低甲基化水平，MDA-MB-361基因組是Sipa1基因啟動子高甲基化水平。

附圖4免疫印跡結(jié)果表明，這兩種細(xì)胞系中SIPA1蛋白表達(dá)水平為：MDA-MB-231細(xì)胞系中SIPA1蛋白高水平表達(dá)，MDA-MB-361蛋白低水平表達(dá)。因此，可判斷在乳腺癌細(xì)胞中Sipa1基因的甲基化水平與SIPA1蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)特性，從而從病人組織樣本基因組甲基化水平推斷出SIPA1蛋白的表達(dá)水平。

最后所應(yīng)說明的是，以上具體實施方式僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。