1.一種用于檢測(cè)Sipa 1基因啟動(dòng)子甲基化水平的方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)提取人基因組DNA樣本,DNA濃度為500ng/μL,純度介于1.8<DNA260/280<2.0之間;
(2)設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物,該特異性引物既能夠與沒(méi)有經(jīng)過(guò)甲基化試劑處理的基因組DNA序列結(jié)合,也能夠與經(jīng)過(guò)甲基化試劑處理后發(fā)生甲基化的基因組DNA序列、或者經(jīng)過(guò)甲基化試劑處理而沒(méi)有發(fā)生甲基化的DNA序列結(jié)合,即具有與目的基因組DNA序列三重結(jié)合的特異性;
(3)將提取到的DNA樣本按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit的說(shuō)明書進(jìn)行甲基化處理;
(4)以步驟(3)中處理后的DNA樣本為模板,采用步驟(2)合成的特異性引物,按照特定的PCR擴(kuò)增體系與PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物,與預(yù)期片段大小一致;
(5)將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物回收、純化,進(jìn)行DNA測(cè)序,將所得序列與已公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì),確定此DNA片段為Sipa 1基因啟動(dòng)子區(qū)域,進(jìn)而獲取Sipa 1基因甲基化信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)Sipa 1基因啟動(dòng)子甲基化水平的方法,其特征在于,所述PCR擴(kuò)增體系為:
基因組DNA模板濃度為500ng/μL,體積為4μl,
特異性引物Sipa1-Meth-F濃度為10μM,體積為1μl,
特異性引物Sipa1-Meth-R濃度為10μM,體積為1μl,
MIX溶液體積為10μl,
ddH2O體積為4μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)Sipa1基因啟動(dòng)子甲基化水平的方法,其特征在于,所述PCR反應(yīng)條件為:
(1)預(yù)變性溫度為95℃,維持時(shí)間10min;
(2)變性溫度為95℃,維持時(shí)間20s;
(3)退火溫度為59℃,維持時(shí)間20s;
(4)延伸溫度為72℃,維持時(shí)間20s;
(5)重復(fù)(2)-(4)操作不低于35個(gè)循環(huán);
(6)維持溫度為72℃,維持時(shí)間10min;
(7)保持溫度為4℃,維持時(shí)間小于20h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)Sipa 1基因啟動(dòng)子甲基化水平的方法,其特征在于,所述特異性引物Sipa 1-Meth-F的DNA序列為:GAAATGGTTTTAGAATGAGTATTGT。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)Sipa 1基因啟動(dòng)子甲基化水平的方法,其特征在于,所述特異性引物Sipa 1-Meth-R的DNA序列為:CTAAACCACCTCTCCCCTAT。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的特異性引物,其特征在于,此對(duì)引物能夠與Sipa 1基因啟動(dòng)子序列特征靶位結(jié)合,而對(duì)其它基因序列無(wú)特異性結(jié)合。