一種敲除染色體的方法
【專(zhuān)利摘要】一種敲除染色體的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。染色體的主要功能是真核生物的遺傳載體。但不同染色體具有不同的核苷酸序列，它在細(xì)胞、組織、器官等發(fā)育、分化以及生物進(jìn)化中等也會(huì)存在顯著差異，利用染色體缺失的生物材料，可以更好地研究它們的各自作用。將胞嘧啶脫氨酶基因(CD)插入到細(xì)胞的特定染色體上，通過(guò)單倍體培養(yǎng)和正向選擇獲得轉(zhuǎn)CD的單倍體；振蕩培養(yǎng)含CD的單倍體制備細(xì)胞懸浮系；在添加5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)含CD的懸浮細(xì)胞；經(jīng)過(guò)0.1-100小時(shí)培養(yǎng)后，在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種稀釋的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行10-600小時(shí)的看護(hù)培養(yǎng)；挑選出單細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細(xì)胞。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種敲除染色體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種敲除染色體的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】?？梢詮V泛應(yīng)用于生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究；獲得的染色體缺失材料可在農(nóng)林、食品和環(huán)境等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
【背景技術(shù)】
[0002]染色體的主要功能是真核生物的遺傳載體。但不同染色體具有不同的核苷酸序列，它在細(xì)胞、組織、器官等發(fā)育、分化以及生物進(jìn)化中等也會(huì)存在顯著差異，利用染色體缺失的生物材料，可以更好地研究它們的各自作用；獲得的染色體缺失材料也具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]將胞嘧啶脫氨酶基因(⑶)插入到細(xì)胞的特定染色體上，通過(guò)單倍體培養(yǎng)和抗生素等試劑的正向選擇獲得轉(zhuǎn)CD的單倍體。
[0004]振蕩培養(yǎng)含⑶的單倍體制備細(xì)胞懸浮系，接著在含0.0001-10%的5-氟胞嘧啶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)含CD的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行負(fù)向選擇，培養(yǎng)時(shí)間為0.1-100小時(shí)。
[0005]在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種經(jīng)過(guò)負(fù)向選擇且已稀釋的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行10-600小時(shí)的看護(hù)培養(yǎng)，然后挑選出單細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0006]1.獲得轉(zhuǎn)胞嘧啶脫氨酶基因(⑶)甘草基因
[0007]I)⑶基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0008]將來(lái)自大腸桿菌的⑶基因插入到PC0MB1A1304的GFP基因的上游；電導(dǎo)入農(nóng)桿菌LB4404 ;挑單菌斑培養(yǎng)、鑒定。
[0009]2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)⑶基因
[0010]挑經(jīng)過(guò)鑒定的單菌斑，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；然后，用新鮮培養(yǎng)基將其稀釋到OD62tl為
0.6-0.9的懸浮液；挑選飽滿甘草種子依次經(jīng)過(guò)70%酒精、無(wú)菌水、10%次氯酸鈉和無(wú)菌水消毒清洗后接種在MS固體培養(yǎng)基上；12 / 12小時(shí)光照培養(yǎng)一周，獲得無(wú)菌苗；剪取幼葉、莖尖等外植體接種在含lmg/L2，4-D的固體MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，2-4天后與培養(yǎng)稀釋后的農(nóng)桿菌溫育1-50分鐘；取出外植體用無(wú)菌水反復(fù)清洗后再接種到含50mg / L潮霉素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)7-20天。獲得的愈傷組織一部分用于再生芽分化、根誘導(dǎo)形成再生植株；一部分進(jìn)行繼代培養(yǎng)獲得松散型愈傷組織，以制備懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系。
[0011]3)轉(zhuǎn)⑶基因的植株鑒定
[0012]A.⑶S瞬間表達(dá)鑒定
[0013]取出部分愈傷組織、幼芽和根尖進(jìn)行6US化學(xué)染色鑒定；出現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性材料進(jìn)行記錄，其對(duì)應(yīng)的剩余材料進(jìn)入下面的實(shí)驗(yàn)。
[0014]B.CD基因的PCR鑒定[0015]取部分⑶S鑒定陽(yáng)性的材料，按CTAB法提取基因組DNA ;利用⑶特異性引物進(jìn)行PCR ；PCR陽(yáng)性的剩余材料進(jìn)入下一輪試驗(yàn)。
[0016]C.⑶基因插入I號(hào)染色體的植株選擇 [0017]取PCR陽(yáng)性植株的根尖制作有絲分裂的細(xì)胞裝片；在顯微鏡下尋找含分裂中期細(xì)胞的裝片；在熒光顯微鏡下，尋找I號(hào)染色體含綠色熒光的裝片；驗(yàn)證并確定I號(hào)染色體插入GFP和⑶的生物材料。
[0018]2.通過(guò)單倍體培養(yǎng)和抗生素等試劑的正向選擇獲得轉(zhuǎn)⑶的單倍體。
[0019]I)花藥培養(yǎng)單倍體細(xì)胞團(tuán)及其鑒定
[0020]取I號(hào)染色體插入CD基因的生物材料栽培；開(kāi)花后取花粉培養(yǎng)分別在含5-氟胞嘧啶和不含5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；獲得的愈傷組織分別用于下面兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。
[0021]2)花藥培養(yǎng)單倍體植株及其鑒定
[0022]愈傷組織加入含激素的誘導(dǎo)幼芽的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)再生植株及鑒定。
[0023]3.振蕩培養(yǎng)含⑶的單倍體制備細(xì)胞懸浮系
[0024]I)制備愈傷組織。
[0025]2)制備懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系。
[0026]4.負(fù)向選擇培養(yǎng)，獲得缺失含CD基因染色體的懸浮細(xì)胞
[0027]在含0.0001-10%的5-氟胞嘧啶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)含⑶的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行負(fù)向選擇，培養(yǎng)時(shí)間為0.1-100小時(shí)。
[0028]5.看護(hù)培養(yǎng)選擇單細(xì)胞團(tuán)
[0029]I)稀釋?xiě)腋〖?xì)胞系。
[0030]2)制備生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織。
[0031]3)看護(hù)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。
[0032]在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種經(jīng)過(guò)負(fù)向選擇且已稀釋的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行10-600小時(shí)的看護(hù)培養(yǎng)。
[0033]6.⑶插入染色體的缺失細(xì)胞鑒定與獲得
[0034]I)⑶S化學(xué)鑒定
[0035]2) PCR 鑒定
[0036]3)細(xì)胞學(xué)鑒定
[0037]然后挑選出單細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.將胞嘧啶脫氨酶基因(CD)插入到細(xì)胞的特定染色體上，通過(guò)單倍體培養(yǎng)和抗生素等試劑的正向選擇獲得轉(zhuǎn)CD的單倍體。
2.振蕩培養(yǎng)含CD的單倍體制備細(xì)胞懸浮系，接著在含0.0001-10%的5-氟胞嘧啶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)含CD的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行負(fù)向選擇，培養(yǎng)時(shí)間為0.1-100小時(shí)。
3.在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種經(jīng)過(guò)負(fù)向選擇且已稀釋的懸浮細(xì)胞，進(jìn)行10-600小時(shí)的看 護(hù)培養(yǎng)， 然后挑選出單細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103540609SQ201310476293
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】李興林, 李夢(mèng)麗, 別振宇 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)