專利名稱：一種萊茵衣藻目標(biāo)基因敲除方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用中間載體可以快速、準(zhǔn)確高效針對(duì)萊茵衣藻目標(biāo)基因進(jìn)行沉默的敲除方法。
背景技術(shù)：
萊茵衣藻屬于綠藻門、團(tuán)藻目、衣藻科，是一種單細(xì)胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(dòng)(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性、細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞識(shí)別等)的模式生物，與酵母細(xì)胞有許多共同的特征，如生長周期簡單，生長快，世代時(shí)間短，可以在平板上形成單克隆，也能進(jìn)行液體培養(yǎng)，以單倍體與二倍體兩種形式生長，能對(duì)其配子的發(fā)育過程進(jìn)行四分子分析等。因此有“光合酵母”之稱。它遺傳背景清楚，是目前唯一建立細(xì)胞核、葉綠體和線粒體三套遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的生物材料。萊茵衣藻作為植物和動(dòng)物的共同祖先，其基因組可以為多細(xì)胞生物的進(jìn)化提供重要的信息。萊茵衣藻大約有15000個(gè)基因，通過萊茵衣藻基因組計(jì)劃，科學(xué)家們得到了萊茵衣藻基因組的95%的序列。將萊茵衣藻基因組與其它已知的基因組比較發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻和人類共有45%的基因，和開花植物共有62%的基因。這說明對(duì)萊茵衣藻的研究具有普遍的
眉、ο萊茵衣藻結(jié)構(gòu)基因組學(xué)以及表達(dá)序列標(biāo)簽計(jì)劃的完成為萊茵衣藻的反向遺傳學(xué)的研究提供了可能。RNA干擾作為功能基因組學(xué)研究的有力工具，已經(jīng)在真菌、植物、 果蠅、低等脊椎動(dòng)物及哺乳動(dòng)物的研究中大量應(yīng)用并取得了顯著成效。RNA干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性雙鏈 RNA(double strand RNA, dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，最終導(dǎo)致相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。其快速簡便、通用性強(qiáng)、靶向性高等特點(diǎn)在基因功能鑒定的研究中顯示出了很強(qiáng)的優(yōu)越性。RNA干擾最早是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，后來的研究證實(shí)不論是長的雙鏈 RNA(dsRNA)或小發(fā)夾 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，最后都要被 Dicer 加工成 21 個(gè)堿基長度的功能性雙鏈小RNA——siRNA(small interfering RNA)。siRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與包括Argonaute在內(nèi)的相關(guān)蛋白質(zhì)因子結(jié)合形成RISC復(fù)合體，通過堿基配對(duì)識(shí)別靶標(biāo)RNA， 在鎂離子和ATP的參與下，Argonaute蛋白利用其核酸內(nèi)切酶活性切割與之完全互補(bǔ)配對(duì)的靶標(biāo)RNA，產(chǎn)生具有5’磷酸基和3’羥基末端的mRNA片段，使之更易受到5’或3’核酸外切酶的攻擊而快速降解。這種機(jī)制即是通常所說的RNA干擾。然而就萊茵衣藻來講，通過RNAi技術(shù)對(duì)候選基因的敲除還只是處于起步階段。存在著基因敲出的不穩(wěn)定性。即在轉(zhuǎn)RNAi載體的轉(zhuǎn)基因群體中，一部分通過RNAi效應(yīng)將目標(biāo)基因敲出，而另一部分則由于種種原因沒有將目標(biāo)基因敲出。這對(duì)于研究工作十分不利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種萊茵衣藻目標(biāo)基因敲除方法，通過篩選對(duì)候選基因有沉默效果的轉(zhuǎn)化子，利用中間載體pMD^5自身的酶切位點(diǎn)，通過構(gòu)建目標(biāo)基因的反向重復(fù)序
3列來構(gòu)建目標(biāo)基因RNAi載體pTSBIR-XIR，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)萊茵衣藻目標(biāo)基因進(jìn)行沉默，具有對(duì)目標(biāo)基因敲除效率高、操作簡便、快捷等特點(diǎn)。本發(fā)明所采用的技術(shù)原理選擇具有致死效應(yīng)的報(bào)告基因色氨基酸合成酶β亞基(Tryptophan synthase i3-subunit，TSB)基因。其體內(nèi)活性和工作原理如下色氨基酸合成酶a亞基(TSA)活性
權(quán)利要求
1. 一種萊茵衣藻目標(biāo)基因敲除方法方法，其特征在于包括PMCS-SPA-MCS載體和 pTSBIR-Xm載體的構(gòu)建；1)、中間載體PM擬85的構(gòu)建以TAKARA公司pMD-18T Simple載體為基礎(chǔ)，通過設(shè)計(jì)合成多克隆位點(diǎn)和間隔區(qū)序列， 最后插入pMD-18T Simple載體，得到中間載體pM擬85 ；A、多克隆位點(diǎn)的設(shè)計(jì)選擇實(shí)驗(yàn)室常用的TAKARA公司生產(chǎn)的pMD系列載體T克隆位點(diǎn)兩端的常用內(nèi)切酶位點(diǎn)作為間隔序列兩端的酶切位點(diǎn)；B、間隔序列的選取以在轉(zhuǎn)基因受體藻株中惰性為原則，選取PCAMBIA1302上的一段ISObp在萊茵衣藻基因組中無同源性的一個(gè)片段作為間隔序列；C、兩端帶有多克隆位點(diǎn)間隔序列的合成將設(shè)計(jì)好的兩端帶有多克隆位點(diǎn)的間隔序列委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成，所得序列如序列表<400>1 ；同時(shí)，為兩端帶有多克隆位點(diǎn)的間隔序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物MCSF :5’ -CGCAGAATTCTGCAGATATC-3’ MCSR :5’ -GGTCGAATTCCAGCACACTG-3， 通過PCR的方法將該序列克隆到pMD-18T Simple載體上；D、克隆載體的選取選取pMD-18T Simple作為克隆載體；E、兩端帶有多克隆位點(diǎn)的間隔序列插入pMD-18TSimple 利用引物MCSF :5’ -CGCAGAATTCTGCAGATATC-3’ MCSR :5’ -GGTCGAATTCCAGCACACTG-3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物并連接pMD-18T Simple載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞， 提取質(zhì)粒則得到PM擬85中間載體；2)、RNAi載體 pTSBIR-XIR 的構(gòu)建A、克隆色萊茵衣藻色氨基酸合成酶β亞基基因3’端非編碼區(qū)450bp的片段；通過引物TBSF GCACTGTGCTTTGACAGACAAG ；TBSR CGATTGGTAGCAACAAAGTGAGT PCR擴(kuò)增得到TBS基因反向重復(fù)序列，分別插入載體SP124S Ble基因3’端非編碼區(qū)區(qū)域，得到含TBS反向重復(fù)序列的中間載體；B、以Sacl/Kpnl從pSI103載體上將aphVIIIgene表達(dá)框切下，補(bǔ)平，連入步驟1得到的中間載體，得到RNAi載體pTSBII^QR。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種萊茵衣藻目標(biāo)基因敲除方法方法，包括pMCS-SPA-MCS載體和pTSBIR-XIR載體的構(gòu)建。本發(fā)明通過篩選對(duì)候選基因有沉默效果的轉(zhuǎn)化子，利用pMCS-SPA-MCS載體自身的酶切位點(diǎn)，通過構(gòu)建pXF-SPA-XR載體來構(gòu)建目標(biāo)基因RNAi載體pTSBIR-XIR，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)萊茵衣藻目標(biāo)基因進(jìn)行沉默，具有對(duì)目標(biāo)基因敲除效率高、操作簡便、快捷等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102229940SQ20101062052
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者費(fèi)小雯, 鄧曉東 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所