一種用于萊茵衣藻多基因共表達(dá)的載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種能在萊茵衣藻中同時表達(dá)多個基因的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]萊茵衣藻{Chlamydomonas reinhardii )是一種單細(xì)胞真核藻，個體直徑為5_17微米，有兩根鞭毛，一個占細(xì)胞總體積近40%的大型杯狀葉綠體。萊茵衣藻培養(yǎng)條件簡單，能進(jìn)行光合作用而自養(yǎng)生長，也能同化外來碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長，還可以自養(yǎng)、異養(yǎng)同時進(jìn)行；其生長速度快，細(xì)胞倍增周期為5-6小時，可以在短時間內(nèi)大量繁殖，因上述特性，使得萊茵衣藻作為藻類研究的模式生物，被廣泛地應(yīng)用于各種研究中。
[0003]目前，萊茵衣藻的全基因組序列測序已經(jīng)完成，其核基因組大小約為100Mb，線狀的線粒體基因組大小為15.7kb，環(huán)狀的葉綠體基因組大小為203.8kb，更重要的是，針對核基因、葉綠體基因和線粒體基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)比較成熟，使萊茵衣藻成為理想的轉(zhuǎn)基因植物受體和生物反應(yīng)器。已有數(shù)種蛋白在萊茵衣藻中成功表達(dá)，例如:張中林等將丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3-C后在萊茵衣藻葉綠體中成功表達(dá)(張中林，山松，陳曦等.丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定點(diǎn)整合入衣藻葉綠體基因組的研究，遺傳HEREDITAS(Beijing).1999; 21: 1_6);胡章立等將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻核基因中，成功實(shí)現(xiàn)了該蛋白的穩(wěn)定表達(dá)(胡章立，王潮崗，吳錦霞.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在萊茵衣藻中的高效表達(dá).深圳特區(qū)科技.2005，O: 217-222);李明澤等實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞色素cytb5基因在萊茵衣藻中的活性表達(dá)(李明澤，程奇.含鐵蛋白cyb5融合基因萊茵衣藻核轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化.中國農(nóng)學(xué)通報，2013，30: 4515-4522)，因此，開展萊茵衣藻外源基因表達(dá)的研究具有重要的應(yīng)用價值。
[0004]但是，萊茵衣藻外源基因表達(dá)仍存在問題:一方面外源基因的表達(dá)效率不夠高，與其它成熟表達(dá)宿主(如大腸桿菌、畢赤酵母)相比，其外源基因表達(dá)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后；另一方面，現(xiàn)階段的表達(dá)載體只能完成單個外源基因的表達(dá)，對多個基因同時表達(dá)的情況無法應(yīng)對，并且國內(nèi)外市場上也沒有成熟的載體和表達(dá)系統(tǒng)能完成上述工作，由此可見，開發(fā)新的表達(dá)載體和體系十分必要。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服上述提到的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種能同時表達(dá)多個外源基因的萊茵衣藻表達(dá)載體，本發(fā)明提供可同時表達(dá)多基因的萊茵衣藻表達(dá)載體是Dh5 a/PJD124，保藏號CCTCC NO: M 2014394，保藏日期為2014.8.30，分類命名和拉丁文學(xué)名為大腸桿菌DH5a/pJD124 (Escherichia coll DH5 a/pJD124)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址是中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編是430072，傳真(027)68754833，email是cctcciwhu.edu.cn,該培養(yǎng)的存活性于2014.9.5檢測完畢，結(jié)果為存活。
[0007]本發(fā)明的另外一個任務(wù)是提供這種能同時表達(dá)多個外源基因的萊茵衣藻表達(dá)載體的構(gòu)建方法，為實(shí)現(xiàn)這個目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是:
1.以初始載體質(zhì)粒pH124為模板，DNA序列表中BleF(SEQ ID NO:1)和BleR (SEQID NO: 2)所示DNA為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有博萊霉素抗性基因的DNA片段的博萊霉素抗性基因Ble resistant，博萊霉素抗性基因Ble resistant的序列表SEQ ID NO:7所示；所述的質(zhì)粒PH124在申請?zhí)枮?01310234919.2，申請人為深圳大學(xué)，發(fā)明名稱為“一種表達(dá)石斑魚抗菌肽Piscidin的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的構(gòu)建和應(yīng)用”的說明書中有公布；
2.以初始載體質(zhì)粒pH124為模板，RBCSTF(SEQ ID NO:3所示)和RBCSTR (SEQ IDNO:4所示)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得終止子Ter，終止子Ter序列如序列表SEQ ID NO:8所示；
3.以人工合成的啟動子Ph5_,b(DNA序列如SEQ ID NO:9所示)為模板，ProF (SEQ IDNO:5所示)和ProR (SEQ ID NO:6所示)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連入Takara公司的pMD18_T simple載體中，得到中間重組載體,記作pJDl。
[0008]4.用EcoRI和BamHI酶切載體pJDl，回收載體大片段A ;用EcoRI和BamHI酶切終止子Ter，回收302bp片段；將所述載體大片段A與所述302bp片段連接，得到重組載體，記作PJD12 ；
5.用BamHI和NotI酶切載體pJD12，回收載體大片段B ;同樣用BamHI和NotI酶切博萊霉素抗性基因Ble resistant,回收1170bp片段；將該片段與所述的載體大片段B連接、轉(zhuǎn)化，得到重組載體，記作PJD124，即為目的表達(dá)載體Dh5 a /pJD124 ；
通過本發(fā)明構(gòu)建的載體進(jìn)行多個外源基因的共表達(dá)具有以下幾個方面的優(yōu)勢:
1.基因表達(dá)效率高，與普通表達(dá)載體不同，PJD124能夠保證每個外源基因都有獨(dú)立的啟動子和終止子，避免了多個基因在同時轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中的相互干擾，有效提高每個基因的表達(dá)效果。
[0009]2.簡便、快捷，僅通過兩次酶切反應(yīng)和一次酶連反應(yīng)便可構(gòu)建出外源基因的共表達(dá)質(zhì)粒。
[0010]3.經(jīng)濟(jì)，僅需要一對同尾酶(BamHI/Bglll或者StuI/SacI)和T4 DNA連接酶就能完成多基因表達(dá)載體的構(gòu)建，簡單經(jīng)濟(jì)。
[0011]
【附圖說明】
[0012]圖1為載體PJD124的構(gòu)建流程圖；
圖2為載體pJD124的示意圖,示載體多克隆位點(diǎn)及關(guān)鍵信息；其中啟動子Ph5-rt，Ter代表終止子，Ble resistant代表博萊霉素抗性基因，pMD backbone代表pMD18_T simple載體骨架，Tin554F和Tin554R代表載體測序引物區(qū)域，圖中標(biāo)注的酶切位點(diǎn)在pJD124中均為唯一。
[0013]圖3為載體pJD124單獨(dú)表達(dá)GFP基因的構(gòu)建流程圖；
圖4為載體pJD124單獨(dú)表達(dá)RED基因的構(gòu)建流程圖；
圖5為載體pJD124同時表達(dá)RED基因和GFP基因的構(gòu)建流程圖；
圖6為載體pJD124-GFP、pJD124_RED的酶切鑒定；其中M為DNA marker, I為pJD 124-RED酶切后圖譜，2為pJD124_RED酶切前圖譜，8為pJD124_GFP酶切前圖譜，9為PJD124-GFP酶切后圖譜。
[0014]圖7為載體pJD124-GFP-RED的酶切鑒定；其中M為DNA marker，l和2均為為PJD124-GFP-RED酶切前圖譜。
[0015]圖8為轉(zhuǎn)基因工程藻基因組PCR驗(yàn)證結(jié)果.
【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)施實(shí)例中所采用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實(shí)施實(shí)例中所采用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0018]實(shí)例一本發(fā)明載體PJD124的構(gòu)建
載體pMD18_T simple購自Takara公司，內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Science公司，引物、人工基因均合成于上海生工生物工程公司。
[0019]BleF (SEQ ID NO:1)和 BleR (SEQ ID NO:2)為 PCR 擴(kuò)增引物序列，用于擴(kuò)增博萊霉素抗性基因。
[0020]RBCSTF (SEQ ID NO:3)和 RBCSTR (SEQ ID NO:4 )為 PCR 擴(kuò)增引物序列，用于擴(kuò)增終止子。
[0021]ProF (SEQ ID NO:5)和 ProR (SEQ ID NO:6)為 PCR 擴(kuò)增引物序列，用于擴(kuò)增啟動子fWrb。
[0022]SEQ ID NO:7為人工合成的博萊霉素抗性基因DNA序列。
[0023]SEQ ID NO:8為人工合成的終止子Ter的DNA序列。
[0024]SEQ ID NO:9為人工合成的啟動子Ph5_rt的D NA序列。
[0025]1.載體PJD124關(guān)鍵元件的克隆
載體pJD124關(guān)鍵元件為抗性基因Ble、終止子Ter、啟動子Ph5_,b。其中抗性基因Ble是以BleF/BleR (SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2)為引物，質(zhì)粒pH124為模板擴(kuò)增而獲得；終止子 Ter 以 RBCSTF/RBCSTR (SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)為引物，質(zhì)粒 pH124 為模板擴(kuò)增而獲得；以ProF/ProR (SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)為引物，人工合成基因啟動子Ph5_rt (DNA序列如SEQ ID NO:9所示)為模板擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物(上述引物中已經(jīng)加入了相應(yīng)的內(nèi)切酶識別位點(diǎn))。
[0026]2.將啟動子Ph5_A的擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，再克隆入PMD18-Tsimple載體中，獲得中間載體pJDl.3.用EcoRI和BamHI酶切載體pJDl，回收載體大片段A ;用EcoRI和BamHI酶切DNA片段Ter，回收302bp ;將所述載體pJDl的回收載體大片段A與所述302bp片段連接，得到中間載體，記作PJD12。
[0027]4.用BamHI和NotI酶切載體pJD12，回收載體大片段B ;同樣用BamHI和NotI酶切DNA片段Ble，回收1170bp片段；將該片段與pJD12載體大片段連接、轉(zhuǎn)化