芳香基硫酸酯酶基因、編碼蛋白及其固定化的方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，尤其涉及利用駿基功能化磁性納米顆粒固定化酶法輔助 提取瓊脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓊脂是一種來源于紅藻類植物細(xì)胞壁的天然有機(jī)多糖膠體，在食品、醫(yī)藥、化工等 領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。瓊脂是由瓊脂糖（agarose )和瓊脂膠（agaropectin)構(gòu)成的混合物，并且W 瓊脂糖為主。瓊脂糖是由（1-3)-目-D-半乳糖和（1-4)-3, 6-內(nèi)離-a 半乳糖等組成 的鏈狀聚合物，而瓊脂膠的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)與瓊脂糖相同，只是（1-4)-3，6-內(nèi) 離-a 半乳糖上的羥基易被硫酸基、甲氧基、丙麗基等基團(tuán)替代。相關(guān)研究表明，對(duì)瓊脂 進(jìn)行脫硫酸基團(tuán)處理可W有效提高瓊脂的凝膠強(qiáng)度或生產(chǎn)高凝膠強(qiáng)度的瓊脂糖，從而大幅 度提高產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 目前，脫除瓊脂硫酸基團(tuán)的主要方法為化學(xué)法，由于大量使用強(qiáng)堿進(jìn)行處理脫除 瓊脂中的硫酸基團(tuán)，需要加入大量的酸中和過量的堿，還要用大量的水漂洗去除鹽，存在生 產(chǎn)過程不容易控制、產(chǎn)品得率低、對(duì)環(huán)境污染大、工藝復(fù)雜等不足。相對(duì)于化學(xué)法，用酶法對(duì) 瓊脂進(jìn)行改性具有反應(yīng)條件溫和、底物轉(zhuǎn)化率高、無污染、工藝簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此，芳香基硫 酸醋酶輔助提取瓊膠將逐漸取代傳統(tǒng)的化學(xué)等降解方法成為制備瓊脂的最佳方法。然而， 目前對(duì)芳香基硫酸醋酶作用于瓊脂的研究工作還很不充分且存在酶活不高、純化步驟繁瑣 等問題，該制約著利用芳香基硫酸醋酶改性瓊脂生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的應(yīng)用與開發(fā)。有鑒于 此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種固定化重組芳香基硫酸醋酶的方法及其應(yīng)用辦法，本案由 此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種芳香基硫酸醋酶基因atsA。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種由所述芳香基硫酸醋酶基因atsA編碼的重組芳 香基硫酸醋酶。
[0006] 本發(fā)明的第H個(gè)目的是提供一種所述重組芳香基硫酸醋酶的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種駿基功能化磁性納米顆粒固定化所述游離重組 芳香基硫酸醋酶的方法。
[0008] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種所述游離重組芳香基硫酸醋酶和固定化重組芳 香基硫酸醋酶在降解瓊脂中的硫酸基團(tuán)的應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是： 食鹿角菜假交替單胞菌（Ae化carra滬?enorara sp. ASY5),該菌株來 源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中也（CICC)，保藏編號(hào)；CICC 23819。
[0010] 一種從食鹿角菜假交替單胞菌CICC 23819中分離得到的芳香基硫酸醋酶基因 atsA，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 一種芳香基硫酸醋酶基因atsA編碼的芳香基硫酸醋酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 一種重組芳香基硫酸醋酶的制備方法，包括W下步驟： 步驟一：從食鹿角菜假交替單胞菌（Aew/oay妃rofflmas carra滬?6/7(9rara sp. )ASY5中 克隆芳香基硫酸醋酶基因a tsA ; 步驟二；將所述芳香基硫酸醋酶基因atsA插入祀T-28a(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒； 步驟H ;將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（公.co7i) BL21值E3)中；挑選陽(yáng)性克隆在 Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述Luria-Bertani培養(yǎng)基含50 y g/mL的卡那霉素，培養(yǎng) 條件為溫度37° C，搖床培養(yǎng)至化U=〇. 8時(shí)，再加入異丙基硫代-目-D-半乳糖巧（IPTG)至 終濃度為50 mmol/l，在15° C條件下誘導(dǎo)26 h ; 步驟四；離也收集發(fā)酵后的公.co7iBL 21值E3)菌體，重息沉淀于溶解緩沖液中利 用超聲波破壁裂解；所述溶解緩沖液的配方可為；50mmol/L NaH2P〇4,300mmol/L化Cl，15 mmol/L 咪哇，pH 8. 0 ; 步驟五：將步驟四中裂解后的息濁液于4° C，15000Xg條件下，冷凍離也20 min后， 收集上清液，與Ni-NTA Agarose混勻，進(jìn)行純化，即得所述重組芳香基硫酸醋酶。
[0013] 一種重組芳香基硫酸醋酶的固定化方法，包括W下步驟： 步驟一：利用化學(xué)共沉淀法制備駿基功能化的磁性納米粒子；Fe3+和Fe"溶液混合，在 劇烈攬拌條件下快速加入氨水，1分鐘后，逐滴加入油酸，70° C下繼續(xù)快速攬拌，反應(yīng)結(jié)束 后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，用外加磁場(chǎng)將所得的沉淀從反應(yīng)體系中分離出來，用己醇、離子 水洗涂，然后加入KMn〇4溶液，超聲波清洗儀超聲振蕩，磁分離后用去離子水洗涂得磁流體， 真空冷凍干燥所述磁流體，制得表面修飾有駿基的磁性納米粒子； 步驟二：固定化重組芳香基硫酸醋酶：取10 mg磁性納米載體，經(jīng)超聲分散后加入5ml 體積百分比為1. 0%的戊二酵溶液，4。C振蕩化后，用50 ml pH 7. 0 Tris-肥1緩沖液沖 洗交聯(lián)載體；加入30 UL重組芳香基硫酸醋酶液，磁性納米載體與游離芳香基硫酸醋酶的 比為Img ;0. 7U ;低溫固定化，固定化時(shí)間化，溫度為4°C ;之后用Tris-HCl緩沖液沖洗，真 空冷凍干燥得固定化酶。
[0014] 作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，在所述步驟二中，所述游離重組芳香基硫酸醋酶液為大 腸桿菌細(xì)胞經(jīng)過超聲波破壁后低溫高速離也所得上清液。
[0015] 一種游離重組芳香基硫酸醋酶和固定化重組芳香基硫酸醋酶分別在降解瓊脂中 的硫酸基團(tuán)的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，芳香基硫酸醋酶能夠在公.CO"中穩(wěn)定表達(dá)，并且純 化后的酶活力高，克服了現(xiàn)有芳香基硫酸醋酶活力低，酶分離純化過程繁瑣等問題，而重組 表達(dá)的芳香基硫酸醋酶對(duì)瓊膠中的S042-具有很好的降解作用，在瓊膠提取生產(chǎn)過程中可 替代或部分替代堿處理，從而減少污染，節(jié)約水資源。
【附圖說明】
[0017] 圖1 ; carrageenorara芳香基硫酸醋酶基因在大腸桿菌中 的表達(dá)純化的SDS-PAGE圖；其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker, 1泳道為質(zhì)粒祀T-28a(+)在公. co7i BL21值E3)中的表達(dá)(誘導(dǎo)）；2泳道為重組質(zhì)粒在公.co7iBL21值E3)中的誘導(dǎo)表 達(dá)；3泳道為重組質(zhì)粒在公.CO" BL21值E3)中的表達(dá)(未誘導(dǎo)）；4泳道為經(jīng)Ni-NTA純化 所得的目的蛋白，分子量為35. 1 kDa; 圖2 ;固定化重組芳香基硫酸醋酶操作重復(fù)性的考察。
【具體實(shí)施方式】
[001引下列實(shí)施例中采用的檢測(cè)方法： 重組芳香基硫酸醋酶活性的測(cè)定；反應(yīng)體系包括80 uL 20 mmol/L對(duì)硝基苯硫酸鐘 (P-NPS，W 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7. 0)緩沖液配制），20 y L 酶液（濃度為 6 y g/mL)， 在50。C溫育10 min后，加入25 uL 1 mol/L化OH終止反應(yīng)，W預(yù)冷蒸觸水補(bǔ)足體積至 1 111以在410 nm下測(cè)定吸收值。芳香基硫酸醋酶的活力扣）定義為：在上述條件下，每分 鐘催化生成1 ymoL對(duì)硝基苯酷（P-N巧所需的酶量。
[0019] 硫酸基含量的測(cè)定；〇. 5血酶液與1血0. 2%瓊脂溶液在50。C振搖反應(yīng)1 h， 后離也取0. 9血上清液，再加入0. 2血濃肥1和0. 6血13. 3%氯化頓-2. 67%Tween-80 溶液，混勻，室溫靜置30 min,在420皿波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。
[0020] 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定；配制1. 5%的瓊脂溶液，完全溶解后在室溫下放置15 h，制備好 的樣品放在凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀的試樣座中也位置上，按凝膠強(qiáng)度測(cè)定儀說明書進(jìn)行操作，移 動(dòng)手柄使攝碼添加裝置桿下端與凝膠表面接觸，加大力度使凝膠的表面發(fā)生破裂(端點(diǎn)進(jìn) 入凝膠約4mm W上)，記錄此時(shí)凝膠強(qiáng)度值。
[0021] 實(shí)施例1;芳香基硫酸醋酶基因的擴(kuò)增與克隆 芳香基硫酸醋酶基因的正向引物序列為：5' -CGCGGATCCCAAAAAATTAGTATTAT-3 '（下劃 線為公a紐I識(shí)別序列），反向引物序列為：5' -CCCAAGCTTGCGTTTTAGTTCGTAAC-3' (下劃 線為