一種利用硫酯酶合成Cilengitide的方法
【專利摘要】發(fā)明的目的是提供一種Cilengitide的新型的合成方法，即利用硫酯酶（TE）介導(dǎo)的化學(xué)酶法催化合成抗腫瘤化合物Cilengitide，在提高了合成效率的同時(shí)又降低合成成本。本發(fā)明的合成方法與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，在催化時(shí)間上縮短了48倍，由原先的32h（化學(xué)法）縮短為40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了79.3%。因此，該方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。
【專利說(shuō)明】—種利用硫酯酶合成Ci Iengitide的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于綠色化工和酶催化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用硫酯酶(TE)介導(dǎo)的化學(xué)酶法催化合成抗腫瘤化合物Cilengitide的方法。
【背景技術(shù)】[0002]Cilengitide 是含有 RGD (arginine - glycine - aspartate)的五環(huán)妝。作為整合素抑制因子，也是癌癥個(gè)體化治療研究的一個(gè)新類別抗新血管生成的孤兒藥物，這類藥物可以競(jìng)爭(zhēng)、干擾腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix protein,ECM)的相互作用，阻止內(nèi)源性配體與之結(jié)合，從而抑制腫瘤血管的生成和細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用。目前抗腫瘤化合物Cilengitide已經(jīng)完成了包括膠質(zhì)瘤(glioblastoma, GBM)在內(nèi)的多種腫瘤的I1-1II期臨床試驗(yàn)。GBM是最具侵略性的惡性腫瘤，而“Cilengitide”是目前唯一處于III期臨床并用于治療該癌癥的整合素拮抗劑。近期結(jié)合III期臨床的數(shù)據(jù)，EMA(European Medicines Agency)對(duì) Cilengitide 做出很高評(píng)價(jià)，預(yù)期不久 Cilengitide 將通過(guò)III期臨床評(píng)估，作為治療GBM的特效藥走向市場(chǎng)。但與樂(lè)觀的前期臨床研究不同，目前以傳統(tǒng)的環(huán)肽化學(xué)全合成獲得的Cilengitide價(jià)格十分昂貴(約為35000元/g)，這將使得其在未來(lái)市場(chǎng)化的推廣中障礙重重，進(jìn)而難以惠及普通大眾。同時(shí)化學(xué)全合成法也存在高污染、高消耗、多副反應(yīng)和產(chǎn)率低等不足。因此，如何改變Cilengitide現(xiàn)有環(huán)肽合成方式，尋找新的合成途徑，在提高合成效率的同時(shí)又降低合成成本是值得深入研究的一個(gè)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種Cilengitide的新型的合成方法，即利用利用硫酯酶(TE)介導(dǎo)的化學(xué)酶法催化合成抗腫瘤化合物Cilengitide,在提高了合成效率的同時(shí)又降低合成成本。
[0004]本發(fā)明首先提供硫酯酶的一種新用途,是在合成Cilengitide中的應(yīng)用；
[0005]本發(fā)明還提供一種合成CiIengitide的方法，是用硫酯酶來(lái)催化底物合成Cilengitide。
[0006]上述的底物多肽的序列為:asp-phe-met-val-L_arg-gly ；
[0007]更具體的，底物為 L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly ；
[0008]為了使底物能更好的和TE酶結(jié)合，在C端加上了一個(gè)BMT (芐硫醇)，
[0009]上述的硫酯酶，包含有:
[0010]I)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的酶；
[0011]2)與I)中的酶具有同源性,且能用來(lái)催化用于合成Cilengitide的底物來(lái)合成Cilengitide 的酶。
[0012]上述2)中的同源性，為具有90%以上同源性；優(yōu)選為95%以上同源性，最佳為98%或以上的同源性。
[0013]上述的硫酯酶，還包括有其它來(lái)源的，與氨基酸序列為SEQ ID N0:1的酶同源性低于60%，也具有催化底物合成Cilengitide的酶，上述的酶的氨基酸序列為SEQ IDNO:5-12。
[0014]為了增加催化合成的效率，對(duì)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的硫酯酶進(jìn)行了突變的改造，改造后的硫酯酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
[0015]本發(fā)明的合成方法與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，在催化時(shí)間上縮短了 48倍，由原先的的32h (化學(xué)法)縮短為40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了 79.3%。因此，該方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1:本發(fā)明硫酯酶催化合成的Cilengtide的HPLC分析圖譜；圖中各個(gè)峰分別為=Cilengitide 線性底物(Su, 30min)，水解產(chǎn)物(Hy, 17min),環(huán)化產(chǎn)物(Cy，19min)。圖中，A，B，C為標(biāo)準(zhǔn)品的HLPC圖譜；D為沒(méi)有TE酶加入的催化反應(yīng)陰性對(duì)照?qǐng)D譜；E為T(mén)E酶加入的催化反應(yīng)的圖譜；
[0017]圖2:Cilengitide標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)圖譜；
[0018]圖3:用于TE催化的Cilengitide線性底物的二級(jí)圖譜；
[0019]圖4:TE酶催化后產(chǎn)物中環(huán)肽的二級(jí)圖譜；
[0020]圖5:TE酶催化后產(chǎn)物中線性底物的二級(jí)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021]對(duì)于本發(fā)明所涉及的術(shù)語(yǔ)的解釋如下:
[0022]1、TE:thioesterase 中文譯為硫酯酶，編號(hào):EC3.1.2.14 ；
[0023]2、Cilengitide:一種含有 RGD (arginine - glycine - aspartate)的五環(huán)妝化合物，為整合素抑制因子。具有抗腫瘤作用。中文常被翻譯為“西侖吉肽”或“西倫吉肽”
[0024]3、同源性:是指氨基酸序列間的相似程度。
[0025]4、BMT:英文“benzyl mercaptane”的縮寫(xiě)中文一般翻譯成“節(jié)硫醇”
[0026]5、PPANT:英文“Phosphopanthetein”的縮寫(xiě)中文一般翻譯成“磷酸泛酰巰基乙胺，，
[0027]6、SNAC:英文“N-acetylcysteamine”的縮寫(xiě)中文一般譯成“乙酰半胱胺”
[0028]7、Thiophenol:中文一般譯成“硫酚”
[0029]8、底物 L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly ;其中 L、D 代表 L 型氛基酸和 D 型氨基酸，N-met代表N端進(jìn)行甲基化修飾；
[0030]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說(shuō)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫(xiě)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0031]實(shí)施例1:硫酯酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0032]1.1引物設(shè)計(jì)
[0033]根據(jù)GenBank公布的微囊藻硫酯酶基因序列BAA83994設(shè)計(jì)以下引物。上游引物 PET-28TE-F1:5' -ATA GCT AGC ATC TAT GCT CAA GAG ATG AAT-3'，下游引物PET-28TE-R1:5/ -TTC AAG CTT TTA CGA CTG TTT TGG GTT GAG-3'。上下游引物分別引ANde I和Bam HI酶切位點(diǎn)(下劃線所示)，酶切位點(diǎn)前堿基為保護(hù)堿基。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司引物合成。
[0034]1.2硫酯酶結(jié)構(gòu)域的克隆
[0035]微囊藻基因組DNA的提取按DNeasy plant Mini Kit50試劑說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增得到的片段約720bp，取割膠回純后的DNA2 □ I用于連接反應(yīng)，體系5 □ 1，全部用于轉(zhuǎn)化。取200 □ I轉(zhuǎn)化液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，活化后送至invitrogen公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明所獲得的陽(yáng)性克隆的核苷酸序列與GenBank編號(hào)為BAA83994的序列一致。其核苷酸序列為SEQ ID NO:2，翻譯的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0036]1.3硫酯酶載體構(gòu)建
[0037]將篩選為陽(yáng)性克隆的pMD18T-TE及pET28a(+) (Novagen)采用堿裂法小量抽提質(zhì)粒用于雙酶切的質(zhì)粒。具體操作步驟按照generay質(zhì)粒微量提取試劑盒(離心柱型)說(shuō)明書(shū)。將純化后的質(zhì)粒用Nde I和Bam HI (New England lab) 37°C孵育器3h酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶，用E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit純化。取回收片段作重組連接反應(yīng)，10 μ I連接過(guò)夜，用于轉(zhuǎn)化。取200 μ I轉(zhuǎn)化液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，活化后送至invitrogen公司測(cè)序鑒定。
[0038]1.4硫酯酶體外誘導(dǎo)表達(dá)
[0039]重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_TE轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) pLysE表達(dá)菌株(轉(zhuǎn)化方法按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)。挑選單菌落分別接種于5ml含卡那霉素(50μ g/ml)LB培養(yǎng)基，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。各取1.8ml過(guò)夜培養(yǎng)物于2ml的菌種保存管中，然后加入200 μ I的無(wú)菌甘油(終濃度10%)，混勻后于-70°C保存，剩余菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液。將上述母液按1:100比例分別接種于5ml含卡那霉素(50μ g/ml)M9培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，測(cè)定0D600=0.5~0.7時(shí)，取Iml作為誘導(dǎo)前樣品，剩余培養(yǎng)液`中加入適量IPTG (終濃度0.5mM),于16°C，繼續(xù)培養(yǎng)6h。
[0040]1.5硫酯酶誘導(dǎo)產(chǎn)物的純化
[0041]將成熟菌液于50ml離心管，4000g,4°C離心20min收集菌體。加5ml columnbuffer/g重懸菌體,重懸后的菌體于鏇潤(rùn)振蕩器連續(xù)振蕩20min,之后于Precellys24菌體破碎儀中6500rpm4X30s鏇潤(rùn)破碎，12000rpm離心IOmin后,取上清進(jìn)行目的蛋白純化。
[0042]a)用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱,流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液(Binding Buffer:20mM Tris-HCl (PH7.9) IOmM 咪唑 0.5M NaCl)；
[0043]b)使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子,洗去雜蛋白；
[0044]c)使用 Elution Buffer 洗脫，收集洗脫峰(Elution Buffer:20mM Tris-HCl(PH7.9) 200~500禮咪唑0.5M NaCl)，將流出液收集后備用；
[0045]d)洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒(méi))，4°C保存；
[0046]e)將梯度洗脫后的流出液用Millipore超濾管(15mllOKD)于5000g水平轉(zhuǎn)子超濾40min，對(duì)目的蛋白濃縮后_20°C備用。對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物的全細(xì)胞裂解物，空載陰性對(duì)照，重組體未誘導(dǎo)陰性對(duì)照，流穿液及濃縮目的蛋白用5%濃縮膠和12%分離膠SDS-PAGE檢測(cè)。
[0047]實(shí)施例2:硫酯酶催化合成Cilengitide產(chǎn)物
[0048]以實(shí)施例1制備、表達(dá)純化的硫酯酶蛋白為催化反應(yīng)酶的來(lái)源(硫酯酶可以按照序列進(jìn)行人工合成)來(lái)催化合成Cilengitide產(chǎn)物,催化合成步驟如下:首先設(shè)計(jì)合成適于硫酯酶催化的 Cilengtide 的線性多肽底物 L-aspartyl-D-phenylalanyl-N-methyl-L-valyl-L-arginyl-glycyl ;該底物通過(guò)人工合成。用于磷酸緩沖液將其溶解稀釋到終濃度為0.5mM線性肽，隨后加入實(shí)驗(yàn)例I中制備的TE蛋白酶，并用MOPS緩沖液補(bǔ)足到500μ 1，最終使TE酶與線性底物的濃度比達(dá)到1:10。將該混合液置于24°C的溫度下孵育6h后立即放入_70°C，使酶催化反應(yīng)停止，完成Cilengitide產(chǎn)物的合成。隨后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥，干燥后反應(yīng)產(chǎn)物加入適量甲醇重新溶解后，溶解物于12000rpm，離心IOmin加注到制備型的HPLC,并依據(jù)Cilengitide標(biāo)準(zhǔn)品的吸收波長(zhǎng)和出峰時(shí)間進(jìn)行分離制備Cilengitide的純品(液相條件:4.6 X 250mn, VYDAC-C18。Solvent C:0.l%acetic acid inl00%water ；Solvent D:100%methanol,檢測(cè)波長(zhǎng):220nm ;梯度:D, 0 ~39min40% ~90%, 40min90%),分離后的Cilengitide進(jìn)行冷凍干燥,保存待用。[0049]將催化反應(yīng)合成的產(chǎn)物冷凍干燥后，加350 μ I甲醇溶解，溶解物于12000rpm，離心lOmin，在40μ I溶解物上清加160 μ I甲醇(稀釋5倍)后取IOyl上機(jī)。液相條件:4.6Χ250mn, VYDAC-C18。Solvent C:0.l%acetic acid inl00%water ；SolventD:100%methanol,流速:600ul/min ;上樣體積:10ul ；檢測(cè)波長(zhǎng):220nm ;梯度:D,0 ~39min40% ~90%,40min90%。
[0050]催化后的Cilengitide產(chǎn)物,線性水解Cilengitide及剩余底物均能與標(biāo)準(zhǔn)品的液相出峰時(shí)間相一致(圖1)，Cilengitide標(biāo)準(zhǔn)品一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示其的分子量是589.3(計(jì)算值)，催化反應(yīng)產(chǎn)物中的實(shí)際觀察值為=589.34。Cilengitide線性底物的標(biāo)準(zhǔn)品一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示其分子量為713.5 (計(jì)算值)，催化反應(yīng)產(chǎn)物中的實(shí)際觀察值為713.4(表1)。為進(jìn)一步驗(yàn)證催化產(chǎn)物是否為Cilengitide,分別對(duì)Cilengitide標(biāo)準(zhǔn)品、線性肽標(biāo)準(zhǔn)品以及催化后的產(chǎn)物進(jìn)行MS-MS分析，如圖2、3、4和5所示。在40v能量的攻擊下，標(biāo)準(zhǔn)品Cilengitide和催化產(chǎn)物中均有特征離子碎片:86.3m/z312.1m/zl20.2m/z,所以從一級(jí)和二級(jí)數(shù)據(jù)均能證實(shí)該催化產(chǎn)物為Cilengitide。對(duì)序列為SEQ ID NO:1的酶進(jìn)行人工合成，其也具有上述的催化合成Cilengitide的能力,催化效果也與重組表達(dá)的酶一致。
[0051]表1:催化產(chǎn)物的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種硫酯酶的用途,其特征在于,是在合成Cilengitide中的應(yīng)用。
2.一種合成Cilengitide的方法，其特征在于，是用硫酯酶來(lái)催化底物合成Cilengitide0
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述的底物為L(zhǎng)-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly0
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的底物的C端連接了BMT。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的硫酯酶，包含有: 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的酶； 2)與I)中的酶具有同源性，且能用來(lái)催化用于合成Cilengitide的底物來(lái)合成Cilengitide的硫酯酶。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的2)中的同源性，為具有90%以上同源性。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的2)中的同源性，為具有95%以上同源性。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的2)中的同源性，為具有98%或以上的同源性。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的硫酯酶的氨基酸序列為SEQIDNO:5-12中的任一個(gè)或幾個(gè)。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的硫酯酶的氨基酸序列為SEQIDNO:3。
【文檔編號(hào)】C12P21/04GK103525889SQ201310471179
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】朱鵬, 嚴(yán)小軍, 方劍, 范建忠, 黃海龍 申請(qǐng)人:寧波大學(xué), 寧波博奧生物工程有限公司