專利名稱：：癌癥檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于測癌癥和其他疾病的試劑盒。
背景技術(shù)：
：癌癥具有極高的致死率。提高癌癥存活率最重要的因素之一是早期檢測。然而，目前對癌癥進(jìn)行的早期診斷和有效治療均存在一定的局限性。癌癥發(fā)生和發(fā)展與酶基因異常表達(dá)密切相關(guān)，在細(xì)胞癌變過程中，與細(xì)胞增殖有關(guān)的酶及其同工酶活性增加。芳香基硫酸酯酶(Arylsulphatase,ARS)及其同工酶能水解芳香族的硫酸酯類，與機(jī)體解毒功能有關(guān)。一般認(rèn)為，血清ARS活性升高是炎癥過程；對區(qū)別腫瘤和非胂瘤有一定參考價(jià)值。血清中該酶濃度的測定，可以在臨床上對疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷，提供極為有用的資料。有研究表明芳香基硫酸酯酶及其同工酶(ARS)為水解酶，能催化芳香基硫酸酯水解，它們已被證明在肺癌病人血清中比正常人血清中的活性高，治療以后活性顯著下降，包含ARS在內(nèi)的溶酶體酶活性的提高可以被用來有效診斷和療效檢測(Wozniak,A.，etal.，2002)。而且ARSA和ARSB的活性在人初生和次生腫瘤組織的不同組織學(xué)類型中，在幾乎所有的初級肺癌中顯著升高(Gasa，S.,etal.,1980)。在乳腺癌患者中檢測出ARS活性是健康女性的2-5倍，經(jīng)過手術(shù)或化療后，活性降至正常。酶活性跟腫瘤大小和轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(Rozwodowska，M.，etal.,2004)。而且還發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織約是正常組織中硫酸酯酶活性的兩倍(Chetrite，GS.,etal.，2005)。另外，利用非特異性底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ARS活性在胃癌、直腸癌、乳腺癌和皮膚癌中升高(Dzialoszynski，L.M.,etal.,1966)。4-甲基傘形酮硫酸鹽(4-methylumbelliferonesulfate,4-MUS)能作為一個合適的底物來檢測ARS的活性(George,G.G，etal.,1969)。而且4-MUS在Km和Vmax、-敏感性和穩(wěn)定性方面比其他底物要好，其水解的產(chǎn)物4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone,4-MU)在堿性溶液中有較高的熒光，便于檢測?，F(xiàn)有技術(shù)均在檢測ARS中的A或者B，而本發(fā)明是檢測ARSA和B這類酶，因?yàn)?-MUS不能分辨出A/B(William,R.S.，etal.,1967，Bostick，W.D.,etal.,1978.)。
發(fā)明內(nèi)容我們通過ARS這類酶催化4-MUS底物這樣的生化反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)液中生成物4-MU反映酶活力的原理。利用特制的檢測儀器，經(jīng)特定的激發(fā)和^r測波長^r測產(chǎn)物4-MU的熒光強(qiáng)度，并才艮據(jù)已知濃度的4-MU標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量4全測樣品中的ARS的活性。以此來進(jìn)行癌癥的初期篩查和療效監(jiān)測。本發(fā)明涉及一種檢測癌癥的試劑盒，其包括4-MUS和4-MU。試劑盒中4-MUS的濃度為O.l-lOOmM，優(yōu)選1-lOmM,4-MU的濃度為l-lOOOOnM，優(yōu)選10-10000nM,更優(yōu)選100-5000nM。本發(fā)明的試劑盒可用于檢測下列癌癥肺癌、胃癌、卯巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、腸癌、鼻咽癌、腎癌、膀胱癌、淋巴癌、膽嚢癌、壺腹癌、陰莖癌、睪丸癌、喉癌、曱狀腺癌、前列腺癌、宮頸癌、大腸癌、肝外膽管癌、軟組織肉瘤、精原細(xì)胞瘤、尤文氏肉瘤、白血病、骨肉瘤、腦瘤、惡性淋巴瘤。優(yōu)選地，所述癌癥是肺癌。本發(fā)明的試劑盒使用的生物學(xué)樣本為人的全血、血清、尿液、唾液、痰液、淋巴液以及其他組織液。優(yōu)選地，所述生物學(xué)樣本為血清。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包括緩沖劑及終止液。所述緩沖劑優(yōu)選醋酸鈉，其濃度范圍是l-10000mM，優(yōu)選10-5000mM,更優(yōu)選100-1000mM，其pH的范圍是l-14，優(yōu)選4-6。所述終止液優(yōu)選碳酸鈉/碳酸氬鈉，其濃度范圍是l-50000mM，優(yōu)選10-5000mM,更優(yōu)選100-1000mM,最優(yōu)選400-600mM,其pH的范圍是l-14,優(yōu)選9-11。本發(fā)明還涉及一種特制的、專門用于檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器，其基本構(gòu)造見圖2。它可以在特定的波長激發(fā)和檢測焚光信號。所述激發(fā)波長的范圍是100-600nm,優(yōu)選300-400nm。檢測波長的范圍是100-1000nm,優(yōu)選400-500nm。這種檢測儀器能夠?qū)崿F(xiàn)自動化，批量化的操作。本發(fā)明可用于篩查與療效監(jiān)測正常人群篩選；有癥狀病人的診斷以及良性和惡性肺瘤的鑒別；病情嚴(yán)重程度，評估治療方案；監(jiān)測腫瘤的治療效果；預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)及預(yù)后。本發(fā)明的優(yōu)勢(與ELISA的比較)由于酶與底物的反應(yīng)是高效和專一的，因此酶活性測定優(yōu)于抗原-抗體反應(yīng)技術(shù)，即基本上不存在假陽性情況。同時(shí)，酶活性測定更能直接的反映腫瘤發(fā)生過程中酶生物學(xué)功能，即實(shí)驗(yàn)結(jié)杲更加真實(shí)可信。而且檢測產(chǎn)物具有特異的激發(fā)和檢測波長，使得整個實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)。圖1顯示實(shí)-驗(yàn)原理。圖2顯示檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器的基本構(gòu)造。圖3顯示抗凝劑對人血清芳香基硫酸酯酶活性的影響。圖4顯示保存狀態(tài)對人血清芳香基硫酸酯酶活性的影響。圖5是4-MU與熒光讀數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6是用3份血清樣本確定反應(yīng)時(shí)間的[4-MU]-時(shí)間曲線。圖7是血清樣本不同的稀釋條件下的[4-MU]-時(shí)間曲線。圖8是芳香基硫酸酯酶在正常人血清和肺癌等癌癥患者血清中的活性的對照。圖9是芳香基硫酸酯酶在正常人全血和肺癌等癌癥患者全血中的活性的對照。圖10顯示芳香基硫酸酯酶在正常人血清和肺癌等癌癥患者血清中的活性相對應(yīng)的靈敏度-特異性關(guān)系。具體實(shí)施方式(1)反應(yīng)參數(shù)的確定1.反應(yīng)參數(shù)1.1抗凝劑對活性的影響(圖3)從圖中可以看出，隨著抗凝劑濃度的增加EDTA對活性影響不明顯肝素鈉和檸檬酸鈉對活性影響較明顯，隨劑量增加，活性下降為了保證酶的活性，我們選擇不帶抗凝劑的血清作為實(shí)驗(yàn)樣本。1.2保存狀態(tài)對活性的影響(圖4)乂人圖4可以看出室溫保存條件下，血清酶活性隨存放時(shí)間增長而下降，且比較明顯，從第2日起，每日下降10%左右4度保存條件下，血清酶活性隨存放時(shí)間增長變化不明顯反復(fù)凍融10次，活性下降20%左右為了保證酶的活性不受影響，我們選擇保存條件為-20°C。1.3基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)確定的反應(yīng)參數(shù)OD-[P]呈直線[P]-time在前期呈直線反應(yīng)初速度v-[E]呈直線(i[S][E]0)1.3.1OD-[4-MU]標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定為了保證熒光讀數(shù)值跟4-MU濃度成線性關(guān)系，作圖5(重復(fù)實(shí)驗(yàn)中結(jié)果一致性較好)1.3.2[4-MU]-時(shí)間曲線的確定選用3份血清樣本來確定反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果顯示(圖6):[4-MU]的讀數(shù)值在圖5范圍內(nèi)，認(rèn)為36h內(nèi)呈線性；為保證測量的時(shí)間選取在線性范圍內(nèi)，同時(shí)與背景(對照)數(shù)值有明顯差異，確定反應(yīng)時(shí)間為24h。1.3.3血清樣本不同的稀釋條件下的[4-MU]-時(shí)間曲線(圖7)為保證血清樣本稀釋的倍數(shù)的選取在線性范圍內(nèi)，確定采取1:8稀釋，再加入20pL于反應(yīng)體系中。2.反應(yīng)參數(shù)的確定血清稀釋至1/8，取20pl進(jìn)行酶活反應(yīng)，24h后測定熒光讀數(shù)，同時(shí)測定OD-[4-MU]標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將(OD樣本-OD對照.(水))換算為W-MU](2)實(shí)驗(yàn)步驟采血5mL左右，加入真空、帶分離膠且不含抗凝血劑的試管，室溫靜置30min左右，水平離心機(jī)，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10min,將最上層血清吸出/傾倒出，轉(zhuǎn)至1.5mLEP管/或其他類型未用過的小管，冷凍(-20攝氏度)至使用。測定活性時(shí)，取50jxl血清加入350^1的100mM醋酸鈉緩沖液(pH5.4)中。取20nl上述已稀釋過的血清，加入180^1反應(yīng)體系(含100mM醋酸鈉，pH6，8mM4-MUS)。置溫箱(37。C)反應(yīng)24小時(shí)后，加入lml終止緩沖液(500mM碳酸鈉/碳酸氬鈉緩沖液，pH12)，進(jìn)行熒光測定。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品4-MU(純產(chǎn)物)作OD-[4-MU]標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將血清反應(yīng)讀數(shù)按照此標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算，得到每個反應(yīng)的[4-MU]。根據(jù)上述[4-MU]，得到該血清ARS的活力，即每分鐘每升酶蛋白能轉(zhuǎn)化的底物摩爾數(shù)，或者得到該血清ARS的比活力，即每分鐘每毫克酶蛋白能轉(zhuǎn)化的底物摩爾數(shù)。數(shù)據(jù)處理方式I:測定緩沖液(含等濃度的醋酸鈉和終止液成分)中標(biāo)準(zhǔn)樣品即4-MU(0.003mM)的OD,^己為ODs測定對照反應(yīng)(以20ji1醋酸鈉緩沖液替代血清的反應(yīng))的OD,記為OD0(ODn-OD0)/[4-MU]n=ODs/[4-MU]s[4-MU]n=(ODn-OD0)*0.003mM/ODs可以算得樣品n反應(yīng)得到的產(chǎn)物4-MU的量，即參與反應(yīng)的底物4-MUS的量可以得到樣品n的活性，即每分鐘每升酶蛋白能轉(zhuǎn)化的底物摩爾數(shù)公式為[4-MU]n/(L*24*60)單位換算成nmol/min/L數(shù)據(jù)處理方式II:測定緩沖液(含等濃度的醋酸鈉和終止液成分)中標(biāo)準(zhǔn)樣品即4-MU(0.003mM)的OD,i己為ODs測定對照反應(yīng)(以20pl醋酸鈉纟爰沖液替代血清的反應(yīng))的OD,記為ODO(ODn-OD0)/[4-MU]n=ODs/[4-MU]s[4-MU]n=(ODn-OD0)*0.003mM/ODs可以算得樣品n反應(yīng)得到的產(chǎn)物4-MU的量，即參與反應(yīng)的底物4-MUS的量.測定樣品n的酶蛋白量用牛血清蛋白(BSA)作對照，紫外分光光度計(jì)入=280nm來纟全測，得到樣品n的酶蛋白濃度，記為Mn,可以算得樣品n的酶蛋白量，記為Mgn.可以得到樣品n的酶比活性，即每分鐘每毫克酶蛋白能轉(zhuǎn)化的底物摩爾數(shù)。公式為[4-MU]n/(Mgn*24*60)單位換算成nmol/min/mg實(shí)驗(yàn)所用儀器水平離心機(jī)HeraeusLabofuge400R檢測儀器(i)基本構(gòu)造如圖2所示的用于檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器，它可以在特定的波長激發(fā)和檢測菱光信號。其中激發(fā)波長的范圍是100-600nm，檢測波長的范圍是100-1000nm。這種檢測儀器能夠?qū)崿F(xiàn)自動化，批量化的操作；或者(ii)焚光分光光度計(jì)HITACHIF-2500FluorescenceSpectrophotometer電熱恒溫培養(yǎng)箱天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電路有限公司蝸旋振蕩器IKAMS2Minishaker移液器吉爾森lmL，200^1,20}il(3)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1.正常人(15例)和癌癥患者(肺癌7例、胃癌1例、卵巢癌3例、胰腺癌1例、乳腺癌1例)每種血清標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。全部測量數(shù)據(jù)見圖8。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.正常人和癌癥患者相對應(yīng)的血清標(biāo)本的活力均值表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將正常人血清(共15樣本)與癌癥患者血清(共13樣本)進(jìn)行T檢測，得到p=0.005415<0,01。-特異性關(guān)系見圖10。4.標(biāo)準(zhǔn)的確定根據(jù)靈敏度-特異性的關(guān)系，我們選擇靈敏度和特異性相對數(shù)值都高的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)1.Wozniak，A"etal"Neoplasma，2002.49(1):p.10-5.2.Gasa，S.，etal"CancerRes,1980.40(10):p.3804-9.3.Rozwodowska,M.,etal"PolMerkuriuszLek,2004.17(99):p.252-4.4.Chetrite,G.S.，etal"AnticancerRes，2005.25(4):p.2827-30.5.Dzialoszynski,L.M.，etal"ClinChimActa,1966.14(4):p.450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