專利名稱：Gpr54敲除哺乳動(dòng)物以及利用它們的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已知受體的新功能。具體地，本發(fā)明涉及甘丙素(galanin)-樣受體或其配體在操縱垂體激素軸和生殖系統(tǒng)中的用途。
編碼GPR54的Harry potter位于人染色體19p13.3。
GPR54的cDNA為1197bp。研究顯示GPR54與大鼠甘丙素受體GalR1，GalR2具有45％同一性，而與GalR3具有44％同一性。
甘丙素是神經(jīng)肽，其不屬于任何已知的神經(jīng)肽家族。它在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)并調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，包括學(xué)習(xí)和記憶，疼痛，進(jìn)食，神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放以及性行為，并被認(rèn)為參與阿爾茨海默氏癥(Alzheimers)的發(fā)病(Lee等1999 FEBS lett 446103-107)。然而，據(jù)報(bào)道甘丙素或甘丙素-樣肽都不活化GPR54(Lee等1999 FEBS lett 446103-107；Ohtaki等2001Nature 411613-617)。
報(bào)道提示FMRF酰胺相關(guān)的肽(FaRP)是GPR54的低效激動(dòng)劑(微摩爾范圍)(Clements等2001 Biochem Biophys Res Commun 2841189-83)。FaRP是在無(wú)脊椎動(dòng)物中廣泛分布的神經(jīng)肽，其功能為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物。
其它研究表明，GPR54的天然配體為kisspeptin(也稱metastin)，其為Kiss-1基因的產(chǎn)物。具有常見RF-酰胺C末端的三種肽來(lái)自Kiss-1。有54，14和13氨基酸的kisspeptin。它們都以低納摩爾親和力與GPR54結(jié)合。Kisspeptin 54也稱metastin。這些GPR54配體以低納摩爾親和力與GPR54結(jié)合(Muir等2001 J Biol Chem 27628969-75；Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-36)。
一些報(bào)道提示配體結(jié)合的GPR54具有多種功能。例如，已報(bào)道Kiss-1是黑素瘤和乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移阻抑基因。然而，研究提示Kiss-1基因不影響致腫瘤性(tumorigenicity)。推定metastin通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)量細(xì)胞粘附性表型降低細(xì)胞移動(dòng)性。在足墊中注入了黑素瘤的小鼠中，通過(guò)輸注給藥metastin可顯著減少轉(zhuǎn)移(Ohtaki等2001 Nature 411613-617)。類似地，metastin抑制GPR54受體轉(zhuǎn)染的B16-L16黑素瘤細(xì)胞的移動(dòng)性，但不影響假-轉(zhuǎn)染(mock-transfected)的細(xì)胞。
其它研究還顯示GPR54(也稱metastin受體)活化可刺激PIP2水解，鈣動(dòng)員(mobilization)，花生四烯酸釋放，ERK1/2和p38 MAP激酶磷酸化，以及stress fibre形成，但抑制細(xì)胞增殖(Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-3)。有趣的是，向雌性大鼠靜脈內(nèi)注入kisspeptin-10刺激催產(chǎn)素分泌(Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-3)。催產(chǎn)素參與性行為/睪丸功能；催產(chǎn)素拮抗劑抑制雄性交配行為(Argiolas等1988 Eur J Pharmacol 149389-92)。然而，催產(chǎn)素KO小鼠顯示正常性行為并是可生育的(Nishimori等1996 Proc Natl Acad Sci USA 9311699-704)。
在大鼠的以下組織中通過(guò)northern蛋白印跡檢測(cè)GPR54腦(橋腦(pons，中腦(midbrain)，丘腦(thalamus)，下丘腦(hypothalamus)，海馬(hippocampus)，杏仁核(amygdale)，皮質(zhì)(cortex)，額葉(frontal)皮質(zhì)和紋狀體(striatum))，以及外周器官(肝和腸)(Lee等1999 FEBS lett 446103-107)。
大鼠腦中的原位分析顯示下丘腦和杏仁核區(qū)的表達(dá)最高。這些受體在以下區(qū)域高表達(dá)未定帶(zona incerta)，腹側(cè)背蓋區(qū)(ventral tegmental area)，齒狀回(dentate gyrus)，弓狀核(arcuate nucleus)，背側(cè)中間核(dorsomedialnucleus)，嗅(olfactory)皮質(zhì)，韁外側(cè)核(lateral habenular nucleus)，外側(cè)下丘腦(lateral hypothalamus)，藍(lán)斑(locus coeruleus)，杏仁核的皮質(zhì)和中間核(cortical and medial nuclei of amygdala)，上丘(superior colliculus)，視前核(preoptic)，下丘腦前部和后部(anterior and posterior hypothalamus)，導(dǎo)水管周灰質(zhì)(periaqueducal gray)，丘腦束旁核(parafascicular thalamic nucleus)，臂旁核(parabrachial nucleus)以及腹側(cè)乳頭體(ventral mamillary body)。GPR54表達(dá)與甘丙素受體相似(Lee等1999 FEBS lett 446103-107)。
在人組織中，northern分析顯示在腦/神經(jīng)系統(tǒng)(皮質(zhì)，殼核(putamen)，延髓(medulla)，脊髓，在海馬和丘腦中的表達(dá)較低)以及垂體，心，骨骼肌，腎，肝，胃，小腸，胸腺，肺，睪丸和胎盤中的表達(dá)(Clements等2001 BiochemBiophys Res Commun 2841189-93；Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-36)。
GPR54也通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)在人腦的以下區(qū)中檢測(cè)到大腦皮質(zhì)(錐體細(xì)胞(pyramidal cell)及其在感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的第III層(laminar layer III)中的上行突(ascending process))，丘腦，腦橋-延髓(pons-medulla)(中縫核(raphe)，下橄欖核(inferior olive)，舌下神經(jīng)核(hypoglossal nuclei))，小腦(蒲肯野細(xì)胞(purkinje cell)核周體(perikarya)及其上行頂樹突(ascending apicaldendrite)。
然而，本領(lǐng)域沒有關(guān)于GPR54在哺乳動(dòng)物的總體作用以及其具體在腦內(nèi)的作用的認(rèn)識(shí)。
報(bào)告表明，F(xiàn)aRP(GPR54的低效激動(dòng)劑，其在微摩爾范圍起作用)的脊椎動(dòng)物受體在氨基酸水平上與神經(jīng)肽Y(NPY)受體非常相似(Clements等2001 Biochem Biophys Res Commun 2841189-93)。其它研究顯示，F(xiàn)aRP與促性腺激素釋放激素(GnRH)共定位(colocalise)，與穗狀花序(locusta)中的受精囊(spermatheca)以及食血昆蟲(blood feeding bug)的唾液腺共定位。
果蠅(Drosophila)FMRF酰胺基因通過(guò)其與首先在海蝸牛黑斑海兔(marine snail Aplysia)中測(cè)序的基因的同源性鑒定。FMRF酰胺基因最初作為來(lái)自蛤(clam)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)性四肽而純化。在軟體動(dòng)物(molluscs)中，其調(diào)節(jié)心臟輸出以及神經(jīng)元的作用，并調(diào)節(jié)誘導(dǎo)的(evoked)肌肉張力。在牛(cattle)中，對(duì)相關(guān)龍蝦激素具有免疫反應(yīng)性的兩種肽已經(jīng)鑒定出；所述牛蛋白具有抗止痛活性。
盡管FMRF-酰胺肽的作用主要在無(wú)脊椎動(dòng)物中研究，有3篇文獻(xiàn)描述了FmRF酰胺在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的免疫反應(yīng)性一種在兔、大鼠和豚鼠中(Duann等1995 Gaoxiong Yi Xue Ke Xue Za Zhi.11142-9)，一種在樹鼯(treeshrew)中(Malz and Kuhn 2002 Dev Brain Res 13539-44)，還有一種在大褐蝙蝠(big brown bat)中(Oelschlager等1998 Brain Behav Evol 52139-47)。有趣的是，所有這些文獻(xiàn)都描述了FmRF酰胺-樣及GnRH免疫反應(yīng)性的共表達(dá)。在蝙蝠和樹鼯中，這種表達(dá)見于終末神經(jīng)(terminal nerve)。所述終末神經(jīng)是前顱神經(jīng)(anterior cranial nerve)，其支配鼻腔的化學(xué)感受性上皮。該神經(jīng)的功能未知，但據(jù)提示其具有神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。破壞該神經(jīng)導(dǎo)致雄性倉(cāng)鼠(hamster)的交配行為受損(Wirsig，and Leonard 1987 Brain Res 417293-303)。
根據(jù)Raffa(Raffa and Stone 1988 Peptides 191171-75)，F(xiàn)MRF酰胺或FMRF酰胺-相關(guān)肽(FaRP)存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道，并對(duì)哺乳動(dòng)物具有心臟激動(dòng)作用(cardioexcitatory)，抑制嗎啡-誘導(dǎo)的抗疼痛作用，以及阻斷嗎啡-、擊敗(defeat)-和剝奪(deprivation)誘導(dǎo)的進(jìn)食(feeding)。它還抑制結(jié)腸推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)(colonic propulsive motility)，在鞘內(nèi)注射時(shí)誘導(dǎo)對(duì)行為的影響，并據(jù)報(bào)道對(duì)嚙齒類動(dòng)物具有致失憶(amnesic)作用。具體地，F(xiàn)MRF酰胺在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生中樞介導(dǎo)的抗疼痛作用(Raffa and Stone 1998 Peptides191171-75，Gupta等1999 Peptides 20471-78)。
以前的研究表明，甘丙素敲除小鼠(至今沒有關(guān)于受體敲除(receptorknock-out)的描述)是可得的，其可正常生長(zhǎng)并繁殖但不能泌乳。它們的感覺神經(jīng)元對(duì)損傷的反應(yīng)被破壞，周圍神經(jīng)再生降低，并且神經(jīng)性疼痛的出現(xiàn)明顯減少。DRG神經(jīng)元的亞群在突變小鼠中缺失，表明甘丙素在細(xì)胞存活中有作用(Wynick等1998 Ann NYAcad Sci，86322-47)。
研究表明GPR54與多步驟轉(zhuǎn)移也有關(guān)，包括癌細(xì)胞從原發(fā)癌的脫離，侵入周圍組織，通過(guò)循環(huán)擴(kuò)散，再入侵遠(yuǎn)處器官并在其中增殖。然而，在本申請(qǐng)?zhí)峤粫r(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)GPR54的其它作用。
因此，仍需要鑒定配體結(jié)合的GPR54在腦和其它組織內(nèi)的功能，從而將其用于治療或其它用途。
發(fā)明概述本發(fā)明人制成GPR54(Harry Potter)敲除(knockout)小鼠來(lái)研究GPR54的體內(nèi)作用。本發(fā)明人還顯示所述敲除小鼠與非突變體的生殖形態(tài)以及生理有差異，提示GPR54具有在控制性激素軸以及生殖區(qū)諸如控制生育力和性欲中的作用。此外，這種突變體的生理和形態(tài)提示GPR54在一些神經(jīng)疾病和其它疾病例如肌肉消耗性疾病(muscle wasting)和炎癥中的作用。
Harry Potter敲除小鼠可用作疾病模型以及鑒定用于治療的GPR54拮抗劑和激動(dòng)劑。
因此，本發(fā)明的第一方面提供了GPR54敲除哺乳動(dòng)物，其包含一或多種細(xì)胞，所述細(xì)胞中GPR54多肽是功能失活的。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明前述方面的GPR54敲除小鼠顯示許多限定性性質(zhì)，包括接觸性翻正反射減少和Barnes maze表現(xiàn)降低，生殖激素水平和/或模式(包括周期)改變，生殖器官和相關(guān)器官的形態(tài)改變，性/生殖行為改變。
如上所述，生殖器官形態(tài)改變包括以下所述一或多種生殖器(genital)和相關(guān)器官萎縮，胃和上頜下唾液腺(sub maxillary salivary glands)萎縮，肌肉和褐色脂肪萎縮。
敲除哺乳動(dòng)物的產(chǎn)生是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的并可利用本文所述涉及同源重組的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。
優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是選自下組的哺乳動(dòng)物之一小鼠，大鼠，地鼠(shrew)，沙鼠(gerbil)，豚鼠，猴，倉(cāng)鼠，貓或狗。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員理解所列舉動(dòng)物并非窮盡性的。最優(yōu)選，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。
本文術(shù)語(yǔ)“功能失活的”(GPR54，通過(guò)同源重組)意思是與其中的GPR54不是功能失活的對(duì)照相比，通常由GPR54多肽在其天然環(huán)境(即在體內(nèi)環(huán)境中)下發(fā)揮的一或多種功能被明顯抑制。優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“功能失活的”指與其中的GPR54不是功能失活的對(duì)照相比，GPR54在其天然環(huán)境(體內(nèi)環(huán)境中)通常顯示的一種以上的功能被明顯抑制。更優(yōu)選，本文術(shù)語(yǔ)“功能失活的”指與其中的GPR54不是功能失活的對(duì)照相比，GPR54在其天然環(huán)境(體內(nèi)環(huán)境中)通常顯示的所有功能被明顯抑制。
同樣，本文的“功能失活的(functionally inactivated)”GPR54核酸編碼本文的功能失活的GPR54。
如上所述，術(shù)語(yǔ)“明顯抑制的”(GPR54功能)指所述抑制(如上述通過(guò)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的至少一種GPR54功能而言)與適宜的對(duì)照相比被抑制至少20％。適宜對(duì)照的實(shí)例是相同或相似體內(nèi)環(huán)境中的相同或相似細(xì)胞，其中GPR54沒有如本文所述由于同源重組而功能失活。優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“明顯抑制的”(如上述通過(guò)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對(duì)照相比被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。最優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“明顯抑制的”(如上述通過(guò)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對(duì)照相比被抑制100％。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生一或多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞包括一或多種功能失活的GPR54基因，所述方法包括選擇一或多種包含一或多種功能活性內(nèi)源GPR54基因的細(xì)胞。
利用功能失活的GPR54核酸轉(zhuǎn)染步驟(a)的一或多種細(xì)胞，所述功能失活的GPR54核酸可通過(guò)同源重組與一或多種內(nèi)源GPR54基因組合。
選擇一或多種細(xì)胞，其中的一或多種內(nèi)源GPR54基因已經(jīng)和功能失活的GPR54核酸進(jìn)行了同源重組。
優(yōu)選，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明上述方法產(chǎn)生。在本發(fā)明該方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含在哺乳動(dòng)物內(nèi)。即根據(jù)本發(fā)明上述方面的細(xì)胞將優(yōu)選構(gòu)成“敲除”哺乳動(dòng)物。優(yōu)選，本文的敲除哺乳動(dòng)物是小鼠。
用功能失活的GPR54轉(zhuǎn)染一或多種細(xì)胞的方法涉及利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)以及本文所述技術(shù)。同樣，選擇一或多種細(xì)胞的方法利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(在本文描述)進(jìn)行，所述細(xì)胞中的一或多個(gè)內(nèi)源GPR54基因與功能失活的GPR54核酸已經(jīng)進(jìn)行了同源重組。
另一方面，本發(fā)明提供核酸構(gòu)建體，其適于宿主細(xì)胞中功能失活的一或多種內(nèi)源GPR54基因，所述構(gòu)建體包括(a)A非-同源置換區(qū)(replacement region)，(b)位于所述非-同源置換區(qū)上游的第一同源區(qū)，(c)突變的GPR54基因，其表達(dá)時(shí)不編碼功能活性GPR54，(d)位于所述非-同源置部分下游的第二同源區(qū)，所述第二同源區(qū)位于該非-同源置換區(qū)的下游，并具有與第二GPR54基因至少90％相同的核苷酸序列。
本發(fā)明人鑒定了與GPR54相關(guān)的數(shù)種功能，由此他們認(rèn)為GPR54多肽，或其一或多種結(jié)合蛋白或編碼它們的核酸有治療意義。
因此，另一方面，本發(fā)明提供包含GPR54多肽的組合物、或其一或多種結(jié)合蛋白、或編碼它們的核酸，以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，優(yōu)選所述組合物包含一或多種GPR54多肽結(jié)合蛋白。優(yōu)選所述一或多種GPR54結(jié)合蛋白是GPR54的拮抗劑或激動(dòng)劑。
GPR54結(jié)合蛋白可以是天然存在的或合成的。天然存在的結(jié)合蛋白可為多肽諸如本文所述的抗體或核酸。合成GPR54結(jié)合蛋白優(yōu)選可為較小的分子并可通過(guò)篩選方法選擇，所述篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的并在本文描述。
在本發(fā)明另一可選實(shí)施方案中，優(yōu)選所述組合物包含編碼GPR54結(jié)合蛋白的核酸或編碼GPR54多肽的核酸。
本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)GPR54敲除小鼠與正常對(duì)照小鼠相比具有改變的神經(jīng)元功能以及改變的生殖系統(tǒng)。此外，GPR54敲除小鼠具有其它形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)異常。GPR54敲除小鼠垂體下丘腦軸的促性腺激素產(chǎn)生有缺陷。GPR54受體因此據(jù)信通過(guò)控制垂體-下丘腦的促性腺激素分泌參與控制該軸。本發(fā)明人還顯示在GPR54敲除小鼠中(a)促性腺激素較低；(b)至少卵巢對(duì)給予外源性促性腺激素有反應(yīng)，表明它們保持應(yīng)答能力；和(c)外源性給予GnRH誘發(fā)至少部分FSH和LH分泌的反應(yīng)，表明GPR54可能參與下丘腦-垂體中GnRH分泌的上游控制。
因此，本發(fā)明人認(rèn)為GPR54的激動(dòng)劑和/或拮抗劑或包含它們的組合物具體可用于治療生殖激素(reproductive hormone)相關(guān)的、神經(jīng)性和其它一些疾病。所述神經(jīng)性疾病包括但不限于以下疾病中的一或多種阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病(sensory neuropathy)和癲癇(epilepsy)。
這種生殖激素相關(guān)的疾病包括一或多種選自下組的疾病生育力(fertility)、節(jié)育(contracteption)、性欲和青春期開始(libido and the onset ofpuberty)的調(diào)節(jié)，泌乳(lactation)，骨質(zhì)疏松(osteoporosis)/骨硬化病(osteopetrosisi)或停經(jīng)(menopause)。此外，GPR54激動(dòng)劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。
其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛(pain)，激素依賴性癌癥(hormonedependent cancer)和肥胖(obesity)。
因此，本發(fā)明另一方面提供了鑒定一或多激動(dòng)GPR54多肽的功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟選擇一或多種哺乳動(dòng)物，其包含功能失活的GPR54多肽；(b)用一或多種可能的GPR54類似物(mimic)治療所述一或多種哺乳動(dòng)物，所述類似物可能激動(dòng)至少一方面的GPR54活性；(c)檢測(cè)根據(jù)步驟(b)治療的一或多種哺乳動(dòng)物，以確定這些經(jīng)過(guò)治療的哺乳動(dòng)物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動(dòng)物相比是否具有一或多種恢復(fù)的性質(zhì)知(d)選出一或多種GPR54-配體類似物，所述類似物使得根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動(dòng)物恢復(fù)野生型哺乳動(dòng)物的一或多種性質(zhì)。
本發(fā)明還提供鑒定拮抗GPR54多肽的有功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動(dòng)物，其包含功能活性GPR54多肽；
(b)用一或多種可能的GPR54拮抗劑治療所述一或多種哺乳動(dòng)物，所述拮抗劑可能拮抗至少一方面的GPR54活性；(c)檢測(cè)根據(jù)步驟(b)治療的一或多種哺乳動(dòng)物，以確定這些經(jīng)過(guò)治療的哺乳動(dòng)物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動(dòng)物相比是否具有一或多種經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的性質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因GPR54敲除哺乳動(dòng)物在用于測(cè)定一或多種化合物的生物效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中的用途。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，術(shù)語(yǔ)“拮抗劑“指與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，顯著抑制(如本發(fā)明定義)GPR54的一或多種功能的分子。
本發(fā)明利用GPR54本身，其激動(dòng)劑和拮抗劑，以及GPR54活性的調(diào)節(jié)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解多種試劑可增加或降低GPR54的效應(yīng)，且實(shí)現(xiàn)上述效應(yīng)改變的途徑有多種；因此所述激動(dòng)劑可模擬活化的GPR54，或與GPR54結(jié)合并增加其活性；GPR54活性的激動(dòng)型調(diào)節(jié)物也如此，或增加GPR54的內(nèi)源激動(dòng)劑或內(nèi)源GPR54本身的產(chǎn)生。拮抗劑和拮抗型調(diào)節(jié)物的作用可相同(likewise)，但都降低GPR54的生物效應(yīng)。
本文術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物“指任何哺乳動(dòng)物。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物是非人哺乳動(dòng)物。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物選自小鼠，大鼠，豚鼠，兔，倉(cāng)鼠，沙鼠，貓，狗和猴。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解所列動(dòng)物并非窮盡性的。
根據(jù)本發(fā)明這方面，術(shù)語(yǔ)“治療”(用可能的GPR54拮抗劑治療哺乳動(dòng)物)指使得所述哺乳動(dòng)物的一或多種細(xì)胞與一或多種可能的GPR54拮抗劑接觸。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，異常神經(jīng)性質(zhì)的指征包括接觸性翻正反射減少和Barnes maze表現(xiàn)降低。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，術(shù)語(yǔ)“異常生殖系統(tǒng)和/或形態(tài)”包括′生殖激素水平和/或模式(包括周期)與適宜對(duì)照相比的任何改變，生殖器官和相關(guān)器官形態(tài)與適宜對(duì)照相比的任何改變，以及性/生殖行為與適宜對(duì)照相比的改變。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明上述方面，生殖器官形態(tài)與適宜對(duì)照相比的改變包括選自下組的一或多種改變生殖器及相關(guān)器官萎縮，胃及上頜下唾液腺萎縮，肌肉及褐色脂肪萎縮。
異常神經(jīng)功能，異常生殖系統(tǒng)和異常生殖形態(tài)的檢測(cè)利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)并是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。
優(yōu)選，本發(fā)明上述方面的步驟(c)涉及檢測(cè)一或多種哺乳動(dòng)物，以確定所述哺乳動(dòng)物是否顯示一或多種由GPR54敲除小鼠顯示的性質(zhì)，所述性質(zhì)是異常生殖系統(tǒng)和/或形態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，根據(jù)步驟(a)選出的一或多種哺乳動(dòng)物優(yōu)選為GPR54敲除小鼠。優(yōu)選，它們根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生。
本文術(shù)語(yǔ)“功能失活的”(GPR54)意思是與其中的GPR54沒有被功能失活的對(duì)照相比，通常由GPR54多肽在其天然環(huán)境(即在體內(nèi)環(huán)境中)顯示的一或多種功能被明顯抑制。優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“功能失活的”指與其中的GPR54沒有被功能失活的對(duì)照相比，GPR54在其天然環(huán)境(體內(nèi)環(huán)境中)通常顯示的一種以上的功能被明顯抑制。更優(yōu)選，本文術(shù)語(yǔ)“功能失活的”指與其中的GPR54沒有被功能失活的對(duì)照相比，GPR54在其天然環(huán)境(體內(nèi)環(huán)境中)通常顯示的所有功能被明顯抑制。
同樣，本文“功能失活的”GPR54核酸編碼本文功能失活的GPR54。
如上所述，術(shù)語(yǔ)“明顯抑制的”(GPR54功能)指所述抑制(如上述通過(guò)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的至少一種GPR54功能而言)與適宜的對(duì)照相比被抑制至少20％。適宜對(duì)照的實(shí)例是相同或相似體內(nèi)環(huán)境中的相同或相似細(xì)胞，其中GPR54沒有如本文所述由于同源重組而被功能失活。優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“明顯抑制的”(如上述通過(guò)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對(duì)照相比被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。最優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“明顯抑制的”(如上述通過(guò)同源重組對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對(duì)照相比被抑制100％。
根據(jù)本發(fā)明這方面，術(shù)語(yǔ)“治療”(用可能的GPR54拮抗劑治療哺乳動(dòng)物)指使得所述哺乳動(dòng)物的一或多種細(xì)胞與一或多種可能的GPR54拮抗劑接觸。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，術(shù)語(yǔ)“野生型哺乳動(dòng)物的一或多種經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的活性”指調(diào)節(jié)野生型哺乳動(dòng)物與包含本文所述功能失活的GPR54多肽的哺乳動(dòng)物相比的一或多種活性。優(yōu)選所述調(diào)節(jié)是恢復(fù)丟失的功能。
本文的GPR54類似物復(fù)制野生型GPR54的至少一種活性或功能。所述類似物可模擬活化的GPR54，或模擬失活的GPR54，使得其進(jìn)一步抑制功能，所述功能本身在缺乏天然失活的GPR54時(shí)被抑制。
本發(fā)明人認(rèn)為GPR54核酸或編碼GPR54的一或多種激動(dòng)劑或拮抗劑的核酸可插入哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生一或多種治療效果。
另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中至少部分細(xì)胞包含編碼一或多種選自下組物質(zhì)的外源性核酸GPR54多肽，GPR54多肽的一或多種激動(dòng)劑以及GPR54多肽的一或多種拮抗劑。
優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物選自小鼠，人，豬，山羊，鹿，猴和母牛。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解所列動(dòng)物并非窮盡性的。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，術(shù)語(yǔ)“外源性核酸”指不源自所述具體動(dòng)物的核酸。然而，其可來(lái)自相同動(dòng)物種類或品系。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可包含細(xì)菌來(lái)源的GPR激動(dòng)劑核酸。
優(yōu)選，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的部分細(xì)胞包含外源性DNA，所述外源性DNA編碼GPR54的一或多種激動(dòng)劑或一或多種拮抗劑。
本文的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可為選自下組的一或多種動(dòng)物小鼠，大鼠，猴，狗，貓和豬。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解所列動(dòng)物并非窮盡性的。
利用根據(jù)本發(fā)明制備的GPR54敲除小鼠進(jìn)行研究表明，GPR54多肽與神經(jīng)元功能和生殖功能(包括生殖周期)以及其它疾病有關(guān)。這種神經(jīng)疾病包括，但不限于以下疾病的一或多種阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病或癲癇。所述生殖激素相關(guān)疾病包含下組疾病的一或多種生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病或停經(jīng)。此外，GPR54激動(dòng)劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。
因此，本發(fā)明另一方面提供診斷選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖，所述方法包括以下步驟從待診斷的患者中選出細(xì)胞樣品，比較所述細(xì)胞樣品與來(lái)自健康個(gè)體的一或多個(gè)對(duì)照樣品的GPR54多肽表達(dá)水平和/或功能活性。
另一實(shí)施方案中，Harry Potter或其天然配體的多態(tài)性可用于診斷疾病。因此，本發(fā)明提供了診斷選自以下疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖，包括以下步驟從待診斷的患者中選出細(xì)胞樣品，分析所述細(xì)胞中的內(nèi)源核酸，以檢測(cè)內(nèi)源性GPR54基因一或多種天然GPR54配體的一或多種多態(tài)性。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，其中GPR54的表達(dá)水平和/或功能活性增加、降低或改變，或其中GPR54核酸或編碼GPR54配體的核酸包含一或多種多態(tài)性的樣品，與來(lái)自健康個(gè)體的一或多種對(duì)照樣品相比可表明前一種樣品所來(lái)源的個(gè)體具有上述一或多種疾病。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，利用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)選擇來(lái)自患者的樣品細(xì)胞，所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。
上文術(shù)語(yǔ)GPR54多肽的“功能活性”指GPR54在其天然環(huán)境即在其細(xì)胞內(nèi)中通常執(zhí)行的功能。
因此，另一方面，本發(fā)明提供治療患者中選自下組的疾病肌肉消耗性疾病，疼痛，炎癥，激素依賴性癌癥，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，與停經(jīng)相關(guān)的激素失衡或肥胖，所述治療包括用治療有效量的GPR54的一或多種拮抗劑或激動(dòng)劑治療所述患者。
另一方面，本發(fā)明提供GPR54的一或多種拮抗劑或激動(dòng)劑在制備用于預(yù)防或治療疾病的藥物中的用途，所述疾病選自下組肌肉消耗性疾病，疼痛，炎癥，激素依賴性癌癥，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，與停經(jīng)相關(guān)的激素失衡或肥胖。
另一方面，本發(fā)明提供操縱患者性激素軸的方法，包括用治療有效量的GPR54的一或多種拮抗劑或激動(dòng)劑治療患者。
另一方面，本發(fā)明提供GPR54的拮抗劑或激動(dòng)劑在制備用于操作動(dòng)物性激素軸的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明上述兩方面，優(yōu)選對(duì)性激素軸操縱的導(dǎo)致對(duì)選自下組的任何一或多種影響(effect)或疾病的操縱生育力，性欲，節(jié)育和青春期早熟(precocious puberty)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示GPR54敲除前，小鼠GPR54基因組基因座的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示GPR54敲除后，小鼠GPR54的基因組基因座的結(jié)構(gòu)。
圖3顯示用于GPR54同源重組的靶向型載體(targeting vector)的結(jié)構(gòu)，包括相關(guān)限制位點(diǎn)。
圖4a顯示敲除小鼠腦切片以及圖4b顯示對(duì)雜合子和野生型的檢測(cè)。
圖5a顯示對(duì)野生型和突變體小鼠的檢測(cè)。圖5b顯示野生型小鼠的包皮腺(preputial gland)，且圖5c顯示突變體小鼠的包皮腺。
圖6顯示野生型(上圖)和敲除小鼠(下圖)的卵巢。
圖7圖示用Barnes maze實(shí)驗(yàn)比較野生型和敲除小鼠的行為的結(jié)果。
圖8顯示敲除小鼠陰道涂片的照片。
圖9圖示野生型和敲除小鼠的平均睪丸重量。
圖10顯示野生型和敲除小鼠的平均肌肉重量。
圖11顯示野生型和敲除小鼠的平均腎上腺重量(圖11a)和唾液腺重量(圖11b)。
圖12顯示雄性和雌性GPR54敲除小鼠與野生型小鼠相比的睪酮水平。
圖13圖示雌性敲除小鼠的雌二醇水平。
圖14圖示雌性(圖14a)和雄性(圖14b)敲除小鼠的FSH水平。
圖15圖示血清(圖15a)和垂體(圖15b)的LH水平。
圖1 6顯示電Northern(electronic Northern)。

發(fā)明內(nèi)容
除非特別說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐采用傳統(tǒng)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中有描述。見例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Books 1-3，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F(xiàn).M.等(1995 and periodic supplements；CurrentProtocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA IsolationandSequencingEssential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak andJames O′D.McGee，1990，In Situ HybridizationPrinciples and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide SynthesisAPractical Approach，Irl Press；and，D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymologyDNA StructurePart ASynthesis and Physical分析of.DNA Methods in Enzymology，Academic Press。所述文獻(xiàn)的內(nèi)容包含在本文作為參考。
GPR54為避免疑問(wèn)，本文術(shù)語(yǔ)″GPR54″指任何通過(guò)相關(guān)GenBank登錄號(hào)鑒定的以下序列NT011255人(Homo sapiens)染色體19基因組片段組(contig)；NM～053244小家鼠(Mus musculus)G蛋白-偶聯(lián)的受體54(Gpr54)，mRNA；BC016531小家鼠G蛋白-偶聯(lián)的受體54，mRNA(cDNA克隆MGC27839IMAGE3488082)，完全cds；M 032551人G蛋白-偶聯(lián)的受體54(GPR54)，mRNA；NM023992大家鼠(Rattus norvegicus)G蛋白-偶聯(lián)的受體54(Gpr54)，mRNA；NW047773大家鼠染色體7WGS超片段組(supercontig)；AK039628成年雄性小家鼠脊髓cDNA，RIKEN全長(zhǎng)富集的(enriched)文庫(kù)，克隆A330075J02產(chǎn)物G-蛋白-偶聯(lián)的受體GPR54(G蛋白COUPLED受體54)，整個(gè)(full)插入序列；NT039496小家鼠染色體10基因組片段組，品系(strain)C57BL/6J；AY029541人推定的G蛋白-偶聯(lián)的受體mRNA，完整(complete)cds；AF343726小家鼠G-蛋白偶聯(lián)的受體GPR54(Gpr54)mRNA，完整cds；AF343725人G蛋白-偶聯(lián)的受體GPR54(GPR54)mRNA，完整cds；BE506644db65fO8.yl Wellcome CRC pSK卵光滑爪蟾(Xenopus laevis)cDNA克隆IMAGE3377895 5′類似于TRQ9ZOT7 Q9ZOT7 ORPHAN G蛋白-偶聯(lián)的受體GPR54.；，MRNA序列；BB261471 BB261471 RIKEN全長(zhǎng)富集的，7日齡新生鼠小腦小家鼠cDNA克隆A730098N23 3′類似于AF115516大家鼠孤兒(orphan)G蛋白-偶聯(lián)的受體GPR54(GPR54)mRNA，MRNA序列；AF115516大家鼠孤兒G蛋白-偶聯(lián)的受體GPR54(GPR54)mRNA，完整cdsGPR54多肽本文術(shù)語(yǔ)″多肽″指任何包含相互通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵即肽同配體(isostere)相連的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何肽或蛋白。″多肽″指短鏈(通常稱為肽，寡肽或寡聚物)和長(zhǎng)鏈(通常稱為蛋白)。多肽可包含20種基因所編碼的氨基酸以外的氨基酸。
“多肽″包括通過(guò)天然過(guò)程(諸如翻譯后加工等)和本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這種修飾在教科書中描述并在專論以及大量研究文獻(xiàn)中更具體地描述。修飾可出現(xiàn)在多肽任何部位，包括肽主鏈，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端?？衫斫饨o定多肽的數(shù)個(gè)位點(diǎn)的同類型修飾可相同或有不同程度變化。同樣，給定多肽可包含許多類型的修飾。
由于泛化(ubiqitination)多肽可為分支的或有或無(wú)分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支的、和分支的環(huán)狀多肽可以是轉(zhuǎn)錄后天然加工的結(jié)果或可通過(guò)合成方法制備。修飾包括乙酰化，?；珹DP-核糖基化，酰胺化，與黃素共價(jià)結(jié)合(convalent attachement of flavin)，與血紅素部分共價(jià)結(jié)合，與核苷酸或核苷酸衍生物共價(jià)結(jié)合，與脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價(jià)結(jié)合，與磷脂酰肌醇共價(jià)結(jié)合，交聯(lián)化(cross-inkings)，環(huán)化(clyclization)，二硫鍵形成，去甲基化，共價(jià)交聯(lián)形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸鹽/酯(pyroglutamate)形成，甲?；?，γ-羧化，糖基化，GPI錨(anchor)形成，羥化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊烯化(prenylation)，外消旋化(racemization)，硒酰化(selenoylation)，硫化，轉(zhuǎn)運(yùn)-RNA介導(dǎo)的氨基酸添加到蛋白，諸如精氨酸化(arginylation)和泛化(ubiquitination)。見例如，Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993 and Wold，F(xiàn).，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12 inPosttranslational Covalent Modificationof Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter等，″Analysis for Protein modifications and nonProtein cofactors″，Meth Enzymol(1990)182626-646 and Rattan等，″Protein SynthesisPosttranslationalModifications and Aging″，AnnNYAcad Sci(1992)66348-62本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“變體”，“同源物”，“衍生物”或“片段”包括從或?qū)π蛄械娜魏翁鎿Q，變異，修飾，取代，缺失或添加一(或多個(gè))氨基酸。除非具體說(shuō)明，“GPR54”包括GPR54的所述變體，同源物，衍生物和片段。
諸如GPR54的受體的“受體活性”或“生物活性”指GPR54受體的代謝或生理功能，包括類似活性或改進(jìn)的活性或與降低不良副作用有關(guān)的那些活性。還包括GPR54受體的抗原性和免疫原活性。GPCR活性的實(shí)例，測(cè)定并定量所述活性的方法是本領(lǐng)域已知的，并描述的本文其它部分。
本文的“缺失”指核苷酸或氨基酸序列改變，其中一或多個(gè)核苷酸氨基酸分別缺失。本文術(shù)語(yǔ)“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列改變，其分別導(dǎo)致與天然物質(zhì)相比一或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的添加。本文的“替換”是不同核苷酸或氨基酸分別取代一或多種核苷酸或氨基酸的結(jié)果。
本發(fā)明的GPR54多肽可具有氨基酸缺失，插入或取代，其導(dǎo)致沉默型(silent)改變并產(chǎn)生功能對(duì)等的氨基酸序列。基于所述殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性.親水性和/或兩親性的相似性可進(jìn)行有目的的氨基酸取代。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；疏水性值相似的、具有不帶電極性頭基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
GPR54核苷酸和多核苷酸“多核苷酸”通常指任何聚多核糖核苷酸或聚多脫氧核糖核苷酸，其可為未修飾或修飾的RNA和/或DNA?！岸嗪塑账帷卑?，但不限于單-和雙鏈DNA、單-和雙鏈區(qū)的混合物DNA，單-和雙鏈的RNA，單-和雙鏈區(qū)的混合物RNA，雜合分子包括單鏈或雙鏈DNA和RNA，或更常見為雙鏈的或單-和雙鏈區(qū)混合物。此外，“多核苷酸”指三鏈區(qū)，包括RNA和/或DNA。術(shù)語(yǔ)多核苷酸還包括含有一或多個(gè)修飾的基團(tuán)的DNA或RNA，以及具有為穩(wěn)定性或其它原因而進(jìn)行修飾的主鏈的DNA或RNA?！靶揎椀摹被鶊F(tuán)包括，例如三苯甲基化的基團(tuán)和不常見的基團(tuán)諸如肌苷。已對(duì)DNA和RNA進(jìn)行多種修飾，因此“多核苷酸”包括通常見于天然環(huán)境的多核苷酸的化學(xué)、酶或代謝修飾的形式，以及病毒和細(xì)胞的DNA和RNA的化學(xué)修飾形式?！岸嗪塑账帷边€包括相對(duì)較短的多核苷酸，通常稱為寡核苷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性多種核苷酸序列可編碼相同的多肽。
本文所述“核苷酸序列”指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多核苷酸序列及其變體，同源物，片段和衍生物(諸如其一部分)。所述核苷酸序列可為基因組或合成或重組來(lái)源的雙鏈或單鏈DNA或RNA，代表有義鏈或反義鏈或其組合。術(shù)語(yǔ)核苷酸序列可通過(guò)利用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備。
優(yōu)選，術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”指DNA。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“變體”，“同源物”，“衍生物”或“片段”包括從或?qū)PR54核苷酸序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加一(或多個(gè))氨基酸。除非具體說(shuō)明，“GPR54”包括GPR54的所述變體，同源物，衍生物和片段。
GPR54的表達(dá)分析為設(shè)計(jì)用于治療GPR54相關(guān)疾病的治療劑，可測(cè)定GPR54(野生型或具體突變體)的表達(dá)圖譜。因此本領(lǐng)域已知的方法可用于測(cè)定器官，組織和細(xì)胞類型(以及發(fā)育階段)，其中有GPR54表達(dá)?？蛇M(jìn)行例如傳統(tǒng)或“電”Northern。反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)也可用于測(cè)定GPR54基因或突變體的表達(dá)。測(cè)定GPR54表達(dá)圖譜的更敏感的方法包括RNAse保護(hù)實(shí)驗(yàn)(protectionassay)，這是本領(lǐng)域已知的。
Northern分析是實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，可用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄物的存在，并涉及標(biāo)記的核苷酸序列與膜的雜交，其中來(lái)自具體細(xì)胞類型或組織的RNA固定在所述膜上。(Sambrook，supra，ch.7 and Ausubel，F(xiàn).M.等supra，ch.4 and 16.)類似的計(jì)算機(jī)技術(shù)(″電Northern″)利用BLAST，用于搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank或LIFESEQ數(shù)據(jù)庫(kù)(Incyte Pharmaceuticals)中的相同或相關(guān)分子。這種分析類型的優(yōu)勢(shì)在于它們比多重膜雜交(multiple memebrane-basedhybridization)更快。此外，無(wú)論任何具體配對(duì)被分類為精確的(exact)或同源的(homologous)，所述計(jì)算機(jī)搜索的敏感性可修飾。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽，包括上述探針，可用作研究試劑和材料以發(fā)現(xiàn)治療和診斷動(dòng)物和人類的疾病，本文以下部分將詳述。
GPR54多肽的表達(dá)GPR54多肽的表達(dá)是產(chǎn)生GPR54抗體所需的，所述抗體的功能為本文所述GPR54的激動(dòng)劑或拮抗劑。
為表達(dá)生物活性GPR54多肽，編碼GPR54或其同源物、變體或衍生物的核苷酸序列被插入適宜的表達(dá)載體，即含有用于轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的編碼序列所需元件的載體。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法構(gòu)建表達(dá)載體，所述載體含有編碼GPR54的序列和適宜轉(zhuǎn)錄及翻譯控制元件。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)以及體內(nèi)基因重組。所述技術(shù)描述于Sambrook，J.等(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ch.4，8，and 16-17，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)and Ausubel，F(xiàn).M.等(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)。
多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)可用于包含并表達(dá)編碼GPR54的序列。這些包括，但不限于諸如用重組噬菌體，質(zhì)粒，粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體(諸如桿狀病毒)轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體(例如花椰菜嵌合病毒(cauliflower mosaicvirus)(CaMV)或煙草嵌合病毒(TMV))或病毒表達(dá)載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。本發(fā)明不限于所用宿主細(xì)胞。
“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)(例如增強(qiáng)子，啟動(dòng)子以及5′和3′未翻譯區(qū))，其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以便進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。所述元件的強(qiáng)度(strength)和特異性不同。根據(jù)所用載體系統(tǒng)和宿主，可使用任何數(shù)目的適宜轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括連續(xù)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如BLUESCRIPT噬菌粒(phagemid)(Stratagene，La Jolla，Calif.)，或者PSP或T1質(zhì)粒(GIBCO/BRL)的雜合lacZ啟動(dòng)子等。桿狀病毒多角體蛋白(polyhedrin)啟動(dòng)子可用于昆蟲細(xì)胞。來(lái)自植物細(xì)胞基因組(例如，熱休克(heat shock)，RUBISCO和儲(chǔ)存蛋白基因(storage protein gene))或來(lái)自植物病毒(例如，病毒啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可克隆入所述載體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，來(lái)自哺乳動(dòng)物基因或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子是優(yōu)選的。如果需要產(chǎn)生含有多個(gè)拷貝GPR54多肽編碼序列的細(xì)胞系，基于SV40或EBV的載體可與適宜的選擇標(biāo)記一起使用。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，許多表達(dá)載體可根據(jù)GPR54多肽的使用意圖選擇。例如，當(dāng)需要大量GPR54多肽誘導(dǎo)抗體時(shí)，可使用指導(dǎo)易純化融合蛋白高水平表達(dá)的載體。所述載體包括，但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，諸如BLUESCRIPT(Stratagene)(其中編碼GPR54多肽的序列可與所述載體中編碼氨基末端Met以及隨后的β-半乳糖苷酶7個(gè)殘基的序列在框內(nèi)相連，從而產(chǎn)生雜合蛋白)，pIN載體(Van Heeke，G.and S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等諸如此類。pGEX載體(Prω，Madison，Wis.)也可用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)將外來(lái)蛋白表達(dá)為融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶的，并可容易地通過(guò)吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠、然后在游離谷胱甘肽存在下進(jìn)行洗脫而自溶解的細(xì)胞純化。在所述系統(tǒng)中制備的蛋白可設(shè)計(jì)為包括肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶切割位點(diǎn)，使得感興趣的克隆的多肽可任意從GST部分釋放出來(lái)。
在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用許多含有連續(xù)或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體諸如α因子，醇氧化酶和PGH。綜述參見Ausubel(supra)andGrant等(1987；Methods Enzymol.153516-544)。
如果使用植物表達(dá)載體，編碼GPR54多肽的序列的表達(dá)可通過(guò)多種啟動(dòng)子之一驅(qū)動(dòng)。例如，病毒啟動(dòng)子諸如CaMV的35S和19S啟動(dòng)子可單獨(dú)或與TMV的ω前導(dǎo)序列聯(lián)合使用。(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6307-311.)可選，可使用植物啟動(dòng)子諸如RUBISCO小亞基或熱休克啟動(dòng)子。(Coruzzi，G.等(1984)EMBO J.31671-1680；Broglie，R.等(1984)Science 224838-843；Winter，J.等(1991)Results Probl.Cell Differ. 1785-105.)這些構(gòu)建體可通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)入植物細(xì)胞。所述技術(shù)在許多通?？傻玫木C述中描述。(見，例如，Hobbs，S.or Murry，L.E.in McGraw HillYearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196.)昆蟲系統(tǒng)可用于表達(dá)GPR54多肽。例如，在一種這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa caiifornica nuclear polyhedrosisvirus)(AcNPV)用作在Spodopterafrugiperda細(xì)胞或夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達(dá)外來(lái)基因的載體。編碼GPR54的序列可克隆入該病毒的非必要區(qū)諸如多角體蛋白基因等，并且處于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下。將GPR54多肽成功插入將使得多角體蛋白基因失活并產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。所述重組病毒可用于感染例如，S.fiugEperda細(xì)胞或夜蛾幼蟲(GPR54多肽可z在其中表達(dá))。(Engelhard，E.K.等(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.913224-3227.)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)可利用。如果用腺病毒作為表達(dá)載體，編碼GPR54多肽的序列可連入腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物，所述復(fù)合物由晚期啟動(dòng)子和三分(tripartite)前導(dǎo)序列組成。插入病毒基因組的非必要E1或E3區(qū)可用于獲得有活力的病毒，所述病毒能夠在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)GPR54多肽。(Logan，J.and T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659.)此外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子諸如勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子可用于增加在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
人的人工染色體(HAC)也可用于遞送大于可在質(zhì)粒中包含并表達(dá)的DNA片段的DNA片段。構(gòu)建并通過(guò)常規(guī)遞送方法遞送(脂質(zhì)體，多陽(yáng)離子氨基聚合物或囊泡)約6kb-10Mb的HAC用于治療。
具體的起始信號(hào)也可更有效翻譯編碼GPR54多肽的序列。這種信號(hào)包括ATG起始密碼子以及鄰近的序列。如果編碼GPR54多肽的序列及其起始密碼子和上游序列被插入適宜的表達(dá)載體，無(wú)需其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，如果僅插入編碼序列或其一部分，應(yīng)提供包含ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號(hào)。此外，起始密碼子應(yīng)在正確的閱讀框中以保證整個(gè)插入序列得以翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可為各種來(lái)源的，天然和合成的。表達(dá)的效率可通過(guò)將適合所用具體細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來(lái)得以提高，所述增強(qiáng)子如文獻(xiàn)所述。(Scharf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20125-162.)。
此外，宿主細(xì)胞菌株可根據(jù)其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)以及按照所需方式加工所表達(dá)蛋白的能力來(lái)選擇。多肽的這種修飾包括，但不限于，乙?；?，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和?；Ｇ懈畹鞍椎摹扒霸?prepro)”形式的翻譯后加工可用于促進(jìn)正確的插入，折疊和/或功能。為翻譯后活性具有特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)(machinery)和特征機(jī)制(mechanism)的不同宿主細(xì)胞(例如CHO，HeLa，MDCK，HEK293和WI38)可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Bethesda，Md.)，并可被選擇以保證所述外來(lái)蛋白的正確修飾及加工。
為長(zhǎng)期高產(chǎn)重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，能穩(wěn)定表達(dá)GPR54 GPCR的細(xì)胞系可利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體可包含位于相同或分離載體上的病毒復(fù)制起點(diǎn)和/或外源表達(dá)元件以及選擇標(biāo)記。導(dǎo)入所述載體后，細(xì)胞可在富集的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)約1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。選擇標(biāo)記的目的是賦予選擇抗性，且其存在允許表達(dá)被導(dǎo)入序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性克隆可利用適合所述細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行增殖。
可利用任何數(shù)量的選擇系統(tǒng)來(lái)回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。所述系統(tǒng)包括但不限于，單純皰疹病毒(herpes simplex virus)胸苷激酶基因(Wigler，M.等(1977)Cell 11223-32)以及腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy，I.等(1980)Cell22817-23)，所述系統(tǒng)分別可用于tk-或apr-細(xì)胞。此外，抗代謝物，抗生素或除莠劑抗性可用作選擇基礎(chǔ)。例如，dhfr賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性(Wigler，M.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予對(duì)氨基糖苷新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F(xiàn).等(1981)J.Mol.Biol.1501-14)；als或pat分別賦予對(duì)氯磺隆(chlorsulfuron)和草丁膦(phosphinotricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性(Murry，見上文)。其它適宜基因也有描述，例如trpB(其允許細(xì)胞利用吲哚取代色氨酸)或hisD(其允許細(xì)胞利用組氨醇(histinol)取代組氨酸)(Hartman，S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51.)最近，可利用諸如花青素(anthocyanin)，p-葡糖醛酸酶及其底物GUS，以及螢光素酶及其底物熒光素作為可見標(biāo)記(visible marker)。這些標(biāo)記不僅可用于鑒定轉(zhuǎn)化體，也可用于定量具體載體系統(tǒng)的瞬時(shí)或穩(wěn)定蛋白表達(dá)量。(Rhodes，C.A.等(1995)Methods Mol.Biol.55121-131.)盡管標(biāo)記基因表達(dá)的存在/缺失提示目的基因也存在，所述基因的存在和表達(dá)需要證實(shí)。例如，如果編碼GPR54多肽的序列被被插入標(biāo)記基因序列，含GPR54多肽編碼序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可通過(guò)標(biāo)記基因功能的缺失鑒定?？蛇x，標(biāo)記基因可與GPR54多肽編碼序列串聯(lián)地位于單個(gè)啟動(dòng)子控制下。標(biāo)記基因?qū)φT導(dǎo)或選擇反應(yīng)而表達(dá)通常表明所述串聯(lián)的基因也表達(dá)。
可選，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法鑒定含有GPR54多肽編碼核酸序列并表達(dá)GPR54的宿主細(xì)胞。這些方法包括，但不限于DNA--DNA或DNA-RNA雜交以及蛋白生物分析(protein bioassay)和免疫分析(immunoassay)技術(shù)，包括基于膜，溶液或芯片的技術(shù)來(lái)檢測(cè)和/或定量核酸或蛋白序列。
編碼GPR54多肽的多核苷酸序列的存在可利用探針或片段或編碼GPR54 GPCR的多核苷酸片段通過(guò)DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)?；诤怂釘U(kuò)增的實(shí)驗(yàn)包括利用基于GPR54多肽編碼序列的寡核苷酸或寡聚物來(lái)檢測(cè)含有編碼GPR54的DNA或RNA的轉(zhuǎn)化體。
多種利用對(duì)所述蛋白特異多克隆或單克隆抗體來(lái)檢測(cè)和測(cè)定GPR54表達(dá)的方案是本領(lǐng)域已知的。所述技術(shù)的實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，放射免疫實(shí)驗(yàn)(RIA)和熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)。優(yōu)選兩位點(diǎn)、基于單克隆的免疫實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)利用對(duì)GPR54上的兩種非干擾性(non-interfering)表位有反應(yīng)的單克隆抗體，但可采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。這些和其它實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的，例如見Hampton，R.等(1990；Serological Methods，a Laboratory Manual，Section IV，APS Press，StPaul，Minn.)and in Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)。
多種標(biāo)記和結(jié)合技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并用于多種核酸和氨基酸實(shí)驗(yàn)。制備標(biāo)記的雜交或PCR探針用于檢測(cè)與GPR54的編碼多核苷酸相關(guān)序列的方法包括利用標(biāo)記的多核苷酸進(jìn)行oligolabeling，缺口翻譯(nicktranslation)，末端標(biāo)記(end-labeling)，或PCR擴(kuò)增?？蛇x，編碼GPR54的序列或其片段可克隆入載體以制備mRNA探針。所述載體是本領(lǐng)域已知、可購(gòu)得并可用于通過(guò)加入適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶諸如T7，T3或SP6等以及標(biāo)記的核苷酸在體外合成RNA探針。這些方法可利用多種可購(gòu)得的試劑盒進(jìn)行，例如Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo，Mich.)，Promega(Madison，Wis.)，和U.S.Biochemical Corp(Cleveland，Ohio)提供的那些。適宜的報(bào)道分子或標(biāo)記可用于簡(jiǎn)化檢測(cè)，其包括放射性核素(radionuclide)，酶，熒光，化學(xué)發(fā)光或生色制劑，以及底物，輔因子，抑制物，磁性顆粒等諸如此類。
由編碼GPR54的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在適宜表達(dá)和從細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述蛋白的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可位于細(xì)胞膜，根據(jù)所用序列和/或載體分泌或包含在細(xì)胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，含有編碼GPR54的多核苷酸的表達(dá)載體可設(shè)計(jì)為包含信號(hào)序列，所述信號(hào)序列指導(dǎo)GPR54分泌通過(guò)原核或真核細(xì)胞膜。其它構(gòu)建體可用于連接GPR54編碼序列與編碼促進(jìn)可溶蛋白回收的多肽區(qū)的核苷酸序列。所述純化促進(jìn)區(qū)(purification facilitating domain)包括，但不限于，金屬螯合肽諸如允許在固定的金屬上進(jìn)行純化的組氨酸-色氨酸組件(module)，以及允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A區(qū)，以及FLAGS延伸/親合純化系統(tǒng)(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)中所用的區(qū)。在純化區(qū)和GPR54 GPCR編碼序列之間包含可切割的接頭序列，諸如對(duì)因子XA或腸激酶特異性的接頭(Invitrogen，San Diego，Calif.)，可用于促進(jìn)純化。一種這樣的載體使得融合蛋白得以表達(dá)，所述融合蛋白含有GPR54和編碼6組氨酸殘基然后是硫氧還蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)。所述組氨酸殘基可促進(jìn)在固定的金屬離子親和層析上的純化(IMIAC；described in Porath，J.等(1992)Prot.Exp.Purif.3263-281)，而腸激酶切割位點(diǎn)提供從所述融合蛋白純化GPR54的方法。含有融合蛋白的載體的描述見Kroll，D.J.等(1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
GPR54的片段不僅可通過(guò)重組制備產(chǎn)生，也可通過(guò)利用固相技術(shù)的直接肽合成產(chǎn)生(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154.)蛋白合成可通過(guò)人工或自動(dòng)化技術(shù)進(jìn)行。自動(dòng)化的合成可通過(guò)例如使用AppliedBio系統(tǒng)431A肽合成儀(Perkin Elmer)進(jìn)行。GPR54的各種片段可單獨(dú)合成然后組合在一起產(chǎn)生全長(zhǎng)分子。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物敲除本發(fā)明另一方面提供GPR54敲除哺乳動(dòng)物，其包含一或多種細(xì)胞，其中的GPR54多肽是功能失活的。
本發(fā)明的GPR54敲除可為GPR54基因或該基因任何一部分的功能破壞的結(jié)果，包括使GPR54基因喪失一或多種功能的突變，包括缺失或取代。所述突變體包括單點(diǎn)突變，并靶向GPR54的編碼或非編碼區(qū)。
優(yōu)選，所述敲除動(dòng)物是非人哺乳動(dòng)物，諸如豬，綿羊或嚙齒動(dòng)物。最優(yōu)選所述敲除動(dòng)物是小鼠或大鼠。所述敲除動(dòng)物可用于篩選方法中以鑒定GPR54的激動(dòng)劑和/或拮抗劑，以及檢測(cè)其在體內(nèi)治療疾病的效力。
例如，經(jīng)改造GPR54生成缺陷的敲除動(dòng)物可用于實(shí)驗(yàn)以鑒定GPR54的激動(dòng)劑和/或拮抗劑。一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為評(píng)估可能的藥物(候選配體或化合物)以測(cè)定其在缺乏GPR54受體時(shí)是否產(chǎn)生生理反應(yīng)。這可通過(guò)將藥物給予上述敲除動(dòng)物，并檢測(cè)所述動(dòng)物的特定反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。任何生理參數(shù)可在該實(shí)驗(yàn)中測(cè)定。
來(lái)自GPR54敲除動(dòng)物的組織可用于受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)以測(cè)定所述可能的藥物(候選配體或化合物)是否與GPR54受體結(jié)合。所述實(shí)驗(yàn)可通過(guò)從經(jīng)改造GPR54生成缺陷的敲除動(dòng)物獲得第一受體制備物，并從已知與任何鑒定的GPR54配體或化合物結(jié)合的來(lái)源獲得第二受體來(lái)進(jìn)行。通常，所述第一和第二受體制備物在除獲得它們的來(lái)源以外的所有方面都相似。例如，如果敲除動(dòng)物(如上文和下文所述)的腦組織用于實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自正常(野生型)動(dòng)物的可比(comparable)腦組織可用作第二受體制備物的來(lái)源。每種受體制備物都與已知與GPR54受體結(jié)合的配體一起、在存在或不存在候選配體或化合物的條件下進(jìn)行保溫。優(yōu)選所述候選配體或化合物可在不同濃度檢測(cè)。
測(cè)定第一和第二受體制備物與已知配體的結(jié)合被檢驗(yàn)化合物取代的程度。來(lái)自敲除動(dòng)物的組織可直接用于實(shí)驗(yàn)，或所述組織可經(jīng)過(guò)加工成為分離的膜或膜蛋白(其本身可用于實(shí)驗(yàn))。優(yōu)選的敲除動(dòng)物是小鼠。配體可用任何與結(jié)合實(shí)驗(yàn)相容的方法標(biāo)記。這可包括，但不限于，放射活性，酶，熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(以及下文所述其它標(biāo)記技術(shù))。
此外，GPR54受體的拮抗劑可通過(guò)將候選化合物等給藥表達(dá)功能性GPR54的野生型動(dòng)物，以及鑒定為顯示任何與GPR54受體功能表達(dá)的降低或消除相關(guān)的表型特征的動(dòng)物來(lái)鑒定。
產(chǎn)生非人敲除動(dòng)物的詳細(xì)方法在下文描述。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可導(dǎo)入動(dòng)物的種系以產(chǎn)生敲除哺乳動(dòng)物。例如，一或數(shù)個(gè)拷貝的構(gòu)建體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)摻入哺乳動(dòng)物胚胎基因組中。
一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明敲除非人動(dòng)物通過(guò)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的種系制備。各個(gè)發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞可用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段利用不同方法。用于實(shí)踐本發(fā)明的任何動(dòng)物的具體的系(line)可根據(jù)總體健康良好，胚胎產(chǎn)量良好，胚胎中原核可見性良好以及生殖健康狀況良好來(lái)選擇。此外，單倍體是明顯的因素。
將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛タ赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，諸如微量注射(microinjection)，電穿孔，或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。例如，GPR54受體轉(zhuǎn)基因可通過(guò)將所述構(gòu)建體微量注入受精的哺乳動(dòng)物卵的原核中，從而使一或多個(gè)拷貝的構(gòu)建體保持在發(fā)育動(dòng)物的細(xì)胞中。將所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入受精卵中以后，所述卵可在體外保溫不同時(shí)間，和/或再植入代理宿主(surrogate host)。體外保溫到成熟是本領(lǐng)域已知的。一種常用方法是將胚胎在體外保溫約1-7天(根據(jù)種類而不同)，然后將所述胚胎再植入代理宿主。
可通過(guò)對(duì)組織部分進(jìn)行Southern印跡分析，來(lái)檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)基因操作的胚胎的后代中的所述構(gòu)建體的存在。如果一或多個(gè)拷貝的外源克隆的構(gòu)建體保持穩(wěn)定整合在所述敲除胚胎的基因組中，可建立攜帶以轉(zhuǎn)基因方式加入的構(gòu)建體的永久性敲除哺乳動(dòng)物系。
敲除改變哺乳動(dòng)物的同窩幼仔出生后，可測(cè)定所述構(gòu)建體摻入所述后代基因組中的情況。優(yōu)選，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)將對(duì)應(yīng)編碼所需重組蛋白產(chǎn)物或其片段的DNA序列的探針與所述后代的染色體物質(zhì)進(jìn)行雜交來(lái)進(jìn)行。使基因組中含有至少一個(gè)拷貝的構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物后代成長(zhǎng)到成熟。
為本發(fā)明的目的，合子(zygote)基本上是形成的二倍體細(xì)胞，其能發(fā)育成完整生物體。通常，所述合子包含有核的卵，所述核可通過(guò)將來(lái)自相同或不同配子的兩個(gè)單倍體核融合而天然或人工形成。因此，所述配子的核一定是天然相容的，即其產(chǎn)生能經(jīng)過(guò)分化并發(fā)育成有功能的生物體的可存活合子。通常，優(yōu)選整倍體合子。如果獲得非整倍體合子，根據(jù)配子所來(lái)源生物體的整倍體數(shù)目，染色體數(shù)目變化不能超過(guò)一個(gè)。
此外，類似的生物考慮，物理因素也影響(govern)外源遺傳物質(zhì)的量(體積)，所述外源遺傳物質(zhì)可加入該合子的核或形成該合子核的一部分的遺傳物質(zhì)。如果沒有遺傳物質(zhì)被去除，可加入的外源遺傳物質(zhì)量受到可被吸收而不會(huì)被物理因素破壞的量的限制。通常外源遺傳物質(zhì)日不超過(guò)約10皮升(picoliter)。加入的物理影響不能大到物理破壞所述合子的存活力。DNA序列的數(shù)目核多樣性的生物限制可根據(jù)具體的合子以及外源遺傳物質(zhì)的功能而變化，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，這是由于所得合子的遺傳物質(zhì)(包括所述外源性遺傳物質(zhì))必須在生物學(xué)上能夠起始并保持所述合子分化并發(fā)育成有功能的生物體。
加入合子的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體拷貝數(shù)目有賴于加入的外源遺傳物質(zhì)總量，并且將是能夠使遺傳轉(zhuǎn)化成為可能的量。理論上，僅需一個(gè)拷貝；然而通常利用多個(gè)拷貝，例如，1,000-20,000拷貝的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，以保證一個(gè)拷貝有功能。對(duì)于本發(fā)明，每個(gè)插入的外源DNA序列有一個(gè)以上功能型拷貝以改善外源DNA序列的表型表達(dá)通常是有利的。
任何允許將外源遺傳物質(zhì)加入到細(xì)胞核遺傳物質(zhì)中的技術(shù)均可用，只要其不破壞細(xì)胞、核膜或已有的細(xì)胞或遺傳結(jié)構(gòu)。外源遺傳物質(zhì)優(yōu)選通過(guò)微量注射進(jìn)入核酸遺傳物質(zhì)。細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯微注射是本領(lǐng)域已知的。
再植入通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)。通常，對(duì)代理宿主進(jìn)行麻醉，并將胚胎插入其輸卵管。植入具體宿主的胚胎數(shù)目根據(jù)種類而不同，但通常與該宿主自然產(chǎn)生的后代數(shù)相似。
可通過(guò)任何適宜方法篩選代理宿主的敲除后代中轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達(dá)。篩選通常利用與至少部分轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)的探針、通過(guò)Southern印跡或Northern印跡分析來(lái)進(jìn)行。利用轉(zhuǎn)基因所編碼蛋白的抗體進(jìn)行的Western印跡分析可用作篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物存在的可選或其它方法。通常DNA自尾組織制備，并通過(guò)Southern分析或PCR分析所述轉(zhuǎn)基因?？蛇x，利用Southern分析或PCR檢測(cè)據(jù)信表達(dá)高水平轉(zhuǎn)基因的組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的存在和表達(dá)，但任何組織或細(xì)胞類型均可用于該分析。
評(píng)估轉(zhuǎn)基因存在的可選或其它方法包括，但不限于適宜的生化實(shí)驗(yàn)，如酶和/或免疫實(shí)驗(yàn)，具體標(biāo)記物或酶活性的組織染色，流式細(xì)胞分析等。血液分析也可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在血液中的存在，以及評(píng)價(jià)所述轉(zhuǎn)基因?qū)Ω鞣N類型血細(xì)胞和其它血液成分的水平的影響。
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染也可用于將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物。正在發(fā)育的非人胚胎也可在體外培養(yǎng)到胚泡(blastocyst)階段。該過(guò)程中，分裂球是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。分裂球的有效感染通過(guò)酶處理去除透明帶(zona pellucida)實(shí)現(xiàn)(Manipulating the mice Embryo，Hoganeds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄載體系統(tǒng)通常為攜帶該轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner等(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten等(1985)PNAS 826148-6152)。轉(zhuǎn)染通過(guò)在單層產(chǎn)病毒細(xì)胞(virus-producing cell)上培養(yǎng)分裂球容易且有效地實(shí)現(xiàn)(Van der Putten，supra；Stewart等(1987)EMBO J.6383-388)?？蛇x，感染可在以后的階段進(jìn)行。病毒或產(chǎn)病毒細(xì)胞可注入囊胚腔(blastocoele)(Jahner等(1982)Nature 298623-628)。大多數(shù)建立者(founder)對(duì)轉(zhuǎn)基因而言是嵌合的，這是由于摻入(incorporation)僅在部分形成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞中出現(xiàn)。此外，建立者基因組中的不同位置可含有轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入物，其通常在后代分離。此外，還可對(duì)孕期中的胚胎(midgestation embryo)進(jìn)行子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，來(lái)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕N系(Jahner等(1982)，見上文)。
轉(zhuǎn)基因?qū)氲牡谌N類型的靶細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(ES)。ES細(xì)胞自植入前體外培養(yǎng)的胚胎獲得，并與胚胎融合(Evans等(1981)Nature 292154-156；Bradley等(1984)Nature 309255-258；Gossler等(1986)PNAS 839065-9069；Robertson等(1986)Nature 322445-448)。轉(zhuǎn)基因可有效通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入ES細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞隨后可與來(lái)自非人動(dòng)物的胚泡結(jié)合(combine)。所述ES細(xì)胞隨后在胚胎建群并有成為產(chǎn)生嵌合動(dòng)物的種系。參見Jaenisch，R.(1988)Science 2401468-1474.
本發(fā)明還涉及用于功能破壞宿主細(xì)胞的GPR54基因的核酸構(gòu)建體。該核酸構(gòu)建體包括(a)非-同源置換部分(non-homologous replacement portion)；(b)位于所述非-同源置換部分上游的第一同源區(qū)；所述第一同源區(qū)具有與第一GPR54基因序列基本相同的核苷酸序列；和(c)位于所述非-同源置部分下游的第二同源區(qū)，所述第二同源區(qū)具有與第二GPR54基因序列基本相同的核苷酸序列，所述第二GPR54基因位于天然存在的內(nèi)源GPR54基因中所述第一GPR54基因序列的下游。此外，當(dāng)所述核酸分子被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，第一和第二同源區(qū)應(yīng)足夠長(zhǎng)，以進(jìn)行核酸構(gòu)建體與宿主細(xì)胞中的內(nèi)源GPR54基因進(jìn)行同源重組。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述非-同源置換部分包含表達(dá)報(bào)道物，優(yōu)選包括lacZ和陽(yáng)性選擇表達(dá)盒，優(yōu)選包含可操作連接于調(diào)節(jié)元件的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
GPR54 GPCR缺陷的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可如下產(chǎn)生(a)構(gòu)建體GPR54基因靶向型載體(targeting vector)鼠GPR54基因組克隆分離自利用探針序列獲自HGMP(Hinxton，UK)的小鼠大插入子(mouse large insert)PAC文庫(kù)，所述文庫(kù)為利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)自部分預(yù)測(cè)的鼠可讀框cDNA序列(SEQ ID NO4)擴(kuò)增的。分離的鼠GPR54基因組克隆隨后利用小寡核苷酸探針和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)限制酶切作圖(restriction mapped)在GPR54基因的區(qū)域中。
對(duì)鼠基因組基因座進(jìn)行部分測(cè)序，以使得可設(shè)計(jì)用于克隆入靶向型載體中的同源臂。通常為1-5kb的DNA的兩個(gè)區(qū)(從將被缺失的可讀框區(qū)域的任何一側(cè)起)稱為5′和3′同源臂，其通過(guò)PCR擴(kuò)增且所述片段被克隆入靶向型載體。這些臂的位置選擇使得同源重組事件將通過(guò)缺失至少7個(gè)跨膜區(qū)而功能性破壞GPR54基因。靶向型載體被制備成其中缺失的GPR54序列被非-同源序列取代，所述非-同源序列包含選擇盒(selection cassette)上游的內(nèi)源基因表達(dá)報(bào)道物(不依賴框(frame independent)的lacZ基因)，其由啟動(dòng)的(promoted)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因組成，所述基因的方向與GPR54基因一樣。
(b)胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和分析胚胎干細(xì)胞(Evans and Kaufman，1981)在新霉素抗性胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基支持層(feeder layer)上培養(yǎng)、在Dulbecco′s改良的Eagles培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了20％胎牛血清，10％新生牛血清，2mM谷氨酰胺，非必需氨基酸，100μM 2-巰基乙醇和500u/ml白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor)。每天更換培養(yǎng)基，并每3天對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行傳代。5×106ES細(xì)胞用5μg線性化的質(zhì)粒通過(guò)電穿孔(25μF電容和400伏特)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。電穿孔24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含200μg/ml新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天。將克隆轉(zhuǎn)移至96孔板，復(fù)制并擴(kuò)增，然后通過(guò)PCR鑒定其中內(nèi)源GPR54基因與靶向型構(gòu)建體發(fā)生同源重組的克隆。陽(yáng)性克隆比例通常為1-5％。擴(kuò)增這些克隆，以便允許復(fù)制體被冷凍并且制備足夠高質(zhì)量的DNA用于通過(guò)Southern印跡利用外部5′和3′探針確定靶向事件(targeting event)，所述過(guò)程均使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Russ等，2000，Nature 2000Mar 2；404(6773)95-9)。
(c)GPR54缺陷小鼠的產(chǎn)生C57BL/6雌性和雄性小鼠進(jìn)行交配，并在懷孕3.5天時(shí)分離胚泡。每個(gè)胚泡中注入來(lái)自選定克隆的10-12個(gè)細(xì)胞，并將7-8胚泡植入假孕F1雌性小鼠子宮。
同窩嵌合幼鼠出生時(shí)含較高水平(達(dá)100％)的有花紋雄鼠(agoutimales)(花紋外皮顏色表明被靶向的克隆的后代細(xì)胞的作用)。雄性嵌合體與雌性和MF1以及129小鼠交配，分別通過(guò)花紋外皮顏色和PCR基因型分析確定種系傳遞(germline transmission)。
其它非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其導(dǎo)致GPR54受體過(guò)表達(dá)或所述受體低表達(dá)(與適宜對(duì)照相比)。
所述動(dòng)物可用于鑒定受體功能的激動(dòng)劑和拮抗劑(也可用于治療)。
抗體本文的抗體可用作GPR54多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑。
為本發(fā)明目的，除非特別說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)″抗體″包括但不限于，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，F(xiàn)ab片段和通過(guò)Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。所述片段包括完整抗體的片段(其保持與靶物質(zhì)結(jié)合的活性)，F(xiàn)v，F(xiàn)(ab′)和F(ab′)2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白以及包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的其它合成蛋白?？贵w及其片段可為人源化抗體，例如EP-A-239400所述。此外，可使用具有完整人可變區(qū)的抗體(或其片段)，例如美國(guó)專利5,545,807和6,075,181所述。中和抗體，即抑制所述物質(zhì)氨基酸序列的生物活性的抗體，具體優(yōu)選用于診斷和治療。
抗體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，諸如通過(guò)免疫(immunization)或利用噬菌體展示文庫(kù)。
本發(fā)明的多肽或肽可用于通過(guò)已知技術(shù)制備抗體。所述抗體可與GPR54蛋白或其同源物、片段等特異性結(jié)合。
如需要多克隆抗體，選定的哺乳動(dòng)物(例如，小鼠，兔，山羊，馬等)可用免疫原性組合物免疫，所述組合物包括本發(fā)明的多肽或肽。根據(jù)宿主種類可利用多種佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。所述佐劑包括，但不限于，F(xiàn)reund′s，礦物鹽凝膠諸如氫氧化鋁，以及表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂，聚醚多羥基化合物(pluronic polyol)，聚陰離子，肽，油乳液，匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpet hemocyanin)和二硝基酚。BCG(BacilliCalmette-Guerin)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)是可能有用的人佐劑，如果所述物質(zhì)氨基酸序列給藥免疫受損(compromised)的個(gè)體以刺激系統(tǒng)防御時(shí)可使用所述佐劑。
根據(jù)已知方法收集來(lái)自免疫的動(dòng)物的血清并進(jìn)行處理。如可獲自本發(fā)明多肽的、含有抗表位多克隆抗體的血清含有其它抗原的抗體，所述多克隆抗體可通過(guò)免疫親和層析純化。用于制備并加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。為制備所述抗體，本發(fā)明還提供本發(fā)明的氨基酸序列或其片段，其對(duì)用作動(dòng)物或人的免疫原的其它氨基酸序列是半抗原化的(haptenised)。
抗表位的單克隆抗體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易制備，所述表位可獲自本發(fā)明的多肽或肽。通過(guò)雜交瘤制備單克隆抗體的常用方法已知。不朽的(immortal)產(chǎn)抗體細(xì)胞系可通過(guò)細(xì)胞融合以及其它技術(shù)制備，所述其它技術(shù)諸如用致癌(oncogenic)DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用EB病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。可篩選針對(duì)眼眶(orbit)表位制備的所有單克隆抗體的各種性質(zhì)，諸如對(duì)于同種型和表位的親和力。
單克隆抗體可通過(guò)任何可通過(guò)連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)制備抗體分子的方法制備。這些技術(shù)包括，但不限于Koehler and Milstein(1975 Nature 256495-497)的雜交瘤技術(shù)，trioma技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等(1983)ImmunolToday 472；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 802026-2030)以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
此外，可使用為制備嵌合抗體發(fā)展的技術(shù)，如將小鼠抗體基因與人抗體基因進(jìn)行拼接以獲得具有適宜抗原特異性和生物活性的分子的技術(shù)(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312604-608；Takeda等(1985)Nature 314452-454)。可選，用于制備單鏈抗體(美國(guó)專利4,946,779)的技術(shù)可用于制備物質(zhì)特異性單鏈抗體。
針對(duì)獲自本發(fā)明多肽或肽的表位的單克隆和多克隆抗體尤其可用于診斷，且其中的中和型抗體可用在被動(dòng)免疫治療中。具體地單克隆抗體可用于激發(fā)抗-獨(dú)特型抗體。抗-獨(dú)特型抗體是攜帶物質(zhì)“內(nèi)部圖像(internalimage)”和/或需要防止其攻擊的試劑的免疫球蛋白。用于激發(fā)抗獨(dú)特型抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域已知。這些抗獨(dú)特型抗體也可用于治療。
抗體也可通過(guò)在淋巴細(xì)胞群誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生或通過(guò)篩選重組免疫球蛋白文庫(kù)或全部高特異性結(jié)合試劑來(lái)制備，如Orlandi等(1989，Proc Natl Acad Sci863833-3837)，and Winter G and Milstein C(1991；Nature 349293-299)所述。
也可產(chǎn)生含有多肽或肽的特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，所述片段包括，但不限于F(ab′)2片段(其可通過(guò)用胃蛋白酶消化抗體分子制備)，和Fab片段(其可通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫橋制備)。可選，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以允許快速容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(HuseWD等(1989)Science 2561275-1281)。
用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)可用于制備本發(fā)明多肽的單鏈抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物體包括其它哺乳動(dòng)物可用于表達(dá)人源化抗體。
因此，本發(fā)明人認(rèn)為GPR54抗體或包含它們的組合物尤其可用于治療神經(jīng)性，生殖激素相關(guān)的和一些其它疾病。所述神經(jīng)疾病包括但不限于以下一或多種疾病阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病或癲癇.
所述生殖激素相關(guān)的疾病包括下組的一或多種生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病或停經(jīng)。此外，GPR54激動(dòng)劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。
其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。
診斷實(shí)驗(yàn)本發(fā)明另一方面提供診斷選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖，所述方法包括以下步驟(a)從待診斷的患者中選出細(xì)胞樣品，(b)比較所述細(xì)胞樣品與來(lái)自健康個(gè)體的一或多個(gè)對(duì)照樣品的GPR54多肽表達(dá)水平和/或功能活性。
本發(fā)明還涉及GPR54多核苷酸，編碼GPR54肽配體的多核苷酸和多肽(以及其同源物，變體和衍生物)在診斷試劑和基因分析中的用途。與能夠和GPR54核酸(包括同源物，變體及衍生物)互補(bǔ)或能與其雜交的核酸，以及抗GPR54多肽以及GPR54配體多肽的抗體也可用于所述實(shí)驗(yàn)。
GPR54基因突變形式、metastin基因或與功能不良相關(guān)的其它天然配體基因的檢測(cè)可提供診斷工具，其可添加或限定疾病或疾病易感性的診斷，所述疾病是GPR54或其天然配體的表達(dá)過(guò)低，超量表達(dá)或表達(dá)改變的結(jié)果?？赏ㄟ^(guò)各種技術(shù)在DNA水平檢測(cè)攜帶GPR54基因(包括對(duì)照序列)中突變的個(gè)體。
例如，DNA可分離自患者并測(cè)定GPR54或metastin DNA多態(tài)性模式。所述鑒定的模式可與對(duì)照患者比較，已知所述對(duì)照患者患有與GPR54或metastin表達(dá)過(guò)低，超量表達(dá)或表達(dá)異常相關(guān)的疾病。表達(dá)與GPR54或metastin相關(guān)疾病的遺傳多態(tài)性的患者可由此鑒定。GPR54或metastin的基因分析可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知技術(shù)進(jìn)行。例如，個(gè)體可通過(guò)RFLP或SNP分析等測(cè)定GPR54或metastin等位基因的DNA序列來(lái)篩選。通過(guò)檢測(cè)GPR54或metastin的基因序列或控制其表達(dá)的任何序列中的DNA多態(tài)性存在，可將患者鑒定為具有患與GPR54或metastin表達(dá)過(guò)低，超量表達(dá)或表達(dá)異常相關(guān)的疾病的遺傳傾向。
可治療或預(yù)防如此鑒定的患者的GPR54或metastin相關(guān)疾病，或更進(jìn)一步在GPR54或metastin相關(guān)疾病的早期治療，以防止所述疾病的進(jìn)一步發(fā)展。GPR54或metastin相關(guān)疾病包括阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥。
優(yōu)選實(shí)施方案中，GPR54或metastin相關(guān)疾病包括阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。優(yōu)選，所述疾病涉及性類固醇激素軸(sex steroid hormonal axis)調(diào)節(jié)。
本發(fā)明還涉及試劑盒，其用于鑒定患者GPR54或metastin相關(guān)疾病的遺傳多態(tài)性模式。所述試劑盒包含DNA樣品收集裝置，以及測(cè)定遺傳多態(tài)性模式的裝置，其可與對(duì)照樣品比較來(lái)確定患者對(duì)GPR54或metastin相關(guān)疾病的易感性。診斷GPR54或metastin相關(guān)疾病的試劑盒包含GPR54或metastin多肽和/或所述多肽(或其片段)的抗體。
診斷用核酸可獲自受試者細(xì)胞，諸如來(lái)自血，尿，唾液組織活檢或尸檢的物質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA可獲自收集在吸收紙上的患者指血的血細(xì)胞。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述血液收集在AmpliCard.TM.(University of Sheffield，Department of Medicine and Pharmacology，RoyalHallamshire Hospital，Sheffield，EnglandS10 2JF)。
所述DNA可直接用于檢測(cè)或用PCR或其它擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增，然后進(jìn)行分析。可制備目的基因中靶向特異性多態(tài)性DNA區(qū)的寡核苷酸DNA引物，使得在PCR反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)靶序列的擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以相似方式用作模板。從模板DNA擴(kuò)增的DNA序列可利用限制酶分析，以確定擴(kuò)增的序列的遺傳多態(tài)性，并由此提供患者的遺傳多態(tài)性圖譜。限制片段長(zhǎng)度可通過(guò)凝膠分析確定?？煽蛇x或聯(lián)合地使用諸如SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析等技術(shù)。
缺失和插入可通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物與正常基因型相比而言的大小改變來(lái)檢測(cè)。點(diǎn)突變可通過(guò)使擴(kuò)增的DNA與標(biāo)記的GPR54或metasin核苷酸序列的雜交來(lái)鑒定。優(yōu)選匹配的序列可通過(guò)RNase消化或解鏈溫度差異來(lái)與未配對(duì)的雙鏈體區(qū)分。DNA序列差異也可通過(guò)DNA片段在凝膠(可包含或不包含變性劑)中電泳遷移率的改變，或通過(guò)直接DNA測(cè)序來(lái)檢測(cè)。見例如，Myers等，Science(1985)2301242。具體位置的序列改變也可通過(guò)核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(nuclease protection assay)諸如RNase和S1保護(hù)或化學(xué)切割法顯示。見Cotton等，Proc Natl Acad Sci USA(1985)854397-4401。另一實(shí)施方案中，可構(gòu)建包含GPR54或metastin核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針的陣列，以有效篩選例如基因突變。陣列技術(shù)法是已知并常用的，可用于說(shuō)明分子遺傳學(xué)中的多種問(wèn)題，包括基因表達(dá)，基因連接以及基因多樣性(見例如M.Chee etal.，Science，Vol 274，pp 610-613(1996))。
單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)可用于檢測(cè)突變體和野生型核酸之間的電泳遷移率差異(Orita等(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA862766，see also Cotton(1993)Mutat Res 285125-144；and Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。樣品和對(duì)照GPR54或metastin核酸的單鏈DNA片段可變性并允許其復(fù)性。單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)序列而不同，產(chǎn)生的電泳遷移率改變可用于檢測(cè)單個(gè)堿基改變。DNA片段可被標(biāo)記或用標(biāo)記的探針檢測(cè)。所述實(shí)驗(yàn)的敏感性可通過(guò)利用RNA(而不是DNA)來(lái)增強(qiáng)，其中的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)序列改變更敏感。在優(yōu)選實(shí)施方案中，目的(subject)方法利用異源雙鏈分析基于電泳遷移率分離雙鏈異源復(fù)合體分子(Keen等(1991)TrendsGenet 75)。
診斷實(shí)驗(yàn)提供診斷或確定對(duì)以下疾病的敏感性的方法感染諸如病毒，真菌，原核生物和病毒感染、尤其是HIV-1或HIV-2的感染；疼痛；癌癥；糖尿病；肥胖；厭食；貪食(bulimia)；哮喘；帕金森氏癥；血栓形成(thrombosis)；急性心衰，低血壓；高血壓；陽(yáng)痿(erectile dysfunction)；尿潴留(urinary retention)；代謝性骨病諸如骨質(zhì)疏松和骨硬化病；心絞痛；心肌梗塞；潰瘍；哮喘；過(guò)敏；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性腸??；腸易激綜合征；良性前列腺肥大以及精神和神經(jīng)性疾病，包括焦慮(anxiety)，精神分裂(schizophrenia)，狂燥型抑郁(manic depression)，譫妄(delirium)，癡呆(dementia)，嚴(yán)重精神遲緩和運(yùn)動(dòng)功能障礙(severe mental retardation anddyskinesia)，諸如亨廷頓(Huntington)氏病或Gilles dela Tourett′s綜合征，可通過(guò)所述方法檢測(cè)GPR54或metastin基因中的突變。
在具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述診斷試驗(yàn)用于診斷或治療對(duì)阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖的易感性。優(yōu)選，所述疾病涉及調(diào)節(jié)性類固醇激素軸。
可檢測(cè)樣品中GPR54或metastin多肽和核酸的存在。因此，上述感染和疾病可通過(guò)以下方法診斷，所述方法包括測(cè)定來(lái)自個(gè)體的樣品中異常降低或增加的GPR54或metastin多肽或者GPR54或metastin mRNA水平。所述樣品可包含來(lái)自患有或易患與增加，降低或異常GPR54或metastin表達(dá)相關(guān)疾病的生物體的細(xì)胞或組織，包括表達(dá)水平或模式的空間性或暫時(shí)性改變?；加谢蛞谆妓黾膊〉纳矬w中的GPR54或metastin的表達(dá)水平或模式可通過(guò)與正常生物體中的所述表達(dá)水平或模式比較作為疾病診斷方法。
因此，通常本發(fā)明包括檢測(cè)樣品中核酸存在的方法，所述核酸包含GPR54或metastin核酸，所述方法通過(guò)將所述樣品與至少一種對(duì)所述核酸特異的核酸探針接觸，并監(jiān)測(cè)該樣品中所述核酸的存在來(lái)進(jìn)行。例如，所述核酸探針可特異性結(jié)合于GPR54或metastin核酸或其一部分，并檢測(cè)兩者的結(jié)合；所述復(fù)合物本身的存在也可被檢測(cè)。此外，本發(fā)明包括檢測(cè)GPR54或metastin多肽的方法，所述方法通過(guò)將細(xì)胞樣品與能結(jié)合所述多肽的抗體接觸，并檢測(cè)該樣品中所述多肽的存在來(lái)進(jìn)行。這可通過(guò)監(jiān)測(cè)所述抗體和多肽之間的復(fù)合物形成，或監(jiān)測(cè)所述多肽與抗體的結(jié)合方便地實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)兩種實(shí)體之間的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域已知，并包括FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer))，表面胞質(zhì)團(tuán)共振(surfaceplasmon resonance)等。
降低或增加的表達(dá)可利用本領(lǐng)域已知任何用于定量多核苷酸的方法在RNA水平測(cè)定，所述方法諸如PCR，RT-PCR，RNase保護(hù)，Northern印跡和其它雜交法。可用于測(cè)定宿主樣品中蛋白如GPR54或metastin水平的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述實(shí)驗(yàn)方法包括放射免疫實(shí)驗(yàn)，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，Western印跡分析和ELIA實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明涉及用于診斷以下任意疾病或?qū)σ韵氯我饧膊〉囊赘行缘脑\斷試劑盒阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖。優(yōu)選，所述疾病涉及性類固醇激素軸的調(diào)節(jié)。
用具體優(yōu)選的診斷試劑盒來(lái)診斷以下疾病或?qū)σ韵氯我饧膊〉囊赘行园柎暮Ｄ习Y，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖。優(yōu)選，所述疾病涉及性類固醇激素軸的調(diào)節(jié)。
所述診斷試劑盒包含GPR54或metastin多核苷酸或其片段；互補(bǔ)核苷酸序列；GPR54或metastin多肽或其片段，或抗GPR54或metastin多肽的抗體。
預(yù)防和治療方法本發(fā)明提供治療與GPR54多肽活性過(guò)高或不足相關(guān)的異常疾病的方法，且GPR54多肽，其結(jié)合蛋白和/或編碼它們的核酸具體可用于治療神經(jīng)性，生殖激素相關(guān)的和一些其它疾病。所述神經(jīng)疾病包括但不限于一或多種選自下組的疾病阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病或癲癇。
所述生殖激素相關(guān)的疾病包括選自下組疾病的一或多種疾病生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病或停經(jīng)。此外，GPR54激動(dòng)劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。
其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。
如果GPR54活性過(guò)高，可采用多種方法。一種方法包括給藥受試者有效抑制活化的量的本文上述的抑制性化合物(拮抗劑)以及可藥用載體，其通過(guò)阻斷配體與GPR54的結(jié)合，或通過(guò)抑制第二信號(hào)從而緩解所述異常疾病。
另一方法中，可給藥仍能與內(nèi)源GPR54競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體的可溶形式的GPR54多肽。這種競(jìng)爭(zhēng)物的常見實(shí)施方案包括GPR54多肽的片段。
另一方法中，內(nèi)源GPR54多肽編碼基因的表達(dá)可利用表達(dá)阻斷技術(shù)抑制。已知的這種技術(shù)涉及利用反義序列，所述反義序列可內(nèi)部產(chǎn)生或分別給藥。見例如O′Connor，JNeurochem(1991)56560 in Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of基因Expression，CRC Press，Bocaraton，F(xiàn)la.(1988).可選可提供與所述基因形成三螺旋的寡核苷酸。見，例如，Lee等，NucleicAcids Res(1979)63073；Cooney等，Science(1988)241456；Dervan等，Science(1991)2511360。這些組合物可按原樣給藥或相關(guān)寡聚物可在體內(nèi)表達(dá)。
為治療GPR54或其活性低表達(dá)相關(guān)的異常疾病，可采用多種方法。一種方法包括給藥受體治療有效量的化合物與可藥用載體，所述化合物類似配體結(jié)合的GPR54(即上述激動(dòng)劑)，從而緩解所述異常疾病?？蛇x，可用基因治療以通過(guò)受試者中的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生GPR54。例如，本發(fā)明的多核苷酸可經(jīng)改造以表達(dá)如上所述的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體可隨后被分離并導(dǎo)入包裝細(xì)胞(packaging cell)，所述包裝細(xì)胞用含有編碼本發(fā)明多肽的RNAd的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得所述包裝細(xì)胞可產(chǎn)生含有目的基因的感染性病毒顆粒。可將這些制備型細(xì)胞(producer cell)給藥受試者，以在體內(nèi)改造細(xì)胞并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽?；蛑委煹木C述參見Chapter 20，Gene Therapy and other Molecular Genetic-basedTherapeutic Approaches，(and references cited therein)in Human Molecular基Genetics，T Strachan and A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
配制和給藥肽諸如GPR54多肽的可溶形式，以及激動(dòng)劑和拮抗劑肽或小分子可與適宜的藥用載體配制在一起。所述配制劑包含治療有效量的所述多肽或化合物以及可藥用的載體或賦形劑。所述載體包括但不限于鹽水，緩沖的鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇及其組合物。配制劑應(yīng)適合給藥，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明還涉及藥物包和試劑盒，其包含一或多種容器，所述容器中充滿本發(fā)明前述組合物的一或多種成分。
本發(fā)明的多肽和其它化合物可單獨(dú)使用或與其它化合物諸如治療性化合物聯(lián)用。
所述藥物組合物系統(tǒng)給藥的優(yōu)選形式包括注射，通常經(jīng)靜脈內(nèi)注射?？墒褂闷渌⑸渫緩?，諸如經(jīng)皮下，肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)。系統(tǒng)給藥的其它方式包括經(jīng)粘膜(transmucosal)和經(jīng)皮(transdermal)給藥，利用穿透劑(penetrant)諸如膽鹽或梭鏈孢酸(Fusidic Acid)或其它清潔劑。此外，如果適當(dāng)?shù)嘏渲瞥赡c溶或包囊化的制劑，也可口服給藥。這些化合物也可經(jīng)局部(topical)和/或局部化(localize)，以藥膏(salve)，膏劑(paste)，凝膠等形式給藥。
所需劑量范圍有賴于所選肽，給藥途徑，配制劑性質(zhì)，以及受試者疾病的性質(zhì)，以及主治醫(yī)師判斷。適宜的劑量為0.1-100ug/kg受體。預(yù)期所需劑量范圍可變化較大，這是由于可獲得各種化合物并且各種給藥途徑的效率不同。例如預(yù)期口服給藥需要的劑量高于靜脈內(nèi)注射。這些劑量水平的差異可利用優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)途徑調(diào)節(jié)，這也是本領(lǐng)域已知的。
用于治療的多肽也可在受體內(nèi)源中，在如上所述通常稱為“基因治療”的藥征(modality)中產(chǎn)生。因此，例如來(lái)自受體的細(xì)胞可用在離體條件下編碼多肽的多核苷酸諸如DNA或RNA以及例如通過(guò)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體進(jìn)行改造。所述細(xì)胞隨后被導(dǎo)入受試者。
藥物組合物本發(fā)明還提供藥物組合物，包括給藥治療有效量的本發(fā)明GPR54多肽，其結(jié)合分子或編碼它們的核酸分子，以及可選的可藥用載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。
所述藥物組合物在人和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)中可用于人和動(dòng)物，并將通常包括任何一或多種可藥用稀釋劑、載體或賦形劑?？捎糜谥委煹妮d體和稀釋劑在藥學(xué)領(lǐng)域已知，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)所述。藥用載體、賦形劑或稀釋劑可根據(jù)給藥途徑以及標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐選擇。所述藥物組合物可包含載體、賦形劑或稀釋劑，任何適宜的粘合劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包被劑(coating agent)、增溶劑等。
防腐劑，穩(wěn)定劑，染料甚至調(diào)味劑可用于本發(fā)明藥物組合物。防腐劑實(shí)例包括苯甲酸鈉(sodium benzoate)，山梨酸(sorbic acid)以及對(duì)羥苯甲酸的酯。還可使用抗氧化劑和懸浮劑。
不同遞送系統(tǒng)需要不同組合物/配制劑。例如，本發(fā)明的藥物組合物可配制成利用微型泵(mini-pump)或通過(guò)粘膜途徑遞送(例如作為噴鼻劑或氣溶膠以便吸入)或可攝取的溶液，或經(jīng)胃腸外(其中所述組合物配制稱可注射形式用于通過(guò)例如經(jīng)靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下遞送)?？蛇x，所述配制劑可設(shè)計(jì)成通過(guò)所述兩種途徑遞送。
當(dāng)所述制劑通過(guò)胃腸道粘膜而經(jīng)粘膜遞送時(shí)，其在通過(guò)胃腸道時(shí)應(yīng)保持穩(wěn)定；例如，其應(yīng)抵抗蛋白水解，在酸性pH穩(wěn)定并抵抗膽汁的清潔作用。
適宜的藥物組合物可通過(guò)如下方式給藥經(jīng)吸入，以栓劑或陰道栓劑(pessary)的形式，以洗液、溶液、乳膏、油膏或細(xì)粉(dusting powder)的形式，通過(guò)利用貼皮劑(skin patch)，以含有賦形劑諸如淀粉或乳糖的片劑形式口服，或在膠囊或卵形囊(ovule)中單獨(dú)或與賦形劑一起，或以含有調(diào)味或著色劑的的酏劑、溶液或混懸液的形式，或經(jīng)胃腸外諸如，例如經(jīng)靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下注射。對(duì)于胃腸外給藥，所述組合物最好為無(wú)菌含水溶液的形式，所述溶液可含有其它物質(zhì)，諸如足夠的鹽或單糖，使得所述溶液與血液等張。對(duì)于經(jīng)口含(buccal)或舌下給藥，所述組合物可以以常用方式配制的片劑或錠劑形式給藥。
給藥通常，醫(yī)師決定適合個(gè)體受試者的實(shí)際劑量，且所述劑量隨年齡、體重或具體患者的反應(yīng)變化。所述劑量低于示例性平均情況。當(dāng)然可有優(yōu)選高于或低于所述范圍的劑量個(gè)別情況。
本發(fā)明藥物組合物可通過(guò)直接注射給藥。所述組合物可配制成經(jīng)胃腸外，經(jīng)粘膜，經(jīng)肌肉內(nèi)，經(jīng)靜脈內(nèi)，經(jīng)皮下，經(jīng)耳內(nèi)(intraocular)或經(jīng)皮給藥。通常，每種蛋白的給藥劑量為0.01-30mg/kg體重，優(yōu)選0.1-10mg/kg，更優(yōu)選0.1-1mg/kg體重.
術(shù)語(yǔ)″給藥的″包括通過(guò)病毒或非病毒技術(shù)遞送。病毒遞送機(jī)制包括但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒(AAV)載體，皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體和桿狀病毒載體。非病毒遞送基質(zhì)包括，脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體(immunoliposome)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，陽(yáng)離子表面兩親物(cationicfacial amphiphil)及其組合。這種遞送機(jī)制的途徑包括但不限于經(jīng)粘膜，經(jīng)鼻，口服，經(jīng)胃腸外，經(jīng)胃腸道，經(jīng)局部或經(jīng)舌下途徑。
術(shù)語(yǔ)“給藥的“包括但不限于通過(guò)粘膜途徑遞送，例如作為噴鼻劑或氣溶膠用于吸入或作為可攝取的溶液；胃腸外途徑，其通過(guò)可注射的形式諸如經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑遞送。
術(shù)語(yǔ)″共同給藥的(co-administered)″指每種例如本發(fā)明的多肽和其它實(shí)體諸如佐劑的給藥位點(diǎn)和時(shí)間使得可實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫系統(tǒng)的必要調(diào)節(jié)。因此，雖然可將所述多肽和佐劑同時(shí)給藥同一位點(diǎn)時(shí)，但優(yōu)選在不同時(shí)間和位點(diǎn)給藥所述多肽和佐劑。所述多肽和佐劑甚至可在同一遞送載體內(nèi)給藥，且所述多肽和抗原可為偶聯(lián)和/或非偶聯(lián)和/或基因偶聯(lián)/或非偶聯(lián)的。
所述多肽、多核苷酸、肽、核苷酸以及可選佐劑可作為單一劑量或多個(gè)劑量分開或共同給藥宿主受體。
本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)多種不同途徑給藥，諸如注射(包括經(jīng)胃腸外，經(jīng)皮下和經(jīng)肌肉內(nèi)注射)，經(jīng)鼻內(nèi)、粘膜內(nèi)、經(jīng)口服、經(jīng)陰道內(nèi)、經(jīng)尿道內(nèi)或經(jīng)耳給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可常規(guī)通過(guò)注射例如通過(guò)皮下或肌肉內(nèi)而經(jīng)胃腸外給藥。適合其它給藥方式的其它配制劑包括栓劑，以及一些情況下的口服制劑。對(duì)于栓劑，常用粘合劑和載體可包括，例如，聚乙二醇或三甘油酯；所述栓劑可以由有0.5％-10％或1％-2％的性組分的混合物形成?？诜苿┌ㄖT如通常采用的賦形劑，例如藥用級(jí)甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。所述組合物可為溶液，混懸液，片劑，丸，膠囊，持續(xù)釋放的配制劑或粉末，并含有10％-95％，優(yōu)選25％-70％的活性成分。當(dāng)疫苗組合物為凍干的時(shí)，凍干的物質(zhì)可在給藥前溶解，例如溶解為混懸液。溶解優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。
本發(fā)明將根據(jù)實(shí)施例進(jìn)行具體說(shuō)明，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1.轉(zhuǎn)基因GPR54敲除小鼠構(gòu)建靶向GPR54基因的載體鼠GPR54基因通過(guò)生物信息學(xué)方法(bioinformatically)鑒定，并發(fā)現(xiàn)其位于來(lái)自PAC文庫(kù)的10.3kb基因組片段組中。進(jìn)一步生物信息學(xué)研究將該片段組擴(kuò)大到28kb。該片段組提供足夠的側(cè)翼序列信息，使得可設(shè)計(jì)同源臂以便克隆入靶向型載體(所用靶向載體的結(jié)構(gòu)，包括相關(guān)限制位點(diǎn)顯示在圖3)。
鼠GPR54基因有五個(gè)編碼型外顯子。靶向策略設(shè)計(jì)為去除7tm編碼區(qū)前的部分第一外顯子和第二含7tm的外顯子(second 7tm-containing exon)的大部分。側(cè)接待缺失的含7tm的外顯子的4.7kb 5′同源臂和1.0kb 3′同源臂可通過(guò)PCR擴(kuò)增，并將其片段克隆入靶向型載體。合成用于擴(kuò)增所述臂的每種寡核苷酸引物的5’末端，其含有稀少切割型限制酶(rare cuttingrestriction enzyme)的不同識(shí)別位點(diǎn)，并與所述載體的多聚接頭(polylinker)的克隆位點(diǎn)相容且從臂本身缺失。對(duì)于GPR54，所述引物設(shè)計(jì)為以下序列所示那樣，具有AgeI/SpeI的5′臂克隆酶(cloning enzyme)和AscI/FseI的3′臂克隆酶。
此外，對(duì)于臂引物對(duì)(5′臂5′1(AgeI)/5′臂3′(SpeI)以及3′臂5′末端AscI/3′臂3′2 Fse)，其它對(duì)GPR54基因座特異的引物被設(shè)計(jì)為用于以下目的5′和3′探針引物對(duì)(5′探針FII/5′探針RII和3′探針F1/3′探針R1)，用于擴(kuò)增在分離的推定靶向克隆中的非重復(fù)性基因組DNA的兩個(gè)150-300bp短片段(所述片段位于每個(gè)臂外側(cè)并延伸超過(guò)所述臂)，從而允許對(duì)靶基因座進(jìn)行Southern分析；小鼠基因型引物對(duì)(hetF和hetR)，當(dāng)其與載體特異性引物(本文中為Asc403)用于多元PCR時(shí)，允許野生型、雜合和純合小鼠之間的區(qū)分；最后，靶篩選引物(target screening primer)(3P3A)，其在3’臂區(qū)末端上游退火，且當(dāng)與載體3’末端特異性引物(neo36)配對(duì)時(shí)產(chǎn)生靶事件特異性1.2kb擴(kuò)增引物(amplimer)。該擴(kuò)增引物可僅來(lái)自出現(xiàn)所需基因組改變的細(xì)胞的模板DNA，并允許區(qū)分正確靶向的細(xì)胞與背景，所述背景為含有該載體隨機(jī)整合的拷貝的克隆。靶向策略(targeting strategy)中的這些引物的位置和GPR54的基因座結(jié)構(gòu)顯示在SEQ ID NO10中。
musHarryP5′探針eFIIGTGTACCAGGTGAGGAGGCCATCAGAGGTGmusHarryP5′探針eRIITGTCATCCTGAGGCCCAATGGTTCTTCAGGmusHarry5′臂5’1 Age AAAACCGGTAAATGCTGTTAATCCTGCCAAGAGmusHarry5′臂3’Spe ATAACTAGTGTAGCGAAAAACAGGGGAACmusHarry3′臂5’末端AscIAAATTCGTCAACTACATCCAGCmusHarry3′臂3’2FseGGGAAGTGGGATAGACACGmusHarry 3P3A GGAAAAGCTAAGAACTAAGTGTGGmusHarry3′探針eF1 ATGAGTGTGGACCGCTGGTATGTGACmusHarry3′探針eR1 TCTGAGACTGAGTATGTGCCCTTGmusHarryP heft TCACTCGGACCCGGATGTACAGGTCAGmusHarryP hetR AGCCCGCGTACCTGCTGGATGTAGTTGAsc403 CAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGNeo36 CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC表1.GPR54引物序列同源臂的位置選擇為通過(guò)缺失7個(gè)跨膜區(qū)的大部分5’來(lái)功能性破壞GPR54基因。制備靶向型載體，所述載體中缺失的GPR54序列用非同源序列取代，所述非同源序列由選擇盒上游的內(nèi)源基因表達(dá)報(bào)道物(不依賴框的lacZ基因)組成，所述選擇盒由與GPR54基因方向一致的、啟動(dòng)的(promoted)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因組成。
一旦將5′和3′同源臂克隆入靶向型載體pTK4IBLMNL(見圖5)，大的高純度DNA制備物利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)制備。20μg新鮮制備的無(wú)內(nèi)毒素DNA用另一中稀有切割限制酶PmeI限制(restricted)，其存在于載體支架(backbone)中氨芐青霉素抗性基因和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)之間的獨(dú)特位點(diǎn)。線性化DNA被沉淀并重懸于100μl磷酸緩沖的鹽水，為電穿孔做好準(zhǔn)備。
電穿孔24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含200g/ml新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天?？寺”晦D(zhuǎn)移到96孔板、復(fù)制并擴(kuò)增，然后通過(guò)PCR篩選(利用引物3P3A和neo36，如上所述)以鑒定克隆，所述克隆中在內(nèi)源GPR54基因與靶向型構(gòu)建體之間發(fā)生了同源重組。陽(yáng)性克隆較少，為1-5％。擴(kuò)展這些克隆到允許復(fù)制物(replica)被冷凍，并且可制備足夠高質(zhì)量的DNA用于利用如上述制備的外部5′和3′探針通過(guò)Southern印跡確定所述靶向事件，所有過(guò)程都利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Russ等，Nature 2000 Mar 2；404(6773)95-92000)。當(dāng)用診斷性限制酶消化的DNA的Southern印跡與外部探針雜交時(shí)，被同源靶向的(homologously targeted)ES細(xì)胞克隆通過(guò)突變帶以及改變的野生型帶的存在來(lái)證實(shí)。例如，利用5′探針，BglII消化的DNA產(chǎn)生9kb野生型帶以及14.5kb靶向的帶；HindIII消化的DNA產(chǎn)生15kb野生型帶以及9.5kb靶向的帶；XbaI消化的DNA產(chǎn)生15kb野生型帶以及19.5kb靶向的帶。類似，利用3′探針，BamHI的DNA產(chǎn)生7.5kb野生型帶和4kb靶向的帶；EcoRI的DNA產(chǎn)生7kb野生型帶以及4.5kb靶向的帶。
敲除前小鼠GPR54的基因組基因座的結(jié)構(gòu)顯示于圖1。敲除后小鼠GPR54的基因組基因座的結(jié)構(gòu)顯示于圖2。與Southern證實(shí)(verification)相關(guān)酶的位點(diǎn)已經(jīng)表示出。
GPR54 GPCR缺陷小鼠的產(chǎn)生C57BL/6雌性和雄性小鼠進(jìn)行交配，并在孕期(gestation)第3.5天分離胚泡。每個(gè)胚泡中注入來(lái)自所選克隆的10-12個(gè)細(xì)胞，并將7-8個(gè)胚泡植入假孕F1雌性小鼠的子宮。嵌合同窩幼鼠出生時(shí)含有數(shù)只高水平(達(dá)l00％)有花紋的雄性(agouti male)小鼠(花紋外皮顏色(agouti coat colour)提示靶向的克隆的細(xì)胞的作用)。這些雄性嵌合小鼠與雌性MF1和129小鼠交配，并通過(guò)有花紋外皮顏色與PCR基因分型(PCR genotyping)分別測(cè)定種系傳遞(germline transmission)。
PCR基因分型在溶解的尾碎片(clip)上，利用引物hetF和hetR，以及第三種載體特異性引物(Asc403)來(lái)進(jìn)行。該多元PCR允許從野生型基因座(如存在)從引物hetF和hetR進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生217bp帶。hetF的位點(diǎn)在敲除小鼠中缺失，使得所述擴(kuò)增不能從靶向的等位基因開始(fail from a targetedallele)。然而，Asc403引物將與與3’臂區(qū)內(nèi)的區(qū)退火的hetR引物一起從靶向的基因座擴(kuò)增439bp的帶。因此，該多元PCR顯示同窩鼠的基因型如下野生型樣品顯示單217bp帶；雜合DNA樣品顯示兩條帶217bp和439bp；純合子樣品僅顯示靶特異性439bp帶。
實(shí)施例2B)結(jié)果I)基因表達(dá)模式1)電Northern電Northern見圖16。
PCR結(jié)果。給定組織的表達(dá)表示為(-)未檢測(cè)到，(+)檢測(cè)到低水平豐度，(++)檢測(cè)到中等水平豐度，(+++)檢測(cè)到高水平豐度。睪丸+，肌肉-，卵巢+，前列腺-，小腸+，肺++，腎+，白細(xì)胞+，肝-，腦+++，心+，脾+Est數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果

2)被LacZ染色的結(jié)構(gòu)lacZ實(shí)驗(yàn)中，以下結(jié)構(gòu)含有LacZ表達(dá)的證據(jù)腦(以下區(qū))，脊髓(感覺區(qū))，睪丸。
LacZ表達(dá)見于腦的不同區(qū)域，諸如海馬(最強(qiáng)的區(qū))，視交叉上核(suprachiasmatic nucleus)，乳頭體，腦橋和小腦，以及脊髓背側(cè)(感覺)區(qū)。
觀察和顯微鏡切片固定6只野生型和6只突變體GPR54敲除小鼠的腦經(jīng)并在冷凍切片機(jī)(freezing microtome)切出40張顯微鏡切片。
在顯微鏡下觀察切片顯示LacZ染色在以下區(qū)域的定位海馬嗅球(Olfactory bulbs)視交叉前(Preoptic)下丘腦腦室周(Periventricular)下丘腦韁核(Habenular nucleus)下丘腦束(Hypothalamic tract)蝸神經(jīng)核(Cochlear nucleus)上乳頭體(Supramamillary body)3)Lac Z表達(dá)圖突變體腦切片見圖4a；雜合子和野生型的睪丸見b。
II)解剖學(xué)觀察Harry Potter敲除小鼠顯示一些大體解剖異常突變體的生殖道總體明顯畏萎縮(雄性包皮腺(preputial gland)萎縮，小陰莖(micropenis)，睪丸和儲(chǔ)精囊/coagulatory腺非常小)，肌肉重量減少，棕色脂肪減少且胃和上頜下唾液腺較小。
雌性突變體乳腺發(fā)育不良，卵巢(圖6)、子宮和輸卵管萎縮。
雄性突變體的肛門生殖器距離(anogenital distance)短于野生型(以cm為單位突變體0.97±0.03野生型1.4±0.3，p＜0.001)，這導(dǎo)致飼養(yǎng)人員錯(cuò)誤判斷動(dòng)物的性別。但在雌性中沒有觀察到差異。
子宮和卵巢(上圖，野生型；下圖，突變體)III)行為所有動(dòng)物被圈養(yǎng)，其可自由獲得食物和水，晝-夜循環(huán)為12小時(shí)晝/12小時(shí)夜，7am開始給光。
在小鼠8-10周齡時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，除Barnes maze和性行為檢測(cè)在下午15-17點(diǎn)進(jìn)行以外，所有實(shí)驗(yàn)都在早上10-12點(diǎn)進(jìn)行。
檢測(cè)顯示突變體和野生型之間有差異a)Barnes mazeBarnes maze為空間記憶(spatial memory)實(shí)驗(yàn)，其在白色圓形平臺(tái)上進(jìn)行，需要區(qū)分特定空間。其包含圓形平臺(tái)，所述平臺(tái)上有18個(gè)孔沿周長(zhǎng)平均分布。一個(gè)孔下方有黑色逃跑盒子。Barnes maze實(shí)驗(yàn)利用嚙齒類動(dòng)物避免有光照的非封閉表面(brightly lit unenclosed surface)并尋找暗的封閉場(chǎng)所(darkened enclosed shelter)的天然傾向。
訓(xùn)練所述動(dòng)物動(dòng)物10天以上，記錄進(jìn)入所述逃跑盒子的等待期以及錯(cuò)誤次數(shù)和搜索策略。
有趨勢(shì)表明，雄性突變體的該實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)較差(圖7)。
b)交配行為5只雄性突變體和5只野生型同窩小鼠與野生型雌性動(dòng)情期小鼠(通過(guò)陰道涂片評(píng)估)一同置于新籠中，并觀察30分鐘。所述小鼠都顯示對(duì)雌性有興趣(嗅(sniffing))并在觀察期間進(jìn)行交配。
突變體對(duì)雌性沒有顯示有興趣，且在觀察期間不進(jìn)行交配。此外，數(shù)只雄性和雌性突變體小鼠同處一籠但沒有懷孕，表明GPR54敲除小鼠是不育的。
c)動(dòng)情期周期6只突變體雌性和6只野生型同窩小鼠在連續(xù)5天中接受涂片實(shí)驗(yàn)。還檢驗(yàn)了3周大+/+雌性。利用甲基藍(lán)染色所述載片。所有野生型顯示明顯的動(dòng)情周期階段，但突變體不顯示。-/-雌性的陰道圖片與3周大野生型小鼠相似(圖8)。
d)生理建立15個(gè)交配對(duì)，其包含任意性別的GPR54突變與異性野生型小鼠，但從不產(chǎn)生同窩小鼠。因此，雄性和雌性GPR54突變體都不育。
1)重量a)器官重量測(cè)定睪丸(圖9)，肌肉(圖10)，腎上腺(圖11a)和唾液腺(圖11b)的重量。
2)實(shí)驗(yàn)a)睪酮，雌激素和GnRH測(cè)定測(cè)定6雄性突變體和6只野生型小鼠的睪酮。突變體的睪酮水平明顯低于(P＜0.05)野生型小鼠(圖12)。
雌性突變體的雌激素水平明顯低于動(dòng)情期正常雌性小鼠。這于前者缺乏動(dòng)情期周期一致。在動(dòng)情前期，動(dòng)情期，動(dòng)情后期，以及動(dòng)情間期的野生型雌二醇水平顯示正常的循環(huán)水平(圖13)。
下丘腦中GnRH水平與野生型動(dòng)物是可比的。這表明突變對(duì)于敲除小鼠的GnRH合成沒有影響(未顯示)。
b)LH/FSH實(shí)驗(yàn)突變體中FSH低得多(圖14a為雌性的；圖14b為雄性的)。LH水平?jīng)]有差異(未顯示)。
c)外源性促性腺激素.
給藥1000iu PMS(懷孕母馬血清-FSH-樣促性腺激素)后兩天給予1000iu bHCG(β人絨毛膜促性腺激素)，導(dǎo)致50％雌性突變體(n＝6)排出成熟卵，表明所述末端器官(end organ)保持對(duì)天然促性腺激素產(chǎn)生反應(yīng)的能力。這與GPR54受體和配體在垂體下丘腦軸而非末端器官水平起作用的推定一致。
3)給藥外源性GnRH以及對(duì)垂體FSH和LH分泌的影響方法將25ng GnRH肽分四次間隔30分注入，并在末次注射后30分鐘處死動(dòng)物以收集血液和垂體。所有小鼠在11am到1pm之間處死。
動(dòng)物分組6WT僅注入PBS(對(duì)照)，6WT注入在PBS中制備的GnRH，6HP注入GnRH/PBS。所有WT動(dòng)物被分期并在動(dòng)情間期(LH和FSH峰末期)使用。所有小鼠均為2-4月齡。重復(fù)所述過(guò)程測(cè)定LH和FSH。
血清FSH實(shí)驗(yàn)注入GnRH的WT的血清FSH比僅注入PBS的那些增加1.9-倍。HP水平比僅注入PBS的WT增加1.7倍，這表明所述突變體動(dòng)物保持至少對(duì)GnRH有部分反應(yīng)。這表明GPR54的作用可由下丘腦中的GnRH釋放控制。
血清LH實(shí)驗(yàn)注入GnRH的WT的血清LH比僅注入PBS的那些增加5-倍。HP水平比僅注入PBS的WT增加5倍。這表明LH的釋放由外源性GnRH(圖15a)刺激。
外源性刺激后測(cè)定垂體中LH水平的消耗。結(jié)果顯示垂體LH水平相應(yīng)消耗，表明突變體仍對(duì)自垂體釋放的GnRH和LH有反應(yīng)(圖15b)。從突變體敲除基因沒有任何有害影響。
上文所述所有公開出版物包含在本文作為參考。所述方法和系統(tǒng)的的各種修飾和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，且不偏離本發(fā)明范圍和精神。盡管本發(fā)明根據(jù)具體優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，應(yīng)理解本發(fā)明權(quán)利要求不限于所述具體實(shí)施方案。實(shí)際上，實(shí)踐本發(fā)明的所述模式的各種變化是化學(xué)、分子生物學(xué)以及生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，并意圖包含在權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.GPR54敲除哺乳動(dòng)物，其含有一或多種細(xì)胞，所述細(xì)胞中的GPR54多肽是功能失活的。
2.權(quán)利要求1的GPR54敲除小鼠，其與野生型對(duì)照相比具有一或多個(gè)選自下組的特征接觸翻正反射減少且Barnes maze表現(xiàn)降低，生殖激素水平和/或模式(包括周期)改變，生殖器官以及相關(guān)器官的形態(tài)改變，或性行為/生殖行為改變。
3.權(quán)利要求2的GPR54敲除小鼠，其具有選自下組的特征生殖激素水平和/或模式(包括周期)改變，生殖器官以及相關(guān)器官的形態(tài)改變，或性行為/生殖行為改變。
4.產(chǎn)生一或多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞包含一或多種功能失活的GPR54基因，該方法包括以下步驟(a)選擇一或多種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含一或多種有功能活性的內(nèi)源GPR54基因，(b)利用功能失活的GPR54核酸轉(zhuǎn)染步驟(a)的一或多種細(xì)胞，所述功能失活的GPR54核酸可通過(guò)同源重組與一或多種內(nèi)源GPR54基因進(jìn)行重組，(c)選擇一或多種細(xì)胞，所述細(xì)胞中的一或多種內(nèi)源GPR54基因已經(jīng)與功能失活的GPR54核酸發(fā)生了同源重組。
5.核酸構(gòu)建體，其適宜使宿主細(xì)胞中的一或多種內(nèi)源GPR54基因發(fā)生功能性失活，所述構(gòu)建體包含(a)非-同源置換區(qū)(b)位于所述非-同源置換區(qū)上游的第一同源區(qū)(c)突變的GPR54基因，其在表達(dá)時(shí)不編碼有功能活性的GPR54，(d)位于所述非-同源置換部分下游的第二同源區(qū)，所述第二同源區(qū)位于該非-同源置換區(qū)的下游，并具有與第二GPR54基因至少90％同一性的核苷酸序列。
6.組合物，所述組合物包含GPR54多肽、或GPR54多肽的一或多種結(jié)合蛋白、或編碼它們的核酸，以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
7.鑒定GPR54多肽的功能活性的一或多種拮抗劑的方法，其包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物包含有功能活性的GPR54多肽(b)用GPR54多肽的一或多種可能的拮抗劑治療所述一或多種哺乳動(dòng)物，(c)檢測(cè)所述一或多種哺乳動(dòng)物，以確定所述哺乳動(dòng)物是否顯示GPR54敲除小鼠的一或多種選自下組的性質(zhì)異常的神經(jīng)性質(zhì)，或異常的生殖系統(tǒng)和/或形態(tài)，(d)選出顯示步驟(c)的一或多種特征的一或多種拮抗劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中步驟(c)包括檢測(cè)一或多種哺乳動(dòng)物以確定所述哺乳動(dòng)物是否顯示異常的生殖系統(tǒng)和/或形態(tài)。
9.鑒定一或多種分子的方法，所述分子激動(dòng)GPR54多肽的功能活性，所述方法包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物包含功能失活的GPR54多肽；(b)用一或多種可能的GPR54類似物治療所述一或多種哺乳動(dòng)物，所述類似物可激動(dòng)GPR5活性的至少一個(gè)方面；(c)檢測(cè)根據(jù)步驟(b)治療的一或多種哺乳動(dòng)物，以確定經(jīng)過(guò)治療的哺乳動(dòng)物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動(dòng)物相比是否具有一或多種恢復(fù)的性質(zhì)，和(d)選擇所述一或多種GPR54-配體類似物，其使得根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動(dòng)物恢復(fù)野生型哺乳動(dòng)物的一或多種性質(zhì)。
10.鑒定一或多種分子的方法，所述分子拮抗GPR54多肽的功能活性，所述方法包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物包含有功能活性的GPR54多肽；(b)用一或多種可能的GPR54拮抗劑治療所述一或多種哺乳動(dòng)物，所述拮抗劑可拮抗GPR54活性的至少一個(gè)方面；(c)檢測(cè)根據(jù)步驟(b)治療的一或多種哺乳動(dòng)物，以確定經(jīng)過(guò)治療的哺乳動(dòng)物與根據(jù)步驟(a)選出的哺乳動(dòng)物相比是否具有一或多種經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的性質(zhì)。
11.轉(zhuǎn)基因GPR54敲除哺乳動(dòng)物在用于測(cè)定一或多種化合物的生物效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中的用途。
12.診斷選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖，所述方法包括以下步驟(a)從待診斷的患者中選出細(xì)胞樣品，(b)比較所述細(xì)胞樣品與來(lái)自健康個(gè)體的一或多個(gè)對(duì)照樣品中的GPR54多肽的表達(dá)水平和/或功能活性。
13.診斷選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經(jīng)元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調(diào)節(jié)，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，停經(jīng)，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖，所述方法包括以下步驟(a)從待診斷的患者中選出細(xì)胞樣品，(b)檢測(cè)來(lái)自所述細(xì)胞的核酸，并檢測(cè)GPR54基因的一或多種多態(tài)性。
14.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其至少部分細(xì)胞包含外源性核酸，所述外源性核酸編碼一或多種選自下組的多肽GPR54多肽，GPR54多肽的一或多種激動(dòng)劑、GPR54多肽的一或多種拮抗劑或者GPR54活性的一或多種調(diào)節(jié)物。
15.治療患者的疾病的方法，所述疾病選自肌肉消耗性疾病、疼痛、炎癥、激素依賴性癌癥、泌乳、骨質(zhì)疏松/骨硬化病、與停經(jīng)相關(guān)的激素失衡或肥胖，所述方法包括用治療有效量的一或多種選自下組的物質(zhì)治療所述患者GPR54多肽，GPR54多肽的一或多種激動(dòng)劑、GPR54多肽的一或多種拮抗劑或者GPR54活性的一或多種調(diào)節(jié)物。
16.一或多種物質(zhì)在制備用于預(yù)防或治療患者疾病的藥物中的用途，所述一或多種物質(zhì)選自GPR54多肽，GPR54多肽的一或多種激動(dòng)劑，GPR54多肽的一或多種拮抗劑或GPR54活性的一或多種調(diào)節(jié)物，所述疾病選自肌肉消耗性疾病，疼痛，炎癥，激素依賴性癌癥，泌乳，骨質(zhì)疏松/骨硬化病，與停經(jīng)相關(guān)的激素失衡或肥胖。
17.操縱患者的性激素軸的方法，包括用治療有效量的一或多種選自下組的物質(zhì)治療所述患者GPR54多肽，GPR54多肽的一或多種激動(dòng)劑、GPR54多肽的一或多種拮抗劑或者GPR54活性的一或多種調(diào)節(jié)物。
18.GPR54多肽、GPR54多肽的一或多種激動(dòng)劑、GPR54多肽的一或多種拮抗劑或者GPR54活性的一或多種調(diào)節(jié)物在制備用于操縱哺乳動(dòng)物的性激素軸的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘丙素樣受體和/或其配體在操縱垂體激素軸和生殖系統(tǒng)中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1708585SQ200380101998
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月25日
發(fā)明者塞繆爾·阿帕里西奧, 威廉·科利奇, 約翰·狄克遜, 艾倫·亨德里克, 索菲·梅薩格, 羅斯瑪麗·思雷舍, 德克·贊 申請(qǐng)人:帕拉迪姆醫(yī)療有限公司