專利名稱：改進的免疫療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫治療領(lǐng)域，特別涉及增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。
背景技術(shù)：
治療腫瘤的一種方法是在腫瘤細胞內(nèi)引入基因，該基因編碼的酶能將相對低毒性的前體藥物轉(zhuǎn)化為有效的細胞毒藥物。機體對這一前體藥物全身給藥是耐受的，因為它只在腫瘤區(qū)域才會被細胞表達的前體藥物轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化為有毒的衍生物。這一方法稱為基因?qū)虻拿盖绑w藥物療法(GDEPT)，或者通過重組病毒載體而遞送基因的病毒導(dǎo)向的前體藥物(prodrug)療法(VDEPT)(McNeish等，1997)。
用在此種途徑的前體藥物和前體藥物轉(zhuǎn)化酶的例子包括更昔洛韋(ganciclovir)和HSV胸苷激酶、5-氟胞嘧啶和胞嘧啶脫氨酶、環(huán)磷酰胺或?qū)σ阴０被雍图毎豍450，和與本發(fā)明特別相關(guān)的氮丙啶基前體藥物CB1954(5-(氮丙啶-1-基)-2，4-二硝基苯)及硝基還原酶(Knox等1998)。在觀察到Walker大鼠癌細胞系對CB1954特別敏感之后，這表明這是由于表達大鼠硝基還原酶DT硫辛酰胺脫氫酶。然而，由于CB1954是人型的該酶較差的底物，人腫瘤細胞對CB1954敏感度要差很多。GDEPT被設(shè)想作為一種引入合適的硝基還原酶的途徑，優(yōu)選對CB1954具有更高活性的酶，用來致敏靶細胞。由NFSB基因(又稱作NFNB，NFSI或DPRA)編碼的大腸桿菌硝基還原酶(EC1.6.99.7，又稱作對氧氣不敏感的NAD(P)H硝基還原酶或二羥基蝶啶還原酶，通常簡稱NTR)，被廣泛用作此目的(Grove等綜述，1999)。NFSB編碼的硝基還原酶(NTR)是同型二聚體，能結(jié)合兩個黃素單核苷酸(FMN)輔因子分子。利用NADH或NADPH作為電子供體，結(jié)合的FMN作為還原的中間體，NTR還原CB1954的兩個硝基中的任意一個，生成高毒性的4-羥胺衍生物或相對無毒性的2-羥胺。在細胞內(nèi)部，(5-(氮丙啶-1-基)-4-羥氨基-2-硝基苯甲酰胺)極可能通過進一步的有毒代謝物，變得非常具有基因毒性(Knox等，1991)。其導(dǎo)致的損害的確切本質(zhì)還不清楚，但與其他因素引起的損害不相同。出現(xiàn)特別高頻率的鏈間交聯(lián)，而該損害很難修復(fù)，致使CB1954成為異常有效的抗腫瘤劑(Friedlos等，1992)。這一系統(tǒng)在許多模式系統(tǒng)中已顯示出有效產(chǎn)生有用的抗腫瘤反應(yīng)，包括在裸鼠身上人異種移植的腫瘤(Djeha等，2000)。
也就是說，已經(jīng)有將酶-前體藥物策略與免疫療法相結(jié)合來增強腫瘤殺傷效果的嘗試。合理的是希望在被細胞毒性因子殺傷的細胞中生成針對腫瘤特異性抗原的抗腫瘤免疫反應(yīng)，及希望腫瘤位置的殘余細胞和腫瘤轉(zhuǎn)移中的細胞能(主要)被細胞毒性T細胞反應(yīng)殺傷。為促進刺激這一反應(yīng)，基因療法中已嘗試使用一些免疫刺激的分子與GDEPT/VDEPT結(jié)合。其中較好的候選物是GM-CSF，其已經(jīng)與胸苷激酶(Jones等)和胞嘧啶脫氨酶一起使用(Cao等)。其他嘗試與上述一種或兩種酶共同使用的候選物包括IL-2，II-6，B7-1(Felzman等)，IFN-γ(Santodonato等)和MCP-1(Sakai等)然而總體來看，試驗的結(jié)果不一，沒有產(chǎn)生對治療方案可靠的改進。對于腫瘤的免疫治療還有很多地方需要改進。
在細胞應(yīng)激反應(yīng)中，一亞組基因被誘導(dǎo)表達產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)蛋白。這些蛋白有著不同的功能，包括細胞內(nèi)的信使和轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB和高泳動性組B1(HMGBl，Bustin，2002)和細胞因子如IL-1β，IL-1α，IL-6，IL-8，TNF-α，GM-CSF，IL-12和IL-15。其中最為重要的一類稱作熱休克蛋白。
熱休克蛋白是細胞內(nèi)廣泛存在的蛋白，在進化過程中保持高度保守性，已知與基本的細胞內(nèi)過程如蛋白折疊，解折疊和蛋白的降解相關(guān)，是多個蛋白亞單位復(fù)合體的裝配。在細胞應(yīng)激條件下(熱，毒素，饑餓，組織缺氧)其表達水平急劇上調(diào)，并且在修復(fù)和減輕細胞應(yīng)激期間導(dǎo)致的蛋白損傷中起作用(Parsell和Lindquist綜述，1993)。熱休克蛋白的表達受一些結(jié)合到熱休克蛋白啟動子元件的上游因子控制。這些上游因子包括HSF-1(熱休克蛋白-1，Baler等，1993)，HSF-2(Mathew等，2001)和HSF-3(Nakai和Morimoto等，1993)和干擾素反應(yīng)因子，包括IRF-1和2(Taniguchi等，2001，Mamane等，1999)。
最近，已知它們在衍生自細胞內(nèi)蛋白的肽的加工和呈遞，及將這些肽運送給抗原呈遞細胞起著一定的作用。具體而言，熱休克蛋白Hsp70，Hsp90和鈣網(wǎng)膜蛋白能以極高的親和力結(jié)合自身肽段，通過裂解細胞將其從細胞中釋放后運送給表達Hsp受體CD91的抗原呈遞細胞(Basu等，2001)。裂解之前的細胞應(yīng)激提高了熱休克蛋白的含量，因而增強這種作用。有人認為，刺激針對細胞內(nèi)抗原的免疫反應(yīng)與細胞壞死而不是細胞調(diào)亡或程序性細胞死亡有關(guān)，而這至少部分地受抗原遞呈細胞含量的控制(Matzinger，1994)。當特異性運用于抗腫瘤反應(yīng)時，非調(diào)亡(即壞死)的腫瘤細胞的死亡誘導(dǎo)更高水平的Hsp70，并與免疫原性增強、炎性細胞內(nèi)容物釋放，前炎性Th1型細胞因子的分泌增加和巨噬細胞的激活相關(guān)(Gough等，2001)。另一方面，調(diào)亡性細胞死亡，因細胞內(nèi)的大分子在接觸到細胞外環(huán)境之前已經(jīng)被降解了，而Hsp70，Hsp90和鈣網(wǎng)膜蛋白沒有大量釋放(Basu等，2000)，因此一般不能引發(fā)炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答。壞死的，而不是調(diào)亡的細胞裂解物能使樹突狀細胞成熟，其是一種在免疫應(yīng)答的起始階段用于激活幼稚T細胞的關(guān)鍵的抗原遞呈細胞(Galucci等，1999；Sauter等，2000)。Hsp70本身被認為是樹突狀細胞的成熟因子(Kuppner等，2001；Gastpar等，歐洲專利申請EP1209226)。此外，調(diào)亡細胞可以直接傳遞抗炎性和免疫抑制信號給抗原遞呈細胞，例如通過磷脂酰絲氨酸受體(Fadok等，2000)。
發(fā)明概述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)運用硝基還原酶/CB1954酶/前體藥物系統(tǒng)，除了殺傷靶標腫瘤細胞外，還殺傷與釋放自裂解細胞的活化CB1954有毒產(chǎn)物接觸的周圍細胞，能對后來進行的同型腫瘤細胞的攻擊產(chǎn)生顯著的防護效果。由于先前的工作認為這種殺傷是通過調(diào)亡機制進行的(Djeha等，2000)，而調(diào)亡性細胞死亡被認為只能產(chǎn)生相對弱的免疫應(yīng)答，上述發(fā)現(xiàn)是沒預(yù)料到的。為進一步增強抗腫瘤效果，構(gòu)建了含有編碼能表達硝基還原酶和Hsp70的多核苷酸的腺病毒基因治療載體。其合理之處在于腫瘤細胞能成為該載體的靶標，再被其感染，并通過施用CB1954導(dǎo)致死亡，這促進由腫瘤細胞死亡引發(fā)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答因Hsp70的過量表達而增強。而這又反過來導(dǎo)致細胞內(nèi)Hsp70結(jié)合的肽段被有效傳遞到表達CD91的抗原遞呈細胞。上述遞呈的肽段含有腫瘤特異的“非自身”的表位，是在腫瘤細胞內(nèi)由于體細胞突變形成的，因此這些肽段的遞呈在主要為I型MHC分子的情況下，導(dǎo)致CD8+細胞毒性T細胞抗腫瘤免疫反應(yīng)的啟動。而另有一部分Hsp運送的肽段進入II型MHC呈遞途徑，導(dǎo)致CD4+T輔助細胞應(yīng)答的增強。細胞應(yīng)答的這兩個方面都對抗腫瘤免疫非常重要。
這種方法成功產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的原因是否是在至少一部分細胞中GDEPT-介導(dǎo)的殺傷是壞死性的；如果主要的殺傷機制是調(diào)亡性的，為何有明顯的繼發(fā)性細胞壞死發(fā)生；調(diào)亡性細胞死亡的抗炎性和非免疫原性性質(zhì)能否在一定程度上被熱休克因子的過量表達所克服，這些問題都尚不清楚。然而，發(fā)明人證實在小鼠腫瘤模型中用運送NTR基因的載體注射原發(fā)性腫瘤以及隨后全身給藥CB1954不僅殺傷腫瘤，而且能在一定程度上防止對同類腫瘤細胞的攻擊。發(fā)明人還進一步表明這種保護效應(yīng)因方便在同一基因治療載體中同時給藥指導(dǎo)表達Hsp70的基因而顯著增強。
本發(fā)明不限于硝基還原酶作為前體藥物轉(zhuǎn)化酶的應(yīng)用，也不限于依賴前體藥物轉(zhuǎn)化的細胞殺傷的方法。原則上，任何一種細胞殺傷的方法，包括編碼能進行細胞殺傷的分子的多核苷酸，都可以與任何具有熱休克蛋白樣功能的分子聯(lián)用，作為內(nèi)源性的佐劑加強抗腫瘤應(yīng)答。能被編碼并應(yīng)用到這一途徑的毒素有篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素和肉毒(桿)菌毒素。能作為適合的前體藥物轉(zhuǎn)化酶的另一種選擇是細胞色素P450/對乙酰氨基酚酶/前體藥物組合。已知這一系統(tǒng)可用作殺傷腫瘤細胞的手段(國際專利申請WO 00/40272)，并且有證據(jù)表明，由于對乙酰氨基酚激活產(chǎn)生毒性的N-乙酰苯并醌亞胺(NABQI)，導(dǎo)致細胞殺傷是調(diào)亡性的(Bae等，2001；Boulares等，2002)。然而，申請人發(fā)現(xiàn)細胞色素P450和hsp70的共同表達在治療量的對乙酰氨基酚存在的條件下，導(dǎo)致抗腫瘤應(yīng)答比單獨應(yīng)用細胞色素P450時顯著提高。
事實上，上述公開的運送提供表達熱休克蛋白的載體的方法顯然可以用來增強針對由于不同原因被殺死的細胞的免疫應(yīng)答，如腫瘤細胞，但不限于此。熱休克蛋白的DNA運送作為輔助的免疫治療結(jié)合化學治療或放射治療可能是有益的。
適合用作免疫佐劑的分子為Hsp70，Hsp90，Hsp110，鈣網(wǎng)膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝桿菌Hsp65，肺炎軍團桿菌(Legionella pneumophila)Hsp60，大腸桿菌(Escherichia coli)GroEL和GroES。
此外，從在此公開的數(shù)據(jù)一目了然，基于GDEPT方法導(dǎo)致壞死性細胞死亡(如NTR/CB1954組合)的應(yīng)用，即使沒有由結(jié)合的Hsp轉(zhuǎn)基因提供的上調(diào)Hsp表達水平的額外有益作用，仍然是有顯著的免疫原性。
這個載體可以是能將DNA轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的任何載體，優(yōu)選的載體為整合載體或游離型載體。
優(yōu)選的整合載體包括重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的至少一部分能感染靶細胞的DNA。術(shù)語“感染”用以說明病毒將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到它的宿主或靶細胞內(nèi)的過程。優(yōu)選地，構(gòu)建本發(fā)明的載體所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒是復(fù)制缺陷型的，能消除病毒復(fù)制對靶細胞的影響。在這些情形下，復(fù)制缺陷型的病毒基因組可被輔助病毒以常規(guī)的技術(shù)進行包裝。通常任何滿足上述感染力和功能基因轉(zhuǎn)移要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒都可以用在本發(fā)明的實踐中。
合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括業(yè)內(nèi)人上知曉的pLJ，pZip，pWe，pEM，但不限于此。對復(fù)制缺陷型的逆轉(zhuǎn)錄病毒合適的包裝病毒系統(tǒng)包括，例如ψCrip，ψCre，ψ2，和ψAm。特別適合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體，尤其是HIV，SIV和FIV。
本發(fā)明中其他有用的載體包括腺病毒、腺相關(guān)病、SV40病毒、牛痘病毒、HSV和痘病毒載體。優(yōu)選的載體是腺病毒載體。腺病毒載體為業(yè)內(nèi)人士所知并已用于向眾多細胞類型轉(zhuǎn)移基因，包括呼吸道上皮、骨骼肌、肝、腦和皮膚(Hitt等，1997；Anderson，1998)和以及向腫瘤細胞轉(zhuǎn)移基因(Moutain，2000)。
另一種優(yōu)選的載體是腺相關(guān)病毒(AAV)載體。AAV載體為業(yè)內(nèi)人士所知并已用于基因治療中穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)人T淋巴細胞，成纖維細胞、鼻息肉、骨骼肌、腦、類紅細胞和造血干細胞(Philip等，1994；Russell等，1994；Flotte等，1993；Walsh等，1994；Miller等，1994；Emerson，1996)。國際專利申請WO 91/18088描述了具體的基于AAV的載體。
優(yōu)選的游離型載體包括暫時不復(fù)制的游離載體和具有病毒來源的復(fù)制功能的自身復(fù)制型游離載體，所述病毒包括EBV，人乳多空病毒(BK)和BPV-1。
這樣的整合型和游離型載體對業(yè)內(nèi)人士是熟知的，并在業(yè)內(nèi)熟知的文獻中有完整的描述。具體而言，合適的游離型載體的描述見于WO98/07876。
哺乳動物人工染色體也可在本發(fā)明中用作載體。哺乳動物人工染色體的使用有關(guān)的討論參見Calos(1996)。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。該質(zhì)粒可以是不能復(fù)制和不能整合的質(zhì)粒。
此處使用的術(shù)語“質(zhì)粒”意指任何編碼可表達的基因的核酸，包括線狀或環(huán)狀的核酸及雙鏈或單鏈的核酸。核酸可以是DNA或RNA，并可以包括修飾過的核苷酸或核糖核苷酸，以及可以是通過甲基化或包含保護基團或加帽或加尾等途徑而經(jīng)化學修飾過的。
不能復(fù)制和不能整合的質(zhì)粒是一種核酸，當其轉(zhuǎn)染宿主細胞后不能復(fù)制，也不能特異性的整合到宿主的基因組中(即，不能以高頻率整合，且不能整合在特定位點)。
復(fù)制型質(zhì)粒的鑒定利用標準分析，包括Ustav等(1991)的標準復(fù)制檢測方法。
本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)染有本發(fā)明的載體的宿主細胞。該宿主細胞可以是哺乳類細胞。優(yōu)選的是嚙齒動物或哺乳動物細胞。
很多已知的技術(shù)可以用在本發(fā)明作為運送所述的載體至細胞中，包括使用核酸縮合劑，電穿孔，配合使用石棉、凝聚胺(polybrene)、DEAE纖維素、右旋糖苷、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、脂聚胺、聚鳥氨酸、顆粒轟擊和直接微注射(Kucherlapati和Skoultchi綜述，1984；Keown等1990)。
本發(fā)明的載體可以通過病毒或非病毒的轉(zhuǎn)移方式被非特異性或特異性(即轉(zhuǎn)移到指定的宿主細胞部分)轉(zhuǎn)移到宿主細胞。優(yōu)選的源自病毒的轉(zhuǎn)移方法包括使用產(chǎn)生病毒粒子的包裝細胞系作為本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)染受體，該受體中病毒包裝信號已被改造，所述的病毒如腺病毒，皰疹病毒和乳多空病毒。優(yōu)選的源自非病毒的基因轉(zhuǎn)移機制也可用于本發(fā)明中并包括直接的裸核酸注射，核酸縮合肽和非肽、陽離子脂質(zhì)體和在脂質(zhì)體中進行封裝。
載體直接轉(zhuǎn)移到組織中已有描述，也獲得一些短期的基因表達。載體直接轉(zhuǎn)移到肌肉(Wolff等，1990)，甲狀腺(Sikes等，1994)，黑色素瘤(Vile等，1993)，皮膚(Hengge等1995)，肝(Hickman等，1994)，和暴露在呼吸道上皮后(Meyer等，1995)是現(xiàn)有技術(shù)清晰描述的。
來自于病毒外膜蛋白的氨基酸序列的不同的肽段被用于基因轉(zhuǎn)移中與聚賴氨酸DNA復(fù)合物共同施用(Plank等，1994，Trubetskoy等，1992；WO91/17773；WO92/19287和Mack等，1994)，表明聚賴氨酸偶聯(lián)物與陽離子脂類的共縮合能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移效率的提高。國際專利申請WO95/02698公開了使用病毒組分以試圖提高陽離子脂類基因轉(zhuǎn)移效率。
本發(fā)明中有效的核酸縮合劑包括精胺、精胺衍生物、組蛋白、陽離子肽、陽離子非肽如聚乙烯亞胺(PEI)和聚賴氨酸?！熬费苌铩笔侵妇返念愃莆锖脱苌铮约鞍▏H專利中請WO93/18759中列出的化合物(公布于1993年9月30日)。
二硫鍵被用來連接轉(zhuǎn)移介質(zhì)的肽組分(Cotton等，1992)，參見Trubetskoy等(同上)。
轉(zhuǎn)移DNA結(jié)構(gòu)到細胞的轉(zhuǎn)移介質(zhì)是業(yè)內(nèi)所知的，包括對細胞表面受體特異的DNA/聚陽離子復(fù)合物，描述見于，如Wu和Wu(1988)，Wilson等(1992)和美國專利No.5,166,320。
根據(jù)本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)移通過使用核酸縮合肽而實現(xiàn)。核酸縮合肽描述見于國際專利申請WO 96/41606，其對縮合載體和將載體轉(zhuǎn)移到細胞特別有效。官能團可以結(jié)合到本發(fā)明所述的用于載體轉(zhuǎn)移的肽上，如WO96/41606中所述。這些官能團包括靶向到特定細胞類型的配體，如單克隆抗體，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、唾液酸糖蛋白或糖。上述配體可以根據(jù)細胞類型的限制，以特異或非特異的方式靶向到細胞。
官能團還可以包括脂類，如棕櫚酰脂、油脂或硬脂酰脂；和中性親水的聚合物如聚乙二醇(PEG)，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；致溶血的肽，如流感病毒的HA肽；或重組酶或整合酶。官能團還可以包括細胞內(nèi)運輸?shù)鞍?trafficking protein)，如核定位序列(NLS)，內(nèi)涵體逃逸信號，如膜破壞蛋白，或指引蛋白直接到細胞質(zhì)的蛋白。
因此，本發(fā)明提供含有編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸序列，和編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白或應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達誘導(dǎo)因子的的多核苷酸序列產(chǎn)品。所述的應(yīng)激反應(yīng)蛋白包括如NF-κB、B1組高泳動性類蛋白(HBGB-1)、細胞因子如IL-1β，IL-1α，IL-6，IL-8，TNF-α，GM-CSF，IL-12和IL-15；和熱休克蛋白如Hsp70，Hsp90，Hsp110，鈣網(wǎng)膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝桿菌Hsp65，肺炎軍團桿菌Hsp60，大腸桿菌GroEL和GroES；應(yīng)激蛋白表達誘導(dǎo)因子包括HSF-1、HSF-2、HSF-3、IRF-1和IRF-2。
在一個優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選的毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶能壞死性殺死細胞。術(shù)語“壞死性”和“壞死性細胞死亡”包括所有形式的非程序性或調(diào)亡的細胞死亡。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，上述產(chǎn)品用于增強免疫應(yīng)答，特別是抗腫瘤的免疫應(yīng)答。
在另外的實施方案中，編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸序列，和編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白或應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸序列都是單個多核苷酸分子的組分。在另一個實施方案中，上述序列位于不同的多核苷酸序列中，可以同時或連續(xù)地給藥。
優(yōu)選地，毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶，或者是細胞色素P450酶，優(yōu)選源自哺乳動物的，更優(yōu)選來自人的，最優(yōu)選為人的CYP1A2或者是人的CYP2E1或CYP3A4。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，編碼的酶是嚙齒動物細胞色素P450，優(yōu)選小鼠的。最優(yōu)選的，是小鼠CYP1A2、CYP2E1或CYP3A4。
優(yōu)選地，多核苷酸編碼的應(yīng)激反應(yīng)蛋白是熱休克蛋白。更優(yōu)選，熱休克蛋白選自Hsp70，Hsp90，Hsp110，鈣網(wǎng)膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝桿菌Hsp65，肺炎軍團桿菌Hsp60，大腸桿菌GroEL和GroES，最優(yōu)選的是Hsp70。或者，多核苷酸編碼應(yīng)激蛋白表達誘導(dǎo)因子，其能誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達。優(yōu)選地，其選自熱休克因子-1(HSF-1)，熱休克因子-21(HSF-2)，熱休克因子-3(HSF-3)，干擾素反應(yīng)因子-1(IRF-1)，或干擾素反應(yīng)因子-2(IRF-2)。
在第二方面，本發(fā)明提供含有上述產(chǎn)品的DNA疫苗?！癉NA疫苗”是指能引發(fā)或增強治療性免疫反應(yīng)的物質(zhì)，其包括一個或多個編碼并能表達蛋白或肽段具有免疫原性或佐劑性質(zhì)的多核苷酸。
第三方面，DNA疫苗包括編碼用以增強抗腫瘤免疫應(yīng)答的毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸。優(yōu)選地，毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶為能活化前體藥物CB1954的硝基還原酶?；蛘?，毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是細胞色素P450。優(yōu)選地，該細胞色素P450選自人CYP1A2、人CYP2E1，人CYP3A4，嚙齒動物CYP1A2，嚙齒動物CYP2E1，和嚙齒動物CYP3A4。
優(yōu)選地，所述毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶能誘導(dǎo)壞死性細胞死亡。
本發(fā)明的第四方面在于提供含有編碼能活化前體藥物CB1954的硝基還原酶的多核苷酸，和編碼免疫刺激分子的多核苷酸的組合物，用于增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。術(shù)語“免疫刺激”包括能作為免疫抑制因子或效應(yīng)的抑制劑的因子，如IL-10和TGF-β。
優(yōu)選地，免疫刺激分子選自GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，B7-2，TNFα，γ-IFN，MCP-1，MIP-2RANTES，TGF-β，CD154(CD40配體)，CD134配體(OX40L)，I型MHC，II型MHC，CD135配體(Flt3L)，TNF相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)受體(TRAIL，Apo-2配體)。
本發(fā)明的具體實施方案為編碼下列用于增強免疫應(yīng)答的物質(zhì)的載體a)毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶，和b)應(yīng)激反應(yīng)蛋白優(yōu)選地，免疫應(yīng)答為抗腫瘤免疫應(yīng)答。
還優(yōu)選地，應(yīng)激反應(yīng)蛋白是熱休克蛋白。更優(yōu)選地，熱休克蛋白選自Hsp70，Hsp90，Hsp110，鈣網(wǎng)膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝桿菌Hsp65，肺炎軍團桿菌Hsp60，大腸桿菌GroEL和GroES。最優(yōu)選的是Hsp70。
優(yōu)選地，毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶為能活化前體藥物CB1954的硝基還原酶。最優(yōu)選，載體為CTL102/mCMV-mHSP70，如

圖1所示。
或者，可以是細胞色素P450酶，優(yōu)選為源自哺乳動物，更優(yōu)選源自人，最優(yōu)選為人的CYP1A2?；蛘邽槿薈YP2E1或人CYP3A4。
在另一優(yōu)選的實施方案中，編碼的酶為嚙齒動物細胞P450，優(yōu)選來自小鼠，最優(yōu)選的為小鼠CYP1A2，CYP2E1或CYP3A4。
進一步優(yōu)選，任何上述的載體具有一種或兩種下列多核苷酸序列其一方面編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶，另一方面編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白或應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達誘導(dǎo)因子，并可操作連接至一個或多個提供腫瘤選擇性表達的啟動子。
這里使用的術(shù)語“可操作連接”，是指將欲表達的基因通過順式連接受啟動子控制。
優(yōu)選的腫瘤選擇性啟動子包括TRP-1，HER2，HER3，ERBB2，ERBB3，CEA，MUC-1，α胎蛋白，前列腺特異性抗原(PSA)，絨毛蛋白，胰淀粉酶，酪氨酸酶相關(guān)肽，腫瘤排斥抗原前體和T細胞因子(TCF)反應(yīng)性啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子包括一個或多個TCF反應(yīng)性元件。
TCFs是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，屬于高泳動性組(HMG)的DNA結(jié)合蛋自(Love等，Nature，376，791-795，1995)。該家族包括TCF-1，TCF-3和TCF-4，它們在van der Wetering等(EMBOJ.，10，123-132，1991)，EP-A-0939122和Korinek等(Science，275，1784-1787，1997)中有描述。TCF-4顯示參與Wnt/Wingless信號傳導(dǎo)相關(guān)的腫瘤發(fā)生。TCF和LEF-1(淋巴增強因子-1)被認為通過與β-連環(huán)蛋白相互作用介導(dǎo)針對Wnt信號的核反應(yīng)。Wnt信號傳導(dǎo)和其他增加β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定性的細胞事件據(jù)信通過與β-連環(huán)蛋白相關(guān)的LEF-1和TCF蛋白能導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄激活。在沒有Wnt信號傳導(dǎo)的情況下，LEF-1/TCF蛋白抑制與Groucho和CBP(CREB結(jié)合蛋白)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄。
在沒有Wnt信號傳導(dǎo)的情況下，β-連環(huán)蛋白被發(fā)現(xiàn)存在于兩個不同的多蛋白復(fù)合物中。一個復(fù)合物定位在細胞質(zhì)膜上，將鈣粘著蛋白(鈣依賴的吸附分子)與肌動蛋白細胞骨架交聯(lián)，而另一個復(fù)合物(包括結(jié)腸腺瘤性息肉蛋白(APC)，蟲漆脂，糖原合成酶激酶3β(GSK3β))靶向β-連環(huán)蛋白使其降解。Wnt信號傳導(dǎo)拮抗APC-蟲漆脂-GSK3β復(fù)合物，造成細胞質(zhì)內(nèi)游離β-連環(huán)蛋白水平的升高。游離胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白能重定位到細胞核，在那里結(jié)合LEF-1/TCF因子并激活Wnt靶基因。Wnt和其他信號對LEF-1/TCF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控討論見于Eastman等(Current Opin.Cell Biology，11，233-240，1999)。
TCFs已知可以識別并結(jié)合TCF結(jié)合元件，該結(jié)合元件具有核苷酸序列CTTTGNN，其中N表示A或T(van der Wetering等，同上)。
TCF反應(yīng)性元件已顯示能提供可操作連接的基因在腫瘤中的高選擇性表達，尤其是在結(jié)腸和肝臟的腫瘤中(WO01/64379)。
優(yōu)選地，載體是病毒載體，更優(yōu)選地，是腺病毒載體。特別優(yōu)選的實施方案是編碼和允許表達能活化前體藥物CB1954的硝基還原酶和(b)hsp70，用以增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。最優(yōu)選是CTL102/mCMV-mHSP70。
或者，病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更優(yōu)選為慢病毒載體。
另一個實施方案是含有上述任意載體的宿主細胞。
本發(fā)明的另一方面是含有上述相關(guān)產(chǎn)品或組合物、載體或宿主細胞的疫苗。
還提供上述相關(guān)產(chǎn)品或組合物、載體或宿主細胞用作藥劑或疫苗。
本發(fā)明的另一方面是藥物組合物，其含有上述的任意產(chǎn)品或相關(guān)的組合物，DNA疫苗，載體或宿主細胞和可藥用的稀釋劑，緩沖液，佐劑或賦形劑。
同樣提供的上述任意產(chǎn)品，相關(guān)的組合物，DNA疫苗，載體或宿主細胞在制備用于治療癌癥的藥劑或用于治療癌癥的疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供增強免疫應(yīng)答的方法，包括給藥治療量的含有編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸和編碼熱休克蛋白或熱休克蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸的產(chǎn)品。優(yōu)選地，免疫應(yīng)答是抗腫瘤免疫應(yīng)答。
還提供治療患有某種癌癥的病人的方法，包括給藥治療量的含有編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸和編碼熱休克蛋白或熱休克蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸的產(chǎn)品。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括給藥治療量的含有編碼能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶的多核苷酸和編碼熱休克蛋白的多核苷酸的產(chǎn)品，經(jīng)一段時間上述產(chǎn)品進入腫瘤細胞，編碼的硝基還原酶和熱休克蛋白被表達，然后給藥治療量的CB1954。
或者，該方法包括給藥治療量的含有編碼細胞色素P450的多核苷酸和編碼熱休克蛋白的多核苷酸的產(chǎn)品，經(jīng)一段時間上述產(chǎn)品進入腫瘤細胞，編碼的細胞色素P450和熱休克蛋白被表達，然后給藥治療量的前體藥物。優(yōu)選的前體藥物是對乙酰氨基酚。
上述方法中優(yōu)選的熱休克蛋白是Hsp70。
本發(fā)明的另一方面提供了治療患某種癌癥的病人的方法，包括給藥治療量的含有編碼熱休克蛋白的多核苷酸的產(chǎn)品，和治療量的抗腫瘤細胞毒性藥物，以誘導(dǎo)治療性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。
在優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤細胞毒性藥物能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的壞死性死亡。
在本發(fā)明的最后一方面，提供引發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的方法，包括給藥治療量的含有編碼能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶的多核苷酸的產(chǎn)品，經(jīng)一段時間上述物質(zhì)進入腫瘤細胞，編碼的硝基還原酶被表達，然后給藥治療量的CB1954。
本發(fā)明的該產(chǎn)品、DNA疫苗，載體或宿主細胞或藥物組合物可以通過全身，肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、氣溶膠、口服(液體或固體形式)、局部、眼部、栓劑、腹膜內(nèi)和/或胸內(nèi)和局部的直接注射等途徑而被施用。
該療法的確切劑量當然需要由臨床醫(yī)生根據(jù)病人的具體情況來決定，而這反過來，又受控于治療性基因表達的蛋白具體性質(zhì)和將接受治療的靶組織的類型。
劑量還依賴于疾病指征和藥物給藥的途徑。
根據(jù)本發(fā)明，為實現(xiàn)有效治療的目的，核酸構(gòu)建體或載體的轉(zhuǎn)移量優(yōu)選為在大約50ng-1000μg載體DNA/每公斤體重的范圍，更優(yōu)選的在大約1-100μg載體DNA/公斤的范圍。
盡管根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選在哺乳動物給藥核酸構(gòu)建體，載體或宿主細胞，使其在體內(nèi)被細胞吸收；但離體方法也可以應(yīng)用，其中從動物取出的細胞被核酸構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后回輸?shù)絼游矬w內(nèi)。
附圖簡述圖1
腺病毒血清型5(Ad5)E1的重組腺病毒的結(jié)構(gòu)。所有的病毒都刪除了所示的E1和E3病毒區(qū)域。E1刪除包括Ad5病毒基因組的359-3524位核苷酸，而E3刪除了28,592-30,470位核苷酸。HCMV人CMV(巨細胞病毒)；IE(立即早期)增強子/啟動子；NTR大腸桿菌硝基還原酶基因；IVSII人β珠蛋白內(nèi)含子II序列；mCMV小鼠巨細胞病毒IE增強子/啟動子；mHSP70小鼠熱休克蛋白70；SV40SV40晚期poly(A)信號；mGM-CSF小鼠粒細胞-集落刺激因子。
圖2.
受腺病毒載體感染的細胞裂解物中NTR，mHSP70和mGM-CSF的Western印跡分析。
(A)以感染復(fù)數(shù)(MOI)增高的病毒Ad.mCMV-mHSP70(泳道3-5)，或CTL102/mCMV-mHSP70(泳道8-10)感染CMT93細胞(不表達內(nèi)源HSP70)。CTL102感染的細胞提取物用作NTR表達的陽性對照。Ad.CMV-LacZ感染的細胞的提取物(泳道2)用作陰性對照。
(B)以Ad.mCMV-mGM-CSF(泳道2)或Ad.CMV-LacZ(泳道1，陰性對照)感染Hela細胞。
在感染后24小時制備全細胞提取物。用50μg蛋白裂解物進行變性SDS-PAGE，下游的處理于材料和方法中描述。Biorad分子量標準用來確定表達的蛋白是否具有期望的大小。
圖3.
免疫接種方案圖4.
A.用5.0×103和5.0×104Ad.hCMV-NTR-轉(zhuǎn)導(dǎo)(CTL102)的4T1細胞單次免疫接種和體內(nèi)CB1954處理，小鼠產(chǎn)生對5.0×103親本4T1細胞攻擊的保護。對小鼠的攻擊發(fā)生在免疫接種后21天(空心棒)或80天(實心棒)。
B.用5.0×103或5.0×104個CTL102-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞單劑量免疫接種和體內(nèi)CB1954處理之后21天，小鼠不產(chǎn)生對5.0×104個EJ6細胞攻擊的保護，EJ6細胞是無關(guān)的腫瘤細胞系。
棒顯示強制處死時，有保護作用的受攻擊的個體腫瘤大小與對照組幼稚小鼠平均腫瘤大小的百分比。
圖5.
A.在分別用a)5.0×104Ad.hCMV-NTR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的(CTL102)4T1細胞及CB1954處理，(b)5.0×104Ad.hCMV-NTR/mCMV-mHSP70-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理，(C)5.0×105CTL102-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB 1954處理和(d)5.0×105個Ad.hCMV-NTR/mCMV-mHSP70-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理的免疫接種的單個BALB/c小鼠接受腫瘤細胞攻擊30天后的腫瘤大小。免疫接種后21天，所有的小鼠用5.0×103個親本4T1細胞攻擊，及一組幼稚小鼠(e)。
B.圖顯示處理組的平均腫瘤大小。
C.用5.0×105個CTL102-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理，5.0×105Ad.mCMV-mHSP70-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理，和5.0×105個Ad.hCMV-NTR/mCMV-mHSP70-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理而免疫接種的小鼠存活率。免疫接種后21天，所有的小鼠用5.0×103個親本4T1細胞攻擊，及一組幼稚小鼠。
圖6.
A在分別用(a)5.0×105個Ad.hCMV-NTR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的(CTL102)4T1細胞及CB1954處理，(b)5.0×105個CTL102+Ad.mCMV-mHSP70-轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理，(c)5.0×105Ad.mCMV-mGM-CSF轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理以及(d)5.0×105個CTL102+Ad.mCMV-mGM-CSF轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞及CB1954處理而免疫接種的單個BALB/c小鼠在接受腫瘤細胞攻擊30天后的腫瘤大小。免疫接種后21天，所有的小鼠用5.0×103個親本4T1細胞攻擊，及一組幼稚小鼠(e)。
B圖顯示處理組的平均腫瘤大小。
發(fā)明詳述以下列實施例來詳細描述本發(fā)明。這些實施例用作舉例說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1材料和方法細胞培養(yǎng)4T1，小鼠乳癌細胞，獲自ATCC(CRL-2539)。EJ-6-2-Bam-6a獲自ATCC(CRL-1888)，并通過用人EJ膀胱癌細胞DNA轉(zhuǎn)染NIH/3T3而產(chǎn)生。PER.C6細胞(lit)獲自IntroGene(Leiden，荷蘭)。911細胞由L.Young教授提供(CRC癌癥研究所，伯明翰大學，英國)，于含10％FCS，10mM MgCl2和抗生素的DMEM培養(yǎng)液中維持。4T1和EJ-6-2-Bam-6a采用提供者建議的方式培養(yǎng)。
質(zhì)粒構(gòu)建pTX0374通過克隆含有連接到大腸桿菌ntr基因(NTR從基因組DNA擴增到的大腸桿菌B/r硝基還原酶基因)的人CMV啟動子的1.6kbBglII-BamHI片段到pSW107而構(gòu)成。pRAJ 43BP4是含有小鼠GM-CSF cDNA的pUC19質(zhì)粒，由L.Young教授惠贈(CRC癌癥研究所，伯明翰大學，英國)。CET902是含有小鼠CMV IE增強子/啟動子和SV40晚期poly(A)信號的pUC19質(zhì)粒。
CET902/mCMV-mHSP70含有應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠HSP70蛋白的表達盒，以如下方式構(gòu)建。首先將小鼠全長(1.4.kb)CMV啟動子克隆到源自pUC19的載體。然后SV40晚期poly(A)信號被克隆到啟動子的下游。最后，編碼小鼠HSP70的cDNA通過Smal位點被克隆到啟動子和poly(A)信號之間。含有小鼠HSP70的cDNA的質(zhì)粒由R.Vile博士惠贈(分子醫(yī)學項目，Mayo Clinic，200第一大街SW，羅切斯特，明尼蘇達，美國)，切成NheI/BamHI片段并以T4DNA聚合酶平末端處理。
CET902/mCMV-mGM-CSF得自于用EcoR I and Bam HI消化處理pRAJ 43 BP4釋放出465bp的片段。該片段是平末端，連接到Smal處理的CET902。
pPS1128由P.Searle博士惠贈(CRC癌癥研究所，伯明翰大學，英國)。pPS1128含有腺病毒序列從左側(cè)反向末端重復(fù)(ITR)到359位核苷酸和從3525到10,589位核苷酸，因此是E1-缺失的載體。pPSl128的構(gòu)建方法是將連接到240bp含poly(A)添加物和人補體C2基因的轉(zhuǎn)錄終止信號的Hinc II至BamHI片段上的人β珠蛋白基因的917bp片段(2號外顯子Bam HI位點至3號外顯子Eco R1位點)，克隆到pBluescript質(zhì)粒(Stratagene)中。該質(zhì)粒構(gòu)建分兩個階段。首先，pPS971質(zhì)粒(Weedon等，Int.J.Cancer，待出版)的左側(cè)EcoR I位點被轉(zhuǎn)化為Swal位點以生成pPS115。然后pPS115的長為350bp Spe 1-Afl II片段被下面兩條寡核苷酸退火形成的接頭所代替5′-CTAGTATCGATTGTTAATTAAGGGCGTGGCC-3′和5′-TTAAGGCCACGCCCTTAATTAACAATCGATA-3’。
pPS1022的構(gòu)建是將pPS972左側(cè)的EcoRI位點轉(zhuǎn)化為SwaI位點而實現(xiàn)。
pTX0375，用于生成CTL102的轉(zhuǎn)移載體，其構(gòu)建方法為將橫跨整個表達盒(hCMV-NTR-IVSII-p(A))的SpeI片段從pTX0374克隆到SpeI消化的pPS1128質(zhì)粒，并鑒定含有從左向右方向的表達盒的克隆。pPS 1128/mCMV-mHSP70和pTX0375/mCMV-mHSP70的構(gòu)建方法為將mCMV-mHSP70-SV40p(A)表達盒從CET902/mHSP70分別轉(zhuǎn)移到平末端化的pPS1128或轉(zhuǎn)移到平末端化的pTX0375的Pacl位點。mCMV-mHSP70-SV40p(A)表達盒通過用Xmn I，Asc I和BstZ17I消化CET902/mHSP70質(zhì)粒以及用T4DNA聚合酶平末端化而制備。因此最后的表達盒只含有大約500bp小鼠CMV啟動子，這一片段提供了它絕大多數(shù)的活性。pPS118/mCMV-mGM-CSF的構(gòu)建方法是將從CET902/mCMV-mGM-CSF制備(經(jīng)BstZ17I和Ascl消化并平末端化)的完整表達盒(1.3kb)克隆到pPS1128。
腺病毒“骨架”載體pPS1160的構(gòu)建方法是用Pac I線性化處理pPS 1128，與含有Xbal位點的適合Pac I的接頭(寡核苷酸15′-TACATCTAGATAAT-3’；寡核苷酸25′-TTATCTAGATGTA-3′)連接，接著用Xba I消化釋放約為7kb的含有3524-10589位Ad5序列的Xba I片段。然后將其克隆進Xba I線性化的pPS1022(Peter Searle博士)，這是一種源自pUC18的質(zhì)粒，含Ad5序列的10,589位至右側(cè)反向末端重復(fù)(ITR)但缺失28,592-30,470位核苷酸序列(E3區(qū)域)。
腺病毒載體構(gòu)建重組病毒CTL102(Ad.hCMV-NTR)，CTL102/mCMV-mHSP70，Ad.mCMV-mHSP70和Ad.mCMV-mGM-CSF在Per.C6細胞中通過同源重組而構(gòu)建。這些細胞分別以pTX0375，pTX0375/mCMV-mHSP70，pPS 1128/mCMV-HSP70或pPS 1128/mCMV-mGM-CSF與pPS 1160的等摩爾混合物共轉(zhuǎn)染到90％匯合的PER.C6細胞。重組病毒在大約7天后經(jīng)感染培養(yǎng)基(DMEM，1％FCS，2mM MgCl2)3次反復(fù)凍融而收獲。通過重復(fù)的感染/收獲循環(huán)，病毒大量擴增然后經(jīng)標準的CsCl密度離心純化，對過量的保存緩沖液(10mM Tris pH7.4，140mM NaCl，5mM KCl，0.6mM Na2HPO4，0.9mM CaCl2，0.5mM MgCl2和5％蔗糖)透析，最后在液氮中快速冷凍，并保存于-80℃。病毒粒子含量通過BCA蛋白分析試劑(Perbio Science UK，LTD，Tattenhall，Cheshire，UK)測定。空斑形成單位(p.f.u.)滴度通過在911細胞上的空斑試驗來測定。
4T1體外感染4T1細胞在加濕的CO2培養(yǎng)箱中以1×107/ml的細胞密度以給定的每細胞p.f.u.(感染復(fù)數(shù)，MOI)于感染培養(yǎng)基(常規(guī)培養(yǎng)基，但只含1％FCS)進行感染。在感染過程中每30分鐘輕柔晃動細胞。然后收集細胞(300×g，5分鐘)，洗滌之后重懸于PBS。免疫接種實驗中感染復(fù)數(shù)為200到300，并使用病毒混合物，載體的最終劑量保持恒定以避免劑量依賴的細胞病變效應(yīng)。
Western印跡分析在感染培養(yǎng)基中于37℃，5％CO2的條件下通過孵育2小時用給定的感染復(fù)數(shù)感染3×105個HeLa細胞。然后細胞用完全培養(yǎng)基(10％FCS)培養(yǎng)24小時。接著用PBS洗滌細胞，每6孔加入200μl RIPA緩沖液(10mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1.0％NP40，0.1％SDS，0.5％脫氧膽酸鈉加上完整的蛋白酶抑制劑混合物，Roche)制備全細胞裂解物。將細胞在在室溫孵育10分鐘，然后于4℃以13,000RPM離心。裂解物上清液轉(zhuǎn)移到新管中，用Biorad DC蛋白分析試劑盒(Hercules，CA，USA)測定蛋白濃度。取每個裂解樣本30μg采用High Rainbow蛋白質(zhì)分子量標準(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)通過11％SDS-PAGE進行測定。然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(GelmanSciences，Ann Arbor，MI，USA)，以TBS(10mM Tris pH7.5，150mMNaCl)/0.1％Tween20/5％奶粉在室溫下封閉1小時。以如下方式用封閉緩沖液稀釋第一抗體羊抗-NTR(多克隆抗體，Dyfed，UK)，1∶2000，小鼠抗-HSP70(SPA-810，Stressgen Biotechnologies，Victoria BC，Canada)，1∶1000和山羊抗GM-CSF(SantaCruz，CA，USA；sc-1322)，1∶1000。用第一抗體在室溫下孵育膜1小時，然后充分洗滌，并于室溫下以如下第二抗體的TBS/0.1％Tween20/0.5％奶粉孵育30分鐘驢抗綿羊-HRP(1∶7,500；Sigma)，抗小鼠-HRP(1∶10,000；SIGMA A-9917)和抗山羊-HRP(Sigma，A-5420)。經(jīng)充分洗滌，用Pierce“超信號West Pico化學發(fā)光底物”(Perbio Science UK Ltd.，Tattenhall，UK)進行增強的化學發(fā)光，然后以Alpha Innotech Imager Model 2.3.1分析。
小鼠雌性BALB/c小鼠(H-2d，6-8周齡)獲自Harlan(Oxion，UK)，維持在控制溫度、有光周期的房間中，隨意獲取食物和水。小鼠可以在進行任何處理之前休息一周。管理和實驗程序完全遵守英國內(nèi)政部規(guī)章。
鼠腫瘤模型4T1是高度攻擊性和轉(zhuǎn)移性的來自乳腺癌的成熟細胞系，其能在BALB/cfC3H小鼠中自發(fā)的產(chǎn)生(Dexter等，1978)。表達H-2dI類但不表達II類分子的4T1細胞系是非免疫原性的腫瘤模型，不能在體內(nèi)或體外刺激產(chǎn)生同系的抗腫瘤反應(yīng)。在BALB/c小鼠中最少100％腫瘤誘導(dǎo)劑量是5×102個細胞。當皮下注射到能主要自發(fā)轉(zhuǎn)移到肺的BALB/c小鼠體內(nèi)時，4T1細胞產(chǎn)生攻擊性的實體瘤，而原發(fā)腫瘤在原位生長。成纖維細胞系EJ-6-2-Bam-6a(Shih等，1981)被用作對照腫瘤。
免疫接種程序指定數(shù)量的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細胞皮下注射到每只幼稚小鼠的體右側(cè)，總量為100μl(第0天)。不同的實驗組用單個或不同組合的含硝基還原酶和/或共刺激因子的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞進行注射。經(jīng)過一段時間體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達，第二天表達達到最大，在小鼠腫瘤周圍注射總體積為500μl的400μM CB1954溶液。除另有說明，在第21天，對所有的小鼠在身體對側(cè)第二次注射5.0×103親本4T1細胞。該劑量比幼稚小鼠的最小致死劑量高10倍。一組幼稚小鼠也同時注射了上述細胞。免疫接種后80天進行攻擊顯示誘導(dǎo)長期抗腫瘤免疫反應(yīng)。所有組的小鼠在任一次實驗中都在同一天用同樣制備的細胞進行攻擊。定期對動物進行觸診以檢查腫瘤的出現(xiàn)，其后每周2-3次以游標卡尺測量腫瘤的兩個垂直方向的大小。腫瘤大小表示成個體腫瘤的兩個直徑的乘積。出于人道主義的考慮，當小鼠顯示垂死癥狀，腫瘤變得過分壞死或腫瘤大小超過160mm2時，將其從組中剔除。
結(jié)果
CTL102/CB1954對4T1的殺傷能誘導(dǎo)對4T1細胞攻擊顯著和持久的保護為證明原位的NTR/CB1954腫瘤細胞殺傷對特異的抗腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)生有一定作用，進行免疫接種實驗。在最優(yōu)化的試驗下建立最適的殺傷條件，其中細胞接種的利量范圍是(5.0×102到5.0×106NTR-表達的4T1細胞)，隨后在體內(nèi)用從100到400μM逐步增加的CB1954劑量進行實驗(數(shù)據(jù)未顯示)，免疫接種無瘤小鼠。在分別以5.0×103或5.0×104個NTR-表達的4T1細胞免疫接種的兩組小鼠中，將未接受首次接種的腫瘤細胞的小鼠用5.0×103個未修飾的4T1細胞在細胞接種21天后在身體對側(cè)進行攻擊。同樣在免疫接種小鼠80天后對其進行攻擊實驗，以評估長期抗腫瘤免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。所有幼稚小鼠至第10天產(chǎn)生進行性發(fā)展的腫瘤，并在攻擊后第25天達到強制處死的程度。在接種有NTR/CB1954殺傷的細胞的小鼠中觀察到免疫劑量依賴的排斥攻擊物的反應(yīng)，該反應(yīng)與攻擊的次數(shù)無關(guān)(圖4A)。用5.0×103個細胞低劑量免疫接種比之前未接種過的小鼠賦予低的保護水平，而高劑量(5.0×104)免疫顯著增強4T1細胞的免疫接種原性，并保護大多數(shù)小鼠免受攻擊。
為評估NTR/CB1954殺傷疫苗保護作用的特異性，對免疫接種有5.0×103或5.0×104個表達NTR的4T1細胞的小鼠以另一同系的腫瘤EJ6進行攻擊，EJ6是小鼠纖維肉瘤。以4T1細胞免疫接種的小鼠不能保護所有小鼠免遭EJ6攻擊(圖4B)。
通過表達小鼠HSP70共刺激分子增強NTR/CB1954殺傷的抗腫瘤免疫為測定免疫接種模型中NTR/CB1954殺傷的效果能否因表達共刺激分子HSP70而提高，用轉(zhuǎn)導(dǎo)有攜帶NTR基因的單重組病毒或攜帶NTR及HSP70基因雙重組病毒的4T1細胞對小鼠進行單次免疫。在第2天在動物的腫瘤周圍注射CB1954，然后在對側(cè)用5.0×103個未修飾的4T1細胞進行攻擊(參見免疫程序)。免疫接種過程使用兩種不同的劑量，低劑量5.0×104，高劑量5.0×105。所有的動物在細胞接種后21天以5.0×103個未修飾的4T1細胞進行攻擊，隨后觀測腫瘤出現(xiàn)，生長，和存活率。這些結(jié)果表明NTR/CB1954對表達HSP70的細胞殺傷比單獨以NTR/CB 1954殺死的細胞接種的小鼠更能有效引發(fā)免疫應(yīng)答(圖5A)。高的接種細胞數(shù)量看起來可以更好的保護小鼠免受其后4T1細胞的攻擊。因此，接種有表達NTR-HSP70的細胞的動物表現(xiàn)出顯著的存活率(圖5C)。與之對照，接受表達NTR細胞的動物只表現(xiàn)出適中的存活優(yōu)勢，有一只無瘤小鼠存活時間超過3個月。只用表達HSP70的細胞接種和以CB1954處理不能保護任何小鼠在接種位置免于腫瘤的產(chǎn)生，該處產(chǎn)生進行性生長的腫瘤，約30天腫瘤大小達到可強制處死的程度，小鼠必須于細胞接種后21天的免疫時間之后不久被處死。
通過表達mGM-CSF共刺激分子增強NTR/CB1954殺傷的抗腫瘤免疫為評估GM-CSF的表達在免疫激活NTR/CB1954殺傷中的效果，4T1細胞用攜帶NTR和攜帶GM-CSF的腺病毒共同轉(zhuǎn)導(dǎo)，注射到小鼠體內(nèi)(5.0×105)，并在體內(nèi)以CB1954處理(參見免疫程序)。盡管GM-CSF單獨使用對攻擊具有顯著排斥效果，并且甚至優(yōu)于用NTR/CB1954殺傷細胞免疫接種的效果，但是在腫瘤環(huán)境中，在NTR/CB1954殺傷的同時存在GM-CSF會導(dǎo)致對攻擊更佳的保護，其中57％的小鼠在攻擊后30天排斥攻擊物(圖5A)。所有之前未免疫接種的小鼠在接受腫瘤攻擊后因為荷瘤在一個月之內(nèi)不得不處死。
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權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)品，含有編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸序列和編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白或應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的產(chǎn)品，用于增強免疫應(yīng)答。
3.權(quán)利要求1或2的產(chǎn)品，其中增強的免疫應(yīng)答是抗腫瘤反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1-3任一項的產(chǎn)品，其中編碼能夠誘導(dǎo)壞死性細胞死亡的毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸序列，和編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白或應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達誘導(dǎo)因子的的多核苷酸序列，都是單個多核苷酸分子的成分。
5.權(quán)利要求1-4任一項的產(chǎn)品，其中毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶。
6.權(quán)利要求1-4任一項的產(chǎn)品，其中毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是細胞色素P450。
7.權(quán)利要求5的產(chǎn)品，其中細胞色素P450選自人CYP1A2，人CYP2E1，人CYP3A4，嚙齒動物CYP1A2，嚙齒動物CYP2E1和嚙齒動物CYP3A4。
8.利要求1-7任一項的產(chǎn)品，其中編碼或誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)蛋白是熱休克蛋白。
9.權(quán)利要求8的產(chǎn)品，其中熱休克蛋白選自Hsp70，Hsp90，Hsp110，鈣網(wǎng)膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝桿菌Hsp65，肺炎軍團桿菌(Legionella pneumophila)Hsp60，大腸桿菌(Escherichiacoli)GroEL和GroES。
10.權(quán)利要求9的產(chǎn)品，其中熱休克蛋白是Hsp70。
11.DNA疫苗，含有權(quán)利要求1-10任一項的產(chǎn)品。
12.DNA疫苗，含有編碼用以增強抗腫瘤免疫應(yīng)答的毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸。
13.權(quán)利要求12的DNA疫苗，其中毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶。
14.權(quán)利要求13的DNA疫苗，其中毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是細胞色素P450。
15.權(quán)利要求14的DNA疫苗，其中細胞色素P450選自人CYP1A2，人CYP2E1，人CYP3A4，嚙齒動物CYP1A2，嚙齒動物CYP2E1和嚙齒動物CYP3A4。
16.含有編碼能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶的多核苷酸和編碼免疫刺激分子的多核苷酸的產(chǎn)品，用于增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。
17.含有編碼細胞色素P450的多核苷酸和編碼免疫刺激分子的多核苷酸的產(chǎn)品，用于增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。
18.權(quán)利要求16或17的產(chǎn)品，其中免疫刺激分子選自GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，B7-2，TNFα，γ-IFN，MCP-1，MIP-2，RANTES，TGF-β，CD154，CD134配體，I型MHC，II型MHC，CD135配體，和TRAIL。
19.編碼并表達下述用于增強免疫反應(yīng)的物質(zhì)的載體a)毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶和b)應(yīng)激反應(yīng)蛋白。
20.權(quán)利要求19的載體，其中免疫反應(yīng)是抗腫瘤反應(yīng)。
21.權(quán)利要求19或20的載體，其中應(yīng)激反應(yīng)蛋白是熱休克蛋白。
22.權(quán)利要求21的載體，其中熱休克蛋白選自Hsp70，Hsp90，Hsp110，鈣網(wǎng)膜蛋白，gp96，grp170，Hsp27，Hsc70，分枝桿菌Hsp65，肺炎軍團桿菌Hsp60，大腸桿菌GroEL和GroES。
23.權(quán)利要求22的載體，其中熱休克蛋白是hsp70。
24.權(quán)利要求19-23任一項的載體，其中毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶。
25.權(quán)利要求19-23任一項的載體，其中毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶是細胞色素P450。
26.權(quán)利要求25的載體，其中細胞色素P450選自人CYP1A2，人CYP2E1，人CYP3A4，嚙齒動物CYP1A2，嚙齒動物CYP2E1和嚙齒動物CYP3A4。
27.權(quán)利要求19-26任一項的載體，其中一方面是編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸序列，另一方面是編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白或應(yīng)激反應(yīng)蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸序列，在上述兩種多核苷酸序列中有一種或兩種可操作連接到一個或多個提供腫瘤選擇性表達的啟動子。
28.權(quán)利要求27的載體，其中啟動子包括一個或多個TCF反應(yīng)性元件。
29.權(quán)利要求19-29任一項的載體，其中載體是病毒載體。
30.權(quán)利要求29的載體，其中載體是腺病毒載體。
31.權(quán)利要求29的載體，其中載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
32.權(quán)利要求31的載體，其中載體是慢病毒載體。
33.編碼和表達下列用于增強抗腫瘤免疫反應(yīng)的物質(zhì)的腺病毒載體a)能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶，和b)hsp70。
34.含有權(quán)利要求19-33任一項的載體的宿主細胞。
35.一種疫苗，含有權(quán)利要求1-10或16-18任一項的產(chǎn)品，權(quán)利要求19-33任一項的載體，或權(quán)利要求34的宿主細胞。
36.權(quán)利要求1-10或16-18任一項的產(chǎn)品，權(quán)利要求10-15任一項的DNA疫苗，權(quán)利要求19-33任一項的載體，或權(quán)利要求34的宿主細胞，用作藥物。
37.權(quán)利要求1-10或16-18任一項的產(chǎn)品，權(quán)利要求19-33任一項的載體，或權(quán)利要求34的宿主細胞，用作疫苗。
38.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1-10或16-18任一項的產(chǎn)品，權(quán)利要求10-15任一項的DNA疫苗，權(quán)利要求19-33任一項的載體，或權(quán)利要求34的宿主細胞，以及可藥用的稀釋劑、緩沖液、佐劑或賦形劑。
39.權(quán)利要求1-10或16-18任一項的產(chǎn)品，權(quán)利要求10-15任一項的DNA疫苗，權(quán)利要求19-33任一項的載體，或權(quán)利要求34的宿主細胞在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
40.權(quán)利要求1-10或16-18任一項的產(chǎn)品，權(quán)利要求10-15任一項的DNA疫苗，權(quán)利要求19-33任一項的載體，或權(quán)利要求23的宿主細胞在制備用于治療癌癥的疫苗中的應(yīng)用。
41.一種增強免疫反應(yīng)的方法，包括給藥治療量的含有編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸和編碼熱休克蛋白或熱休克蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸的產(chǎn)品。
42.權(quán)利要求41的方法，其中免疫反應(yīng)是抗腫瘤免疫反應(yīng)。
43.一種治療患某種形式癌癥的病人的方法，包括給藥治療量的含有編碼毒素或前體藥物轉(zhuǎn)化酶的多核苷酸和編碼熱休克蛋白或熱休克蛋白表達誘導(dǎo)因子的多核苷酸的產(chǎn)品。
44.權(quán)利要求41-43任一項的方法，包括a)給藥治療量的含有編碼能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶的多核苷酸和編碼熱休克蛋白的多核苷酸的產(chǎn)品，b)一段時間后，上述產(chǎn)品進入腫瘤細胞，以及編碼的硝基還原酶和熱休克蛋白被表達，和c)給藥治療量的CB1954。
45.權(quán)利要求40-42任一項的方法，包括a)給藥治療量的含有編碼細胞色素P450的多核苷酸和編碼熱休克蛋白的多核苷酸的產(chǎn)品，b)經(jīng)過一段時間，上述產(chǎn)品進入腫瘤細胞，以及編碼的細胞色素P450和熱休克蛋白被表達，和c)給藥治療量的前體藥物。
46.權(quán)利要求43的方法，其中前體藥物是對乙酰氨基酚。
47.權(quán)利要求40-44任一項的方法，其中熱休克蛋白是Hsp70。
48.一種治療患某種形式癌癥的病人的方法，包括給藥治療量的含有編碼熱休克蛋白的多核苷酸的產(chǎn)品，和治療量的抗癌細胞毒性藥物，以誘導(dǎo)治療性抗腫瘤免疫反應(yīng)。
49.一種引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)的方法，包括a)給藥治療量的含有編碼能夠活化前體藥物CB1954的硝基還原酶的多核苷酸的產(chǎn)品，b)一段時間后，上述產(chǎn)品進入腫瘤細胞，以及編碼的硝基還原酶被表達，和c)給藥治療量的CB1954。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改進的誘導(dǎo)針對靶細胞的免疫反應(yīng)的方法。運用既表達毒素蛋白或前體藥物轉(zhuǎn)化酶來殺傷靶細胞型又表達應(yīng)激反應(yīng)蛋白(特別是熱休克蛋白)的基因療法，增強隨后產(chǎn)生的針對這些細胞的免疫反應(yīng)。這個方法特別適用于誘導(dǎo)針對癌細胞的免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供此方法中使用的多核苷酸、產(chǎn)品和載體。
文檔編號C12N15/861GK1705741SQ200380101398
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者卡伊·斯特凡·利平斯基, 哈基姆·德杰哈 申請人:Ml 實驗室公開有限公司