專利名稱：反饋抗性高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的制作方法
發(fā)明說明本發(fā)明涉及具有反饋抗性的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，含有這些酶的微生物菌株及其用于制備L-甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸的用途。
甲硫氨酸是人類和許多動(dòng)物的必需氨基酸。特別是，其被制備用于飼料市場及作為消旋物被添加到動(dòng)物飼料中。它由丙烯醛和甲硫醇經(jīng)過3-(甲硫基)丙醛化學(xué)合成，該3-(甲硫基)丙醛用氰化氫、氨和二氧化碳經(jīng)過乙內(nèi)酰脲轉(zhuǎn)變成D，L-甲硫氨酸。消旋物可用酶解析。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是代謝中最重要的甲基供體，在醫(yī)藥領(lǐng)域，用于治療抑郁、肝病和關(guān)節(jié)炎。已經(jīng)被描述用于制備SAM的方法，特別包括在前體L-甲硫氨酸存在的情況下培養(yǎng)酵母(Schlenk F.和DePalma R.E.，J.Bilo.Chem.1037-1050(1957)，Shiozaki S.等人，Agric.Biol.Chem.53，3269-3274(1989))及在自溶后層析純化。
甲硫氨酸的微生物合成，在大腸桿菌中研究得尤其深入(Greene，R.C.，在Neidhardt F.C.，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中甲硫氨酸的生物合成，細(xì)胞與分子生物學(xué)，第二版，ASM出版社，華盛頓市(1996)542-560頁及其中所含的文獻(xiàn))。由許多酶催化的反應(yīng)組成并被嚴(yán)格控制。合成的第一步，從天冬氨酸到高絲氨酸，與合成蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸同時(shí)進(jìn)行。合成的第一步對(duì)甲硫氨酸的合成是特異性的，它是從琥珀酰基-CoA和高絲氨酸生成O-琥珀?；呓z氨酸，并除去輔酶A。該反應(yīng)由高絲氨酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶(高絲氨酸O-轉(zhuǎn)琥珀酰酶，MetA，EC 2.3.1.46)所催化。SAM用L-甲硫氨酸和ATP一步合成。
高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的活性在L-甲硫氨酸和/或SAM存在的情況下被抑制(LeeL-W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966))。該終產(chǎn)物抑制一方面防止細(xì)菌中過度耗能合成甲硫氨酸和SAM，另一方面還同時(shí)阻礙以工業(yè)規(guī)模用微生物生產(chǎn)這兩種物質(zhì)。編碼高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的基因由930個(gè)堿基對(duì)組成(包括終止密碼子)，而由該基因編碼的蛋白質(zhì)由309個(gè)氨基酸組成。高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的結(jié)構(gòu)迄今還未被闡明，因此也還不能鑒定參與終產(chǎn)物抑制的氨基酸。
增加代謝終產(chǎn)物合成的已知方法是使用其活性不再被其代謝途徑的終產(chǎn)物所抑制的經(jīng)修飾的酶(反饋抗性突變體)。因此，例如3-去氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶反饋抗性突變體已經(jīng)被制備用于增加L-色氨酸和L-苯丙氨酸的合成(EP0745671 A2)，及分枝酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶的反饋抗性突變體已經(jīng)被制成用于增加苯丙氨酸的產(chǎn)生(US5120837)。
大腸桿菌高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶最近通過突變編碼它的DNA序列被修飾，使得生成蛋白質(zhì)的活性在1mmol L-甲硫氨酸或1mmol SAM存在的情況下較不易被抑制(JP2000139471A)。突變包含以下的氨基酸置換第27位的精氨酸用半胱氨酸置換，第296位的異亮氨酸用絲氨酸置換及第298位的脯氨酸用亮氨酸置換。經(jīng)修飾的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶在1mmol L-甲硫氨酸存在的情況下顯示出44-89％間的殘留活性及在1mmol SAM存在的情況下為10-73％。含有這些被修飾的蛋白質(zhì)的細(xì)菌菌株增加了L-甲硫氨酸的生產(chǎn)。然而，在沒有L-甲硫氨酸和SAM的情況下，這些被修飾的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的活性比在野生型中所見的更低。期望獲得盡可能多的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶變異體，它們在活性程度上及可被L-甲硫氨酸和/或SAM抑制的程度上不同，因?yàn)長-甲硫氨酸和SAM的微生物生物合成在過程和調(diào)節(jié)上非常復(fù)雜，而且還以多種不同的方式把細(xì)胞中多種其他代謝途徑連結(jié)起來。因此不可能事先預(yù)測可以獲得怎樣的能影響微生物菌株生長、平衡其生命代謝過程及L-甲硫氨酸和SAM生產(chǎn)的變異體。
本發(fā)明的目的是提供廣泛的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶(MetA蛋白質(zhì))新的變異體，在與野生型(WT)酶比較下顯示出對(duì)L-甲硫氨酸和SAM的反饋抗性被提高。
本發(fā)明的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶與高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶野生型酶相比有至少一個(gè)突變，且與野生型酶相比顯示出對(duì)L-甲硫氨酸和SAM的敏感性降低，野生型酶有一段氨基酸序列，包括在第90位至115位間的成分序列AapGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro和第285位至310位間的成分序列TyrGlnXaaThrPro，而氨基酸序列第1位為起始甲硫氨酸，其特征在于突變是成分序列AapGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中天冬氨酸被置換或成分序列TyrGlnXaaThrPro中酪氨酸被置換。
不同微生物中高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的比較顯示成分序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中的Asp和成分序列TyrGlnXaaThrPro中的Tyr是保守的。在大腸桿菌MetA蛋白質(zhì)中，含有保守天冬氨酸Asp的序列區(qū)域AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro位于SEQ ID No.2的第101位至109位之間，在其他MetA蛋白質(zhì)中，其位于第90位至115位之間。在大腸桿菌MetA蛋白中，含有保守酪氨酸Tyr的序列區(qū)域TyrGlnXaaThrPro位于SEQ ID No.2的第294位至298位之間，在其他MetA蛋白質(zhì)中，其位于第285位至310位之間。Xaa表示任意的天然氨基酸。
高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的立體結(jié)構(gòu)迄今還沒有被闡明。因此不可能確定不同的功能，如酶活性和通過L-甲硫酸酸和/或SAM對(duì)特定氨基酸的抑制性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的折疊是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，所以不可能由蛋白質(zhì)的初級(jí)序列得到其立體結(jié)構(gòu)的結(jié)論，在初級(jí)序列中彼此分開得很遠(yuǎn)的氨基酸在折疊的蛋白質(zhì)中緊鄰不是不常見的，反之亦然。已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)第101位或294位上的根據(jù)本發(fā)明的氨基酸置換導(dǎo)致對(duì)L-甲硫氨酸和對(duì)SAM的反饋抑制性降低。
本發(fā)明的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)抑制劑SAM和/或L-甲硫氨酸呈現(xiàn)抗性(即增加Ki)，其優(yōu)于野生型酶。優(yōu)選呈現(xiàn)對(duì)甲硫氨酸和/或SAM的抗性至少是野生型酶的2倍。更優(yōu)選本發(fā)明的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)甲硫氨酸和/或SAM的抗性是野生型酶的10倍，優(yōu)選抗性被增加50倍，最優(yōu)選抗性高于JP2000139471A中所描述的MetA突變體。
優(yōu)選地，本發(fā)明高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的蛋白質(zhì)序列含有表1所列突變之一或優(yōu)選所列突變的組合。
本發(fā)明的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶可例如通過表達(dá)編碼本發(fā)明的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶DNA序列而獲得。
本發(fā)明因此還涉及編碼本發(fā)明的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的DNA序列。
這樣的DNA序列可以通過突變MetA基因的密碼子的一個(gè)堿基而獲得，其特征是定位于大腸桿菌野生型酶第101位的天冬氨酸的密碼子或定位于大腸桿菌野生型酶的第294位的保守酪氨酸的密碼子發(fā)生至少一個(gè)突變，而密碼子1以序列SEQ ID No.1的第一個(gè)堿基開始。
本發(fā)明的DNA序列為MetA基因，其中位于MetA蛋白質(zhì)的第90位至115位之間的序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中的天冬氨酸Asp的密碼子，和/或位于MetA蛋白質(zhì)的第285位至310位之間的序列TyrGlnXaaThrPro中的保守酪氨酸Tyr的密碼子被修飾。
本發(fā)明的DNA序列在以下被稱為具有反饋抗性的MetA等位基因。
在本發(fā)明說明書中，在使用BESTFIT算法(GCG WisconsinPackage，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)的分析中，那些與大腸桿菌WT metA基因有超過50％的序列相同性的基因也被理解成是metA等位基因。以完全相同的方式，與大腸桿菌野生型高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶有超過50％的序列相同性(BESTFIT算法，GCG Wisconsin Package，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin)并擁有高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活性的蛋白質(zhì)也被理解成是高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶。
本發(fā)明的metA等位基因優(yōu)選含有表1中第2或4行所列突變之一或優(yōu)選所列突變的組合。
本發(fā)明的metA等位基因例如可以用下述的原料通過非特異性誘變或定向誘變來制備。上述DNA區(qū)城內(nèi)的非特異性突變可以通過例如化學(xué)試劑(例如1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍，甲磺酸乙酯及類似物)和/或通過物理方法和/或通過在規(guī)定條件下進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和/或通過在突變株(例如XL1red)中擴(kuò)增DNA制得。在DNA片段內(nèi)的特定位置導(dǎo)入突變的方法是已知的。另一種生成具有反饋抗性的metA等位基因的可能性在于組合不同的反饋抗性誘導(dǎo)突變以得到具有新特性的多重突變體。
優(yōu)選用野生型metA基因的DNA作為誘變原料。要被突變的metA基因可以被染色體編碼或在染色體外被編碼。上述的誘變方法用以修飾DNA序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，使得由其所編碼的蛋白質(zhì)擁有定位于大腸桿菌野生型酶的第101位的保守天冬氨酸的突變或定位于大腸桿菌野生型酶中第294位的保守酪氨酸的突變，位置1是來自SEQ ID No.2起始的甲硫氨酸。
已經(jīng)被描述的技術(shù)可用以在任意metA基因中的所述DNA區(qū)域?qū)胍粋€(gè)或多個(gè)突變。這些突變導(dǎo)致所編碼的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶擁有了導(dǎo)致對(duì)SAM和/或L-甲硫氨酸具反饋抗性的氨基酸序列。
在如所述地進(jìn)行誘變后，擁有期望表型的突變體被選擇，例如通過測定突變的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性程度而進(jìn)行選擇。
在L-甲硫氨酸或SAM存在的情況下能使酶活性被測定的任何方法，都可用于測定高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性。例如，高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活性可由以下Kredich和Tomkins所述用于測定絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的方法測定(Kredich N.M.和Tomlins G.M.，J.Biol.Chem.241，4955-4965(1966))。在含有高絲氨酸和琥珀酰基-CoA的分析品中測量酶活性。反應(yīng)由加入酶開始并用分光光度計(jì)根據(jù)由琥珀?；?輔酶A中硫酯鍵的裂解所致的在232nm處消光的降低來監(jiān)測。上述試驗(yàn)適合高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)甲硫氨酸的敏感性的測定。高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活性的抑制在不同濃度的L-甲硫氨酸存在的情況下，在反應(yīng)混合液中檢測。不同高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的催化活性在有或無L-甲硫氨酸的情況下測定，而這些數(shù)據(jù)被用以計(jì)算抑制常數(shù)Ki，它描述了活性僅為在無抑制劑的情況下可測定活性的50％的抑制劑濃度。
為測定不同高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活性對(duì)SAM的敏感性，有可能例如，進(jìn)行如LeeL.W.等人，J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)所述的活性試驗(yàn)。在該方法中，酶萃取物與高絲氨酸和琥珀?；?CoA一起培養(yǎng)。在不同的時(shí)間，一部份試驗(yàn)分析樣品通過將其加入到乙醇、水和5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)的混合液中被終止。吸收在412nm處用分光光度計(jì)測定。上述試驗(yàn)，適合例如用于測定高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)SAM敏感性。高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活性的抑制在不同濃度的SAM存在的情況下在反應(yīng)混合液中測試。不同的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的催化活性在有或無SAM的情況下測定，抑制常數(shù)Ki則用這些數(shù)據(jù)計(jì)算。
優(yōu)選的是通常對(duì)L-甲硫氨酸和/或SAM具有降低敏感性又同時(shí)擁有未改變的催化活性的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶。為其它目的，L-甲硫氨酸和/或SAM的敏感性和催化活性同時(shí)被降低也是我們所期望的。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的具有反饋抗性的metA等位基因的微生物菌株。這些微生物菌株的特征在于它們具有至少由具有反饋抗性的metA等位基因去調(diào)節(jié)(deregulated)的L-甲硫氨酸代謝或SAM代謝。因?yàn)橐阎舜x在所有微生物中由本質(zhì)上相同的途徑進(jìn)行，并且用于產(chǎn)生本發(fā)明的菌株的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如，從標(biāo)準(zhǔn)教科書得知，并可用于所有的微生物，因此本發(fā)明的菌株可用任意的微生物制備。優(yōu)選及合適的是用細(xì)菌生產(chǎn)本發(fā)明的菌株。革蘭氏陰性菌，特別是大腸桿菌，特別適合。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及通過培養(yǎng)本發(fā)明的微生物制備的L-甲硫氨酸或SAM，還涉及本發(fā)明的微生物用于制備含有甲硫氨酸(如含甲硫氨酸多肽)或在微生物代謝中衍生自L-甲硫氨酸或SAM(如多胺類、硫辛酸、生物素或醌類)的產(chǎn)物。此外，較野生型產(chǎn)生更大量SAM的本發(fā)明的微生物可用于制備通過從SAM轉(zhuǎn)移甲基形成的產(chǎn)物。
為表達(dá)經(jīng)修飾的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，具有反饋抗性的metA等位基因經(jīng)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到宿主菌株中。
具有反饋抗性的metA等位基因可在位于metA基因上游的自身啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它合適的啟動(dòng)子系統(tǒng)。因此，對(duì)應(yīng)的基因可在這樣的啟動(dòng)子的控制下以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在于宿主生物的染色體上或載體上，優(yōu)選質(zhì)粒。本發(fā)明因此還涉及質(zhì)粒，其特征是其中含有本發(fā)明的具有反饋抗性的metA等位基因及啟動(dòng)子。
對(duì)于克隆，可使用已含有遺傳元件(例如組成型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子、終止子)的載體，這些元件使編碼高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的基因能以可連續(xù)表達(dá)或以受控制的可誘導(dǎo)的方式表達(dá)。此外，在表達(dá)載體上還有其它調(diào)節(jié)元件如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止序列，以及編碼選擇標(biāo)記和/或報(bào)道基因的序列。這些選擇標(biāo)記的表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)化體的鑒定。合適的選擇標(biāo)記為例如編碼對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那微素和其它抗生素的抗性的基因。若本發(fā)明的metA等位基因要在染色體外復(fù)制時(shí)，則質(zhì)粒載體優(yōu)選含有復(fù)制起點(diǎn)。尤其優(yōu)選質(zhì)粒載體如大腸桿菌載體pACYC184、pUC18，pBR322和pSC101及其衍生物。合適的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的實(shí)例為lac、tac、trc、lambda PL、ara和tet啟動(dòng)子或自其衍生的序列。優(yōu)選GAPDH啟動(dòng)子的組成型表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，編碼高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的基因在衍生自pACYC184的質(zhì)粒中的GAPDH啟動(dòng)子的控制下。將基因整合入染色體的策略是現(xiàn)有技術(shù)。
合適宿主菌株用含有編碼對(duì)L-甲硫氨酸不敏感和/或?qū)AM不敏感的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的轉(zhuǎn)錄單元的載體轉(zhuǎn)化。含有對(duì)L-甲硫氨酸敏感和/或?qū)AM敏感的蛋白質(zhì)的菌株，例如細(xì)菌，被用作宿主菌株。
優(yōu)選使用的宿主菌株為大腸桿菌野生型菌株或其中內(nèi)源metA基因失活的菌株，如大腸桿菌菌株DL41，CGSC菌株收藏號(hào)7177。這些菌株用本發(fā)明的metA基因互補(bǔ)。附加的措施可用以增加本發(fā)明的菌株生產(chǎn)L-甲硫氨酸或SAM的能力。例如，為此目的，可使用其中不再表達(dá)編碼甲硫氨酸代謝基因抑制子的metJ基因的菌株(JP2000139471A)。
優(yōu)選通過培養(yǎng)本發(fā)明的微生物菌株來產(chǎn)生L-甲硫氨酸或SAM。為此目的，微生物菌株，例如，在發(fā)酵罐中在合適的碳源和合適的能源以及其它添加劑的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)為佳。
在發(fā)酵期間形成的物質(zhì)，如L-甲硫氨酸或SAM，之后可被純化。
以下實(shí)施例用以進(jìn)一步說明本發(fā)明。所有采用的分子生物學(xué)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)，DNA的分離和純化，用限制酶、Klenow片段和連接酶修飾DNA，轉(zhuǎn)化等是采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式，文獻(xiàn)中的所描述的方式或以各廠商所建議的方式實(shí)施。
實(shí)施例1使用metA結(jié)構(gòu)基因的間接誘變來生成具有反饋抗性的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶大腸桿菌metA基因由聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，使用具有以下的序列的5’-端磷酸化寡核苷酸metAfw5’-GATCCCATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTAT-3’(SEQ ID No.3)，和具有以下的序列的meCArev5’-GATCGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC-3’(SEQ ID No.4)，作為引物及用得自大腸桿菌株W3110(ATCC 27325)的染色體DNA作為模板。1.1kb長的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。其后，用T4 DNA連接酶將其插入已用限制性酶EcoRI和Klenow片段(Roche)處理過的質(zhì)粒pBR322(MBI Fermentas)中。生成的質(zhì)粒，也就是pKP438，被用于誘變。
質(zhì)粒pKP438通過轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入大腸桿菌菌株XL1-red(Stratagene)，通過依照廠商說明書培養(yǎng)菌株將突變插入質(zhì)粒pKP438中。誘變在臨界濃度的甲硫氨酸類似物存在的情況下完成，如Lawrence D.A.和Smith D.A.，遺傳學(xué)58473-492(1968)中所述。該方法用于選擇過量生產(chǎn)甲硫氨酸的突變株。大多數(shù)這樣的突變株可歸因于在質(zhì)粒pKR438上編碼的經(jīng)修飾的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶。
來自兩種突變株的質(zhì)粒被分離并測定metA基因的DNA序列。發(fā)現(xiàn)與野生型比較，這兩種基因各含有一個(gè)堿基取代，而這些堿基取代導(dǎo)致各自所編碼的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的一個(gè)氨基酸被改變。pBR1的metA的第301位堿基為A，而非野生型基因中的為G，導(dǎo)致天冬酰胺而非天冬氨酸加入所編碼的蛋白質(zhì)的第101位。pBR3的第881位堿基為G，而非野生型基因中為A，導(dǎo)致在所編碼的蛋白質(zhì)中的第294位是半胱氨酸而非酪氨酸。
實(shí)施例2在metA結(jié)構(gòu)基因中使用特異性堿基置換以生成具有反饋抗性的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶由分別在第101位和294位(見實(shí)施例3和4)的堿基置換及伴隨的氨基酸改變所引起的編碼對(duì)L-甲硫氨酸和/或SAM具有反饋抗性的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的metA等位基因在實(shí)施例1中制備。因此用位點(diǎn)特異性誘變構(gòu)建編碼高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的基因，其中在第101位上的天冬氨酸或第294位上的酪氨酸用多種其他氨基酸置換，結(jié)果表現(xiàn)出在L-甲硫氨酸和SAM對(duì)其活性的抑制方面發(fā)生改變的特性。
質(zhì)粒pACYC184-LH，衍生自以編號(hào)DSM 10172保藏于德國不倫瑞克的德國微生物和細(xì)胞保藏中心的pACYC184，其保藏號(hào)為DSM 10172，其被用作基礎(chǔ)質(zhì)粒來構(gòu)建本發(fā)明的質(zhì)粒。使用如下方法將GAPDH啟動(dòng)子序列以及其上游NdeI酶切位點(diǎn)插入到該質(zhì)粒中GAPDH啟動(dòng)子應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的法則，通過聚合酶鏈反應(yīng)被擴(kuò)增，其中具有以下的序列的寡核苷酸GAPDHfw5’-GTCGACGCGTGAGGCGAGTCAGTCGCGTAATGC-3’(SEQ ID No.5)，及具有以下的序列的GAPDHrevII，5’-GACCTTAATT AAGATCTCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTA-3’(SEQ ID No.6)，作為引物并用大腸桿菌株W3110(ATCC27325)的染色體DNA作為模板。電泳分離產(chǎn)物并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化，并依照廠商的用法說明書用限制酶MluI和PaeI處理。其后，用T4連接酶將其插入到已用相同酶處理過的pACYC184-LH載體中，結(jié)果形成質(zhì)粒pKP290。
大腸桿菌metA基因通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，使用具有以下的序列的寡核苷酸metAfw2
5’-CATGGCTCCTTTTAGTCATTCTTATATTCTAACGTAG-3’(SEQ ID No.7)及具有以下的序列的metArev25’-ACGCGTATGC ATCCAGAGCTCAGTACTATTAATCCAGCGTTGGATTC-3’(SEQ ID No.8)作為引物并用大腸桿菌株W3110(ATCC 27325)的染色體DNA作為模板。1.1kb長的產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。其后，依照以下方式將該產(chǎn)物連接至載體pKP290中以限制性酶NdeI、Klenow酶，限制酶BglII和綠豆核酸酶(Roche)處理。生成的質(zhì)粒，也就是pKP413GAP由

圖1詳示并以編號(hào)DSM15221保藏于德國不倫瑞克的德國微生物和細(xì)胞保藏中心。它含有在GAPDH啟動(dòng)子控制下的大腸桿菌metA基因并用作制備具有反饋抗性的metA等位基因的起始質(zhì)粒。
將質(zhì)粒pKP413GAP進(jìn)行metA結(jié)構(gòu)基因密碼子294的位點(diǎn)特異性誘變。為此目的，依照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行Pfu聚合酶(Promega)的反向聚合酶鏈反應(yīng)。所使用的引物為5’-端磷酸化寡核苷酸metAmutfw1，其具有以下的序列5’-NNNCAGATCACGCCATACGATCTAC-3’(SEQ ID No.9)，其中在合成中A、T、C和G的1∶1∶1∶1的混合物被用作N；及metAmutrev1，其具有以下的序列5’-GACGTAATAGTTGAGCCAGTTGG-3’(SEQ ID No.10)。
約4.3kb大小的產(chǎn)物依照廠商說明書內(nèi)容電泳分離并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。其后，使用T4 DNA連接酶依照廠商的說明書內(nèi)容進(jìn)行分子內(nèi)連接。大腸桿菌株DH5α的細(xì)胞以本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式通過CaCl2法轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化混合液被平鋪在LB-四環(huán)素瓊脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母萃取物/升，10克NaCl/升，15克瓊脂/升，15毫克四環(huán)素/升)，并在37℃下培養(yǎng)過夜。接著使用QIAprep spin miniprep kit(Qiagen)進(jìn)行質(zhì)粒分離，期望的轉(zhuǎn)化體通過限制酶分析被鑒定。含有metA結(jié)構(gòu)基因密碼子294的Esp3I至ScaI酶切位點(diǎn)間的區(qū)域依照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法被測序和分離并被插入已用相同酶處理過的pKP413GAP質(zhì)粒中。
對(duì)密碼子101的定向誘變的方法是類似的，但是聚合醇鏈反應(yīng)所用的引物為具有以下的序列的寡核苷酸metAmutfw25’-NNNGGTTTGATTGTAACTGGTGCG-3’(SEQ ID No.11)，其中在合成中A、T、C和G的1∶1∶1∶1的混合物被用作N；及具有以下的序列的metAmutrev25’-AAAGTTCTGATCCTGAATATC-3’(SEQ ID No.12)。
與野生型metA相比較，在密碼子101上被改變的質(zhì)粒，在Esp3I至PvuII酶切位點(diǎn)間的區(qū)域被測序，分離并被插入已用相同酶處理的pXP413GAP質(zhì)粒中。
已用這種方式構(gòu)建的質(zhì)粒含有與野生型序列相比較分別在密碼子294位或101位發(fā)生改變的序列的完整metA基因，因而可用它們來產(chǎn)生不同的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶變體(表1)。
表1起始質(zhì)粒和含有分別擁有改變的密碼子101或294的metA變體的質(zhì)粒
*)294位氨基酸在metA序列中消失**)294位氨基酸被刪除實(shí)施例3高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶突變體的活性及對(duì)L-甲硫氨酸的反饋抗性不同高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的活性及L-甲硫氨酸對(duì)活性的影響通過使用已產(chǎn)生各蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物的酶試驗(yàn)測定。為此目的，編碼改變的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的相應(yīng)質(zhì)粒使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法通過轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27325)。轉(zhuǎn)化混合液被平鋪在LB-四環(huán)素瓊脂板上(10克蛋白胨/升，5克酵母萃取物/升，5克Nacl/升，15克瓊脂/升，15毫克四環(huán)素/升)并在37℃下培養(yǎng)過夜。生成的轉(zhuǎn)化體在SM1培養(yǎng)基中生長(1升培養(yǎng)基CaCl2×2H2O 0.0147克，MgSO4×7 H2O 0.3克，Na2MoO4×2 H2O 0.15毫克，H3BO32.5毫克，CoCl2×6H2O 0.7毫克，CuSO4×5 H2O 0.25毫克，MnCl2×4H2O 1.6毫克，ZnSO4×7H2O 0.3毫克，KH2PO43.0克，K2HPO412.0克，(NH4)2SO45克，NaCl 0.6克，F(xiàn)eSO4×7H2O0.002克，Na3-檸檬酸×2H2O 1克，葡萄糖5克，蛋白胨1克，酵母萃取物0.5克)，在600nm約0.8的吸收值時(shí)離心沉淀，在50mmolTris pH 7.5中清洗并再離心沉淀。細(xì)胞被重懸于50mmol Tris/Cl，pH 7.5，2mmol二硫蘇糖醇，0.5mmol苯基申磺酰氯中并在法式壓濾器中破裂。來自進(jìn)一步離心的上清在檢測中被用做酶提取物。在含有50mmol Tris/Cl，pH 7.6，1mmol高絲氨酸和0.1mmol琥珀?；?CoA的混合液中，依照由Kradich和Tomkins所述的用于測定絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的方法(Kredieh N.M.和Tomkins G.M.J.Biol.Chom，241，4955-4965(1966))經(jīng)測定232nm處的消光降低而用光度計(jì)測定反應(yīng)中形成的輔酶A來確定酶活性。測定添加的L-甲硫氨酸對(duì)活性的影響，并將可抑制性量化為Ki值。所測定的Ki為這樣的L-甲硫氨酸濃度，在此濃度下高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶的活性僅為在無L-甲硫氨酸的情況下活性的50％。
所有高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶突變體，與野生型比較，均呈現(xiàn)出對(duì)L-甲硫氨酸反饋抗性的升高。表2簡要列出結(jié)果。
表2野生型酶和高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶突變體的活性及對(duì)L-甲硫氨酸的反饋抗性
*在無L-甲硫氨酸存在的情況下活性相當(dāng)于100％。
實(shí)施例4高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶對(duì)SAM的反饋抗性SAM對(duì)不同高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶活性的影響，通過在不同濃度的SAM(Cl鹽，Sigma)存在下定量化活性來測定。細(xì)胞提取物如實(shí)施例3所述進(jìn)行培養(yǎng)和制備?；钚栽囼?yàn)如LeeL.W.等人，于J.Biol.Chem.241，5479-5480(1966)中所述的方法進(jìn)行，將酶提取物與50mmol磷酸鉀緩沖液，pH 7.5，3mmol絲氨酸和0.3mmol琥珀酰基-CoA培養(yǎng)。多次后，100ul體積的試驗(yàn)混合液在各例子中通過將它們添加到到400ul乙醇，400ul水和100ul 10mmol 5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)的混合物中而終止。生成的混合物在室溫下培養(yǎng)5分鐘后，在412nm處的吸收用分光光度計(jì)測定。在蛋白質(zhì)濃度測定后，酶活性用消光系數(shù)計(jì)算。算出的Ki為SAM抑制活性能力的測定值。
表3高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶突變體的活性及對(duì)SAM的反饋抗性
*在無SAM存在的情況下活性相當(dāng)于100％。
序列表<110>電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)<120>反饋抗性的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶<130>CO-10217<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>930<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(930)<300>
<301>Blattner，F(xiàn).R.
<302>The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.
<303>Science<304>277<305>5331<306>1453-1474<307>1997
<400>1atg ccg att cgt gtg ccg gac gag cta ccc gcc gtc aat ttc ttg cgt48Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg1 5 10 15gaa gaa aac gtc ttt gtg atg aca act tct cgt gcg tct ggt cag gaa96Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu20 25 30att cgt cca ctt aag gtt ctg atc ctt aac ctg atg ccg aag aag att144Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys LysIle35 40 45gaa act gaa aat cag ttt ctg cgc ctg ctt tca aac tca cct ttg cag192Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln50 55 60gtc gat att cag ctg ttg cgc atc gat tcc cgt gaa tcg cgc aac acg240Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr65 70 75 80ccc gca gag cat ctg aac aac ttc tac tgt aac ttt gaa gat att cag288Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln85 90 95gat cag aac ttt gac ggt ttg att gta act ggt gcg ccg ctg ggc ctg336Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu100 105 110gtg gag ttt aat gat gtc gct tac tgg ccg cag atc aaa cag gtg ctg384Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu115 120 125
gag tgg tcg aaa gat cac gtc acc tcg acg ctg ttt gtc tgc tgg gcg432Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala130 135 140gta cag gcc gcg ctc aat atc ctc tac ggc att cct aag caa act cgc480Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg145 150 155 160acc gaa aaa ctc tct ggc gtt tac gag cat cat att ctc cat cct cat528Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His165 170 175gcg ctt ctg acg cgt ggc ttt gat gat tca ttc ctg gca ccg cat tcg576Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser180 185 190cgc tat gct gac ttt ccg gca gcg ttg att cgt gat tac acc gat ctg624Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu195 200 205gaa att ctg gca gag acg gaa gaa ggg gat gca tat ctg ttt gcc agt672Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser210 215 220aaa gat aag cgc att gcc ttt gtg acg ggc cat ccc gaa tat gat gcg720Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala225 230 235 240caa acg ctg gcg cag gaa ttt ttc cgc gat gtg gaa gcc gga cta gac768Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp245 250 255
ccg gat gta ccg tat aac tat ttc ccg cac aat gat ccg caa aat aca816Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr260 265 270ccg cga gcg agc tgg cgt agt cac ggt aat tta ctg ttt acc aac tgg864Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp275 280 285ctc aac tat tac gtc tac cag atc acg cca tac gat cta cgg cac atg912Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met290 295 300aat cca acg ctg gat taa930Asn Pro Thr Leu Asp305 310<210>2<211>309<212>PRT<213>Escherichia coli<400>2Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg1 5 10 15Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu20 25 30Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile35 40 45Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
50 55 60Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr65 70 75 80Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln85 90 95Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu100 105 110Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu115 120 125Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala130 135 140Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg145 150 155 160Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His165 170175Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser180 185 190Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu195 200 205Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser210 215 220Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala225 230 235 240
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp245 250 255Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr260 265 270Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp275 280 285Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met290 295 300Asn Pro Thr Leu Asp305<210>3<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotid metAfw<400>3gatcccatgg ctccttttag tcattcttat 30<210>4<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidmetArev<400>4gatcgagctc agtactatta atccagcgtt ggattc 36<210>5<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidGAPDHfw<400>5gtcgacgcgt gaggcgagtc agtcgcgtaa tgc 33<210>6<211>42<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidGAPDHrevII<400>6gaccttaatt aagatctcat atgttccacc agctatttgt ta42<210>7
<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidmetAfw2<400>7catggctcct tttagtcatt cttatattct aacgtag 37<210>8<211>47<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOigonukleotidmetArev2<400>8acgcgtatgc atccagagct cagtactatt aatccagcgt tggattc 47<210>9<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidmetAmutfw1<400>9nnncagatca cgccatacga tctac 25
<210>10<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidmetAmutrev1<400>10gacgtaatag ttgagccagt tgg 23<210>11<2ll>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidmetAmutfw2<400>11nnnggtttga ttgtaactgg tgcg24<210>12<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceOligonukleotidmetAmutrev2<400>12aaagttctga tcctgaatat c 2權(quán)利要求
1.一種高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，其與高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶野生型酶相比，有至少一個(gè)突變，并與野生型酶相比呈現(xiàn)出對(duì)L-甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性，野生型酶擁有一段氨基酸序列，包括在第90位至115位的成分序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro和在第285位至310位的成分序列TyrGlnXaaThrPro，氨基酸序列的第1位為起始甲硫氨酸，其特征在于該突變是在成分序列AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro中的天冬氨酸的氨基酸置換或成分序列TyrGlnXaaThrPro中的酪氨酸的氨基酸置換。
2.如權(quán)利要求1的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，其特征在于與野生型相比較，其呈現(xiàn)出對(duì)SAM或L-甲硫氨酸的抗性增加至少2倍(增加的ki)。
3.如權(quán)利要求1或2的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，其特征在于其含有表1所列突變之一。
4.一種metA等位基因，其編碼如權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶。
5.一種質(zhì)粒，其特征在于含有與啟動(dòng)子一起的如權(quán)利要求4的metA等位基因。
6.一種微生物菌株，其特征在于其含有如權(quán)利要求4的具有反饋抗性的metA等位基因。
7.如權(quán)利要求6的微生物菌株，其特征在于其是革蘭氏陰性菌株，優(yōu)選為大腸桿菌。
8.一種通過培養(yǎng)如權(quán)利要求6或7的微生物菌株來制備L-甲硫氨酸或SAM的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，其與野生型高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶相比有至少一個(gè)突變和與野生型酶相比有對(duì)L－甲硫氨酸或SAM的降低的敏感性。后者包含一段氨基酸序列，包括在第90位至115位的部分的AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro序列和在第285位至310位的部分的TyrGlnXaaThrPro序列，氨基酸序列的第1位對(duì)應(yīng)于起始甲硫氨酸。本發(fā)明的特征在于該突變是在部分的AspGlyXaaXaaXaaThrGlyAlaPro序列中的天冬氨酸的置換或部分的TyrGlnXaaThrPro序列中的酪氨酸的置換。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1703517SQ200380101208
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者蘇珊·利昂哈特斯伯格, 克斯廷·普法伊費(fèi)爾, 克里斯托夫·溫特哈爾特, 布麗吉特·鮑爾 申請人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)