專利名稱：治療自體免疫疾病的trkb激動劑的制作方法
本申請要求在2006年12月20日提交的美國臨時申請60/870,918的優(yōu)先權(quán)，其在這里通過引用以其整體被并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病，包括多發(fā)性硬化。本發(fā)明提供減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的白細胞侵襲的酪氨酸受體激酶B(TrkB)激動劑。

背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的脫髓鞘自身免疫疾病，以炎癥、脫髓鞘和軸突損害為特征。該疾病影響全世界超過百萬的人和在女性中的流行性是在男性中的兩倍。MS的征狀通常出現(xiàn)在20歲和40歲之間的年齡段。盡管已經(jīng)研究該疾病的特征，MS的病因尚不清楚。這類特征包括對CNS組織的損害、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活、促炎細胞因子的產(chǎn)生、抑制T-細胞遷移和克隆型擴張、改變的巨噬細胞效應(yīng)子作用、MHC的產(chǎn)生、上調(diào)、和由T-細胞浸潤的直接CNS攻擊。
認為實驗性的自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是MS的標準模型。已經(jīng)使用鼠疾病模型來研究MS的病因和評估用于其治療的藥物(Aharoni，R.等人，2005a)。EAE的臨床特征包括由大量浸潤的淋巴細胞和巨噬細胞導(dǎo)致的CNS的炎癥和脫髓鞘。用髓磷脂的數(shù)個不同蛋白成分(包括髓磷脂堿蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)和髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG))對小鼠進行主動免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生自身免疫抗體和上行性麻痹的臨床病征。該疾病可以是急性的或慢性的，取決于小鼠種系和用于免疫的髓磷脂蛋白。已經(jīng)使用EAE來研究MS的病因和評估對其治療的藥物(Aharoni，R.等人，2005a)。
MS主要由T-細胞對髓磷脂的應(yīng)答產(chǎn)生，所述髓磷脂是在神經(jīng)組織中豐富的多肽。脫髓鞘和臨床癱瘓產(chǎn)生于Th1表型的T-細胞導(dǎo)致的CNS組織的侵襲，所述T細胞對髓磷脂抗原具有特異性。Th1產(chǎn)生炎癥細胞因子，包括TNF-α和IFN-γ。對CNS的損害也可能由其它免疫應(yīng)答導(dǎo)致，包括產(chǎn)生自身免疫抗體和補體激活。在MS的早期和晚期，及在整個疾病過程中發(fā)現(xiàn)多種同型的髓磷脂堿蛋白(MBP)特異性抗體的EAE中有B-細胞參與。從腦和脊椎組織制備的切片顯示白細胞侵襲(特別是淋巴細胞和巨噬細胞)和神經(jīng)系統(tǒng)下襯組織的破壞。
格拉默(Glatiramer)乙酸酯(GA，COPAXONE)是被批準用于治療MS和其它疾病的免疫抑制藥物(Arnon，R.等人，2003)。該藥物在EAE模型中也是有效的。GA是產(chǎn)生抗炎癥細胞因子的Th2/3細胞的誘導(dǎo)物，其穿過血腦屏障在CNS中聚集。這些細胞因子在CNS的組織中產(chǎn)生多種影響，和導(dǎo)致局部產(chǎn)生其它生長因子，例如IL-10、TGF-β和BDNF(Aharoni，R.等人，2003)。延長的GA施用與NT3、NT4和BDNF的更高水平表達有關(guān)(Aharoni，R.等人，2005b)。
NT3、NT4和BDNF是對于神經(jīng)發(fā)育、加工生長、突觸可塑性、保護和存活重要的小同源二聚體蛋白的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(NT)家族的成員。NT包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、NT3、NT4(也稱為NT4/5)、NT6和NT7。NT通過與稱為受體酪氨酸激酶(也稱為酪氨酸受體激酶)的受體家族相互作用影響靶標細胞。這些受體包括數(shù)個高分子量(130-150kDa)、高親和力(～10-11M)酪氨酸受體激酶(Trk)受體和稱為低分子量(65-80kDa)、低親和力(～10-9M)的受體(LNGFR、p75NTR或p75)。NT結(jié)合特異性受體酪氨酸激酶導(dǎo)致受體二聚化和內(nèi)在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的激活。NGF優(yōu)選結(jié)合酪氨酸受體激酶A(TrkA)、BDNF，而NT4結(jié)合酪氨酸受體激酶B(TrkB)，而NT3結(jié)合酪氨酸受體激酶C(TrkC)。全部NT弱結(jié)合p75。
對EAE小鼠CNS組織中的BDNF和NT4的報道(Aharoni，R.等人，2003，2005b)表明NT和/或其受體在多發(fā)性硬化和相關(guān)疾病中的作用。
參考文獻 Aharoni，R.et al.(2005a)J.Neurosci.258217-28.Aharoni，R.et al.(2005b)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 10219045-50. Aharoni，R.et al.(2003)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA10014157-62. Aharoni，R.et al.(1997)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA9410821-26. Arnon，R.et al.(2003)J.MoI.Recognit.16412-21. Davies，A.et al.(1993)Neuron 11565-74. Karnezis，T.et al.(2004)Nat.Neurosci.7736-44. Padlan，E.et al.(1995)FASEB J.133-39. Steinman and Zamvil(2006)Ann.Neurol.6012-21. 另外的參考文獻，特別是涉及標準操作和方法的參考文獻在正文通常被引用。在以上和在申請其它處引用的全部專利、專利申請、Genbank輸入號、參考手冊和公開案在這里以其整體被引入作為參考。
發(fā)明簡述 一方面，本發(fā)明提供減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的白細胞侵襲的方法，包括以激活TrkB受體的有效量將包含TrkB激動劑的組合物施用于需要此治療的哺乳動物受試者，由此減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的白細胞侵襲。本發(fā)明還提供TrkB激動劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于減少哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的白細胞侵襲。
在一些實施方案中，所述哺乳動物具有自身免疫性疾病。在一個實施方案中，所述自身免疫性疾病是試驗性的自身免疫性腦脊髓炎。在另一實施方案中，所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化。在其它實施方案中，所述自身免疫性疾病與免疫排斥、視神經(jīng)疾病、炎性腸病、或帕金森病有關(guān)。在優(yōu)選的實施方案中，該哺乳動物是人。
在一些實施方案中，該TrkB激動劑是天然存在的TrkB激動劑。在一個實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑是NT4。在相關(guān)實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑包含NT4的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述NT4的片段或衍生物結(jié)合和激活TrkB。在另一實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑是BDNF。在相關(guān)實施方案中，所述天然存在的TrkB激動劑包含BDNF的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述BDNF的片段或衍生物結(jié)合和激活TrkB。
在另一實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體。在具體的實施方案中，該抗體是抗體38B8。在另一實施方案中，該抗體由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是人抗體。在相關(guān)實施方案中，所述TrkB激動劑是人源化的抗體。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體片段或衍生物。在具體的實施方案中，該抗體片段選自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc或單鏈(ScFv)抗體。在一些實施方案中，所述抗體片段包含激動劑抗體38B8的抗原結(jié)合區(qū)域。在一些實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合區(qū)。在相關(guān)的實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的互補決定區(qū)(CDR)。在相關(guān)的實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766雜交瘤系產(chǎn)生的抗體的互補決定區(qū)(CDR)。
在優(yōu)選的實施方案中，所述侵入的白細胞包括T-細胞和巨噬細胞。在具體的實施方案中，所述侵入的白細胞包括表達CD3和表達CD68的白細胞。在優(yōu)選的實施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織是腦組織或脊椎組織。
在有關(guān)的方面，本發(fā)明提供治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病的方法，包括向需要此治療的哺乳動物受試者施用包含足夠激活TrkB受體的TrkB激動劑的量的組合物，由此減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織的白細胞侵襲。本發(fā)明還提供TrkB激動劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療影響哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病。
在一個實施方案中，該自身免疫疾病是試驗性自身免疫性腦脊髓炎。在另一實施方案中，所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化。在其它實施方案中，所述自身免疫性疾病與免疫排斥、視神經(jīng)疾病、炎性腸病、或帕金森病有關(guān)。在優(yōu)選的實施方案中，該哺乳動物是人。
在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是天然存在的TrkB激動劑。在一個實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑是NT4。在相關(guān)實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑包含NT4的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述NT4的片段或衍生物結(jié)合和激活TrkB。在另一實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑是BDNF。在相關(guān)實施方案中，該天然存在的TrkB激動劑包含BDNF的天然存在的片段或衍生物。在一些實施方案中，所述BDNF的片段或衍生物結(jié)合和激活TrkB。
在另一實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體。在具體的實施方案中，所述抗體是抗體38B8。在另一實施方案中，所述抗體由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是人抗體。在相關(guān)的實施方案中，所述TrkB激動劑是人源化的抗體。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是抗體片段或衍生物。在具體的實施方案中，該抗體片段選自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc或單鏈(ScFv)抗體。在一些實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的抗原結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合區(qū)。在相關(guān)實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的互補決定區(qū)。在相關(guān)實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的抗體的互補決定區(qū)(CDR)。
在優(yōu)選的實施方案中，所述侵入性白細胞包括T-細胞和巨噬細胞。在具體的實施方案中，所述侵入性白細胞包含表達CD3和表達CD68的白細胞。在優(yōu)選的實施方案中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織是腦組織或脊椎組織。
在另一方面，本發(fā)明提供減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織中白細胞侵入的試劑盒的部分，包含可有效激活TrkB受體量的TrkB激動劑和使用說明書。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病的試劑盒的部分，包含可有效激活TrkB受體的量的TrkB激活劑和使用說明書。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及TrkB激動劑抗體38B8，例如分離的單克隆38B8抗體。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的分離的TrkB激動劑抗體。在一些實施方案中，所述TrkB激動劑是38B8的抗體片段或衍生物。在另一實施方案中，所述TrkB激動劑是由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的抗體的抗體片段或衍生物。在具體的實施方案中，該抗體片段選自衍生自38B8的Fab、Fab1、F(ab′)2、Fv、Fc、單鏈(ScFv)抗體。在具體的實施方案中，該抗體片段選自由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc、或單鏈(ScFv)抗體。在一些實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的抗原結(jié)合區(qū)。在一些實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的激動劑抗體的抗原結(jié)合區(qū)。在相關(guān)實施方案中，該抗體片段包含激動劑抗體38B8的互補決定區(qū)(CDR)。在相關(guān)實施方案中，該抗體片段包含由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的激動劑抗體的互補決定區(qū)(CDR)。在另一實施方案中是產(chǎn)生TrkB激動劑抗體38B8的細胞或產(chǎn)生衍生自38B8的片段的細胞。在另一實施方案中是保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系。
本發(fā)明也涉及本文所述的任何的TrkB激動劑用于治療本文所述的任何自身免疫疾病。本發(fā)明還提供藥物組合物，包含本文所述的任何TrkB激動劑和藥物可接受的載體。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列編碼本文所述的任何TrkB激動劑。在一個具體的實施方案中，是包含核苷酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列編碼由保藏在ATCC保藏號PTA-8766的雜交瘤系產(chǎn)生的激動劑抗體。本發(fā)明還涉及包含這里所述的任何核酸分子的載體，其中該載體任選包含操縱性連接于核酸分子的表達控制序列。
另一實施方案提供宿主細胞，該細胞包含本文所述的任意的載體或包含本文所述的任意的核酸分子。本發(fā)明還提供分離的細胞系，其產(chǎn)生這里所述的任意的抗體或抗原結(jié)合部分或其產(chǎn)生所述抗體或所述抗原結(jié)合部分的重鏈或輕鏈。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生TrkB激動劑抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)本文所述的任意的宿主細胞或細胞系和回收所述抗體或抗原結(jié)合部分 本發(fā)明還涉及包含本文所述的任意核酸的非人的轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物，其中該非人的轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物表達所述核酸。
本發(fā)明還提供分離TrkB激動劑抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，包括從本文所述的非人的轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物分離抗體的步驟。
本發(fā)明的這些和其它的方面從本發(fā)明的描述和下列實例中是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A和1B繪圖顯示在MOG-誘導(dǎo)數(shù)周之后在EAE動物中的相對發(fā)病率。MOG是在第0天被施用。(A)在第10天開始，動物接受NT4(10mg/kg)或僅接受作為對照的媒質(zhì)的每日施用。(B)用對照IgG(10mg/kg；n＝9)、NT4(10mg/kg)從第3天到第9天(n＝8)、或NT4(10mg/kg)從第9天到第15天(n＝8)治療動物。
圖2描述了顯示對于四個受體酪氨酸激酶(即，TrkA、TrkB、TrkC和p75)的四個受體酪氨酸激酶激動劑(即，NGF、BDNF、NT4和38B8)相對親和力的系列圖。X-軸顯示時間(全部在300-450秒范圍內(nèi))。Y-軸顯示相對親和力。第一行坐標圖的最高刻度依次為(從左到右)90、20、50和60單位；第二行坐標圖的最高刻度依次為32、60、60、140單位；第三行坐標圖的最高刻度依次為35、35、16和20單位；第四行坐標圖的最高刻度依次為90、80、100和90單位。這些數(shù)據(jù)在本文和在實施例4中被進一步描述(包括表2)。
圖3描述在MOG誘導(dǎo)后第9天時用TrkB激動劑治療的動物中發(fā)病率的示意圖。動物在第9天和16天接受5mg/kg TrkB激動劑抗體38B8或非特異性的IgG(對照)。根據(jù)下列評分系統(tǒng)評估小鼠每日EAE的臨床征狀0＝正常；1＝無力尾；2＝中度后肢虛弱；3＝適度的嚴重后肢虛弱(動物仍然能夠艱難行走)；4＝嚴重后肢虛弱(動物可以移動其后肢但是不能行走)；5＝完全的后肢癱瘓；和6＝死亡。
圖4描述在MOG誘導(dǎo)后第16天時用TrkB激動劑治療的動物中發(fā)病率的示意圖。動物在第16天和23天接受5mg/kg TrkB激動劑抗體38B8或媒質(zhì)(PBS)。
圖5A和5B描述了在疾病進行晚期，在治療動物中的發(fā)病率。(A)動物在第18和23天接受5mg/kg TrkB激動劑抗體38B8或非特異性IgG。(B)動物在第22天開始接受每日施用GA(COPAXONE)或僅媒質(zhì)(對照)。
圖6A和6B描述了在施用TrkB激動劑或地塞米松的動物中的發(fā)病率和體重。動物接受38B8(5mg/kg，在第9和第16天每周)、或在第3-12天每日接受地塞米松(4mg/kg)或乙醇媒質(zhì)(對照)。(A)如上測量發(fā)病率。(B)在疾病發(fā)生的整個過程中測量動物的體重。
圖7A和7B描述了TrkB激動劑在減少疾病發(fā)病率中的效果是劑量依賴的。(A)動物在第9和16天接受1mg/kg或5mg/kg的TrkB激動劑38B8。(B)動物在第9和16天接受5mg/kg或10mg/kg的38B8、或PBS(對照)。
圖8描述了使用體外測定在量增加的數(shù)個TrkB激動劑抗體(38B8、23B8、36D1、37D12和19H8)存在下神經(jīng)元存活的相對量。該試驗操作和結(jié)果在本文和實施例1中被描述(例如，表1)。在神經(jīng)元存活測定中各個抗體的EC50值被顯示在表1的第3欄。
圖9描述了顯示在未治療(對照)動物和用TrkB激動劑抗體38B8治療的動物中指示的MOG-特異性抗體同種型的相對水平的系列圖。各個圖顯示在經(jīng)TrkB激動劑(38B8)治療的動物或未治療(對照)的動物中指示抗體同種型的量(如通過測量在450μm的光吸收確定)。
圖10描述了顯示脾細胞刺激測定的結(jié)果的圖。脾細胞來自MOG-誘導(dǎo)的未治療(對照)動物或MOG誘導(dǎo)的經(jīng)TrkB激動劑抗體(38B8)治療的動物，在僅MOG或MOG與TrkB激動劑抗體(38B8；50μl/mg)組合，或在兩種不同濃度之一的地塞米松(10-8M和10-5M)存在下體外培養(yǎng)該細胞。
圖11描述了從經(jīng)對照(A)和TrkB激動劑治療的動物(B)移取的脊椎切片的免疫化學(xué)染色的結(jié)果。該切片的髓磷脂用勒克司堅牢藍(Luxol Fast Blue)染色而細胞體用甲酚紫染色。
圖12描述了從經(jīng)對照(A)和TrkB激動劑治療的動物(B)移取的脊椎切片的免疫化學(xué)染色的結(jié)果。該切片是用CD3的特異性的抗體染色。
圖13描述了從經(jīng)對照(A)和TrkB激動劑治療的EAE動物(B)移取的脊椎切片的免疫化學(xué)染色的結(jié)果。該切片是用CD68的特異性的抗體染色。
圖14描述了從經(jīng)對照和TrkB激動劑治療的EAE動物中移取的脊椎切片的組織學(xué)染色的結(jié)果。該切片用勒克司堅牢藍(Luxol FastBlue)染色髓磷脂。缺少著色表示脫髓鞘的區(qū)域。
發(fā)明詳述 定義 本文所用術(shù)語“酪氨酸受體激酶”和“受體酪氨酸激酶”被可互換使用，指其TrkB是成員的分子類型。配體(激動劑)與受體酪氨酸激酶的結(jié)合引起配體-誘導(dǎo)的受體二聚化和在細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域中酪氨酸殘基的自磷酸化作用。繼酪氨酸磷酸化之后是多種信號級聯(lián)的激活，例如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt、MAPK1和PLC-途徑，其一般是以細胞類型特異性的方式調(diào)節(jié)基因表達。
本文所用″侵入的白細胞″是侵入、浸潤或遷移進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)組織(包括腦和脊椎組織)的白細胞，其為自身免疫疾病，優(yōu)選影響CNS的自身免疫疾病的結(jié)果。侵入性白細胞主要是T-細胞和單核細胞，盡管可能存在其它白細胞。
本文所用″減少的白細胞侵入″指減少的白細胞遷移(即，侵入或浸潤)進入CNS組織(包括腦和脊椎組織)。減少白細胞侵入也指減少由白細胞侵入介導(dǎo)的細胞毒影響，特別針對下襯的神經(jīng)元細胞和/或CNS組織的其它支持細胞。白細胞侵入包括由T-細胞和單核細胞的侵入。減少白細胞侵入包括保護CNS組織免受自身免疫攻擊。由白細胞侵入破壞的CNS的細胞包括表達髓磷脂的細胞和臨近的不表達髓磷脂的細胞。細胞破壞可能是通過凋亡、壞死或其組合。減少的白細胞侵入減少以下列臨床適應(yīng)癥為特征如疾病惡化減慢、發(fā)作或發(fā)病率的嚴重性延遲、存活延長、生命質(zhì)量改善、認知、活動或行為癥狀減少或穩(wěn)定化。減少白細胞侵入也包括預(yù)防或減少白細胞遷移進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)組織的風(fēng)險。白細胞侵入減少可以是部分的或完全的，例如，如本文所述，該減少可以是相對或?qū)嶋H減少的約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或甚至約95％。
本文所用″TrkB受體激動劑″或″TrkB激動劑″是增加TrkB受體的激活量的分子，產(chǎn)生與由天然存在的激動劑BDNF和NT4導(dǎo)致的相似的效果。TrkB激活通常由受體誘導(dǎo)的自身磷酸化發(fā)生，其開啟特征性的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的級聯(lián)反應(yīng)。TrkB受體激動劑增加這一活化，例如，通過調(diào)節(jié)受體二聚化或磷酸化，通過調(diào)節(jié)天然存在的激動劑的結(jié)合、通過模擬天然存在的激動劑的結(jié)合、通過引起TrkB受體在更長(包括無限)時期內(nèi)保持活化(例如，磷酸化)狀態(tài)、或者調(diào)節(jié)TrkB激活或開啟細胞內(nèi)事件的級聯(lián)反應(yīng)，其為TrkB受體激活的特征。TrkB激動劑包括天然存在的激動劑多肽、片段、變體和其衍生物，包括但不限于已知的TrkB激動劑NT4和BDNF。TrkB激動劑包括激動劑抗體、片段、變體和其衍生物。本文描述了優(yōu)選的TrkB激動劑特性。本發(fā)明的TrkB激動劑可以增加TrkB的激活至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。本文所用″片段″多肽是保留較大多肽的至少一些生物特性(例如激活TrkB受體的能力)的所述較大多肽的部分。優(yōu)選的片段包含產(chǎn)生所述較大多肽的生物特性的所述較大多肽的氨基酸殘基和/或結(jié)構(gòu)。多肽片段可以被稱為肽，盡管在這里的多肽和肽之間沒有區(qū)別。本文描述了示例性片段?？梢匀绫疚乃鲅苌巍?br> 本文所用″衍生物″多肽具有一個或多個共價或非共價的修飾，例如加入或移去功能基團或部分。本文提供了衍生物的例子。
本文所用的特定多肽序列的″變體″被定義為在多肽序列之一的某長度范圍與特定的多肽序列具有至少40％序列同一性的多肽序列，使用諸如Clustal V或BLAST算法，例如″BLAST 2 Sequences″工具2.0.9版本(May7，1999)，按照默認參數(shù)設(shè)置。這類多肽對可能在多肽之一的某定義的長度內(nèi)顯示，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的序列同一性。
本文所用應(yīng)用于多肽序列的″序列同一性″，指在至少兩個多肽序列之間殘基匹配的百分數(shù)，其使用標準化算法比對，例如Clustal V、MEGALIGN或BLAST。多肽序列比對的方法是眾所周知的。一些比對方法說明保守氨基酸的取代。如本文所述的這類保守的取代，和通常在取代位點保存了電荷和疏水性，因此保留了多肽的結(jié)構(gòu)(和由此其功能)。
如這里使用的，″可有效激活TrkB受體的量″或與TrkB激動劑有關(guān)的類似表達，指與施用TrkB受體激動劑之前基線水平的激活相比足夠增加TrkB受體激活的量(如在這里定義和本技術(shù)領(lǐng)域公知的)。激活的增加可以是至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。這一量應(yīng)該考慮用藥途徑，TrkB激動劑在體內(nèi)的半衰期、TrkB激動劑的溶解度、生物利用度、清除率和其它的藥物代謝動力學(xué)特征，動物或患者的體重和代謝等。又見TrkB激動劑。
本文所用″需要治療的動物″或類似表達指患有發(fā)展涉及CNS的自身免疫疾病或有其風(fēng)險的動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人。影響CNS的自身免疫疾病(或病征，沒有區(qū)別)的例子是小鼠中的實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)、人中的多發(fā)性硬化(MS)、和在其它哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的相似的自身免疫疾病。也在例如，免疫排斥、視神經(jīng)疾病、炎性腸病、和帕金森病中觀察到CNS的自身免疫攻擊。
本文所用″天然存在的TrkB激動劑″是天然存在的和作為TrkB受體的激活劑起作用的分子。TrkB受體公知的天然存在的激動劑是神經(jīng)營養(yǎng)素NT4和BDNF。天然存在的TrkB激動劑包括天然存在的變體分子，例如在具有突變的TrkB等位基因的動物中表達的神經(jīng)營養(yǎng)素多肽。
本文所用“分離的抗體”指基本沒有其它具有不同抗原特異性的抗體(例如，特異性結(jié)合TrkB的分離的抗體基本沒有特異性結(jié)合除了TrkB之外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合TrkB的分離的抗體可能對其它抗原(例如來自其它物種的TrkB分子)具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可基本沒有其它細胞物質(zhì)和/或化學(xué)藥物。
本文所用術(shù)語″單克隆抗體″或″單克隆抗體組合物″指單分子組合物的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單結(jié)合特異性和親和力。
一般技術(shù) 本發(fā)明應(yīng)用在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)在參考文獻中被描述，例如，MolecularCloningA Laboratory Manual，second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.CeIHs編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue CultureLaboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯，1993-8)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和CC.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)；Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel，等人，編輯，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人，編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；lmmunobiology(CA.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.編輯，IRL Press，1988-1989)；monoclonal antibodiesa practicala pproach(P.Shepherd和C Dean，編輯，Oxford University Press，2000)；Using antibodiesa laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，編輯，Harwood AcademicPublishers，1995). TrkB激動劑 本發(fā)明提供使用TrkB激動劑治療多發(fā)性硬化和其它影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的自身免疫疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個特征，TrkB激動劑有效減少白細胞侵入CNS的組織和減少CNS的下襯神經(jīng)元組織的破壞，并因此緩解這一疾病的臨床現(xiàn)象，例如肢體麻痹。具體的，TYkB激動劑減少單核細胞和T-細胞的遷移，其具有呈遞髓磷脂抗原和向產(chǎn)生它們的細胞施用細胞毒性效應(yīng)的活性。
使用MS的良好接受的動物模型(實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠)進行了導(dǎo)致本發(fā)明的觀察。EAE是實驗性疾病狀態(tài)，其與人中的MS共享許多臨床和病理的特征。許多FDA-批準的MS治療是基于在小鼠和大鼠中的EAE模型第一次被發(fā)現(xiàn)并發(fā)展的(由Steinman和Zamvil綜述，2006)。在使用髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)的肽35-55免疫之后，可以在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)EAE(Aharoni，R.等人，2005a)。用MOG免疫誘導(dǎo)髓磷脂-特異性的自身免疫反應(yīng)，其導(dǎo)致與MS相似的脫髓鞘和發(fā)病率。
使用TrkB激動劑的動物試驗 在支持本發(fā)明而執(zhí)行的試驗中，已經(jīng)表明，在患CNS-特異性的自身免疫疾病的動物中直接施用TrkB激動劑減少發(fā)病率和CNS組織損傷(圖1A和1B)。在MOG-誘導(dǎo)之后將天然存在的TrkB激動劑NT4的重組形式施用于EAE動物(實施例5)。用NT4治療的動物顯示與對照動物相比顯著減少的發(fā)病率。這一結(jié)果證明施用TrkB激動劑在減緩慢性EAE發(fā)展中是有效的。更多的試驗表明，關(guān)于癥狀的發(fā)作，在早期施用NT4時提供的保護至少與在晚期施用一樣好(即使不更好)，且為了治療有效而用TrkB激動劑治療不必持續(xù)至病征發(fā)作之時(圖1B)。TrkB活化可以是在EAE的誘導(dǎo)中相對上游的靶標步驟。
實施例1-4和6描述了TrkB抗體，其中的一些基于它們刺激TrkB的生物活性(即激活TrkB的能力)，作為TrkB激動劑起作用(例如，實施例6和表1和2)。數(shù)個抗體，包括抗體38B8，是對TrkB特異性的，且顯示對測定的其它受體酪氨酸激酶沒有顯著的結(jié)合。與天然存在的激動劑BDNF和NT4(其顯示一些交叉反應(yīng)性)相比，抗體38B8對于TrkB受體更加具有選擇性。在實施例4和表2中提供這些配體-受體相互作用的動力學(xué)分析。
動物試驗顯示，與對照免疫球蛋白相比，TrkB激動劑抗體提供免于EAE發(fā)病的顯著保護(圖3，實施例7)。當(dāng)在MOG-誘導(dǎo)之后遲至16天，和在臨床癥狀發(fā)作之后施用時，TrkB激動劑抗體是有效的(圖4)。與格拉默乙酸酯(GA)的比較提示，TrkB激動劑的活性機制與GA和其它目前的MS藥物不同(圖5)。其它的結(jié)果證明TrkB激動劑的有益效果與免疫抑制劑-地塞米松的效果相似(圖6A和6B)。TrkB激動劑抗體的有益效果是劑量依賴性的(圖7A和7B)。
使用神經(jīng)元細胞存活測定證明，TrkB激動劑以與天然存在的TrkB激動劑一致的方式影響神經(jīng)元細胞(實施例8)。加入增加量的TrkB激動劑抗體導(dǎo)致增加的神經(jīng)元存活(圖8)。在實施例1中被描述了在神經(jīng)元存活測定和在人KIRA測定中TrkB激動劑抗體38B8、23B8、36D1和37D12的EC50值并總結(jié)子表1。
治療MS的目前的藥物(包括GA和地塞米松)是免疫調(diào)節(jié)劑。TrkB激動劑抗體未表明通過抑制抗-MOG抗體的產(chǎn)生而起作用，并因此，未表明作為常規(guī)免疫抑制劑作用(圖9，實施例9)。而且，TrkB激動劑抗體的存在對脾細胞刺激沒有如同免疫抑制劑-地塞米松的明顯效果(圖10)。用TrkB激動劑治療的動物保留產(chǎn)生正?？?MOG T-細胞和/或B-細胞應(yīng)答的能力。這些觀察表明免疫抑制劑-地塞米松和TrkB激動劑的活性機制不同，且TrkB激動劑的活性機制在白細胞增殖水平上不是主要的。
組織學(xué)分析顯示從用TrkB激動劑治療的動物制備的切片中減少的白細胞侵入。一些TrkB激動劑-治療的動物顯示實際上沒有CNS白細胞侵入的證據(jù)(圖11)。通過染色表達CD3的T-細胞和表達CD68的巨噬細胞來執(zhí)行侵入細胞的鑒定。與對照動物相比，來自用TrkB激動劑治療的動物的脊椎組織顯示T-細胞和單核細胞侵入實質(zhì)性減少(圖12和13)。嚴重的脫髓鞘區(qū)域在對照小鼠中而非用TrkB激動劑治療的小鼠中(圖14)。CNS組織切片的組織化學(xué)染色的結(jié)果證明，TrkB激動劑治療減少CNS的淋巴細胞和單核細胞的侵入。
以上所述的結(jié)果證明，TrkB激動劑有效減少CNS的白細胞侵入和減緩EAE(廣泛接受的MS的動物模型)的進展。該天然存在的TrkB激動劑NT4和TrkB激動劑抗體在減緩疾病發(fā)展中都是有效的。所述激動劑抗體顯示出對TrkB的最大選擇性并用于進一步的研究。TrkB激動劑的有益效果是劑量依賴性的，隨著TrkB激動劑增加，發(fā)病率減小。與目前的MS藥物不同，TrkB激動劑不是主要通過免疫抑制起作用。組織化學(xué)試驗顯示TrkB激動劑減少T-細胞和單核細胞的CNS組織侵襲。
用于CNS自身免疫疾病的TrkB激動劑 不為理論所限，認為TrkB激動劑主要通過調(diào)節(jié)白細胞的遷移起作用。細胞免疫可能在MS中占優(yōu)勢，使TrkB激動劑成為比當(dāng)前影響體液免疫的免疫抑制劑更有效類型的藥物。而且，本方法可以與當(dāng)前的免疫抑制治療組合以產(chǎn)生另外的治療效果。
可以使用本發(fā)明的TrkB激動劑在多個自身免疫或相關(guān)疾病中減少CNS組織的白細胞侵襲。除了是MS的模型，也使用EAE小鼠研究視神經(jīng)炎。TrkB激動劑預(yù)期在由尤其是白細胞侵入介導(dǎo)的全部這些疾病和其它自身免疫疾病中減輕CNS免疫侵入。注意術(shù)語疾病和病征的使用沒有區(qū)別。
本發(fā)明的特征是向患有自身免疫疾病的動物直接施用TrkB激動劑。盡管以多肽的方式描述本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明包含施用編碼這類TrkB激動劑多肽的多核苷酸，其將在體內(nèi)指導(dǎo)編碼的TrkB激動劑的表達。直接的DNA注射和基因治療遞送的方法是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。將TrkB激動劑多肽，或編碼它們的多核苷酸與通過施用藥物(例如GA)誘導(dǎo)相反，直接施用于動物。本發(fā)明還包含素擬肽分子，其以與天然存在的TrkB激動劑和/或激動劑抗體一致的方式結(jié)合和激活TrkB。
根據(jù)本文所述的方法使用的具體的TrkB激動劑在以下進行了更加詳細的描述。另外的TrkB激動劑是對本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員之一而言顯而易見的，而不背離本發(fā)明的范圍。
天然存在的TrkB激動劑和其衍生物 TrkB激動劑包括天然存在的激動劑多肽，包括但不限于公知的TrkB激動劑NT4和BDNF。NT4和/或BDNF多肽序列可能來自與相應(yīng)的TrkB受體相同的物種，或來自不同的物種，只要產(chǎn)生的多肽結(jié)合于TrkB和作為激動劑起作用。
TrkB激動劑包括天然存在的和變體的NT4(即，NT-4/5和相似的名稱)。NT4多肽被描述在美國專利申請公開2005/0209148、2003/0203383和2002/0045576，和在PCT WO 2005/08240中。NT4(即，NT4/5)多肽已經(jīng)在許多哺乳動物中被鑒定。目標氨基酸取代包括G77至K、H、Q或R；和R84至E、F、P、Y或W?？梢猿サ鞍酌盖懈钗稽c以延長NT4和BDNF多肽的半衰期，或加入蛋白酶切割位點以允許其活性的調(diào)節(jié)。TrkB激動劑可以是綴合或融合于延長半衰期部分，例如PEG，IgG Fc區(qū)域，白蛋白，或肽或表位，例如Myc、HA(血凝素)，His-6或FLAG。
BDNF多肽也已經(jīng)在許多哺乳動物中被鑒定(見，例如，美國專利5,180,820和美國專利申請公開2003/0203383)。
本發(fā)明的天然存在的和變體的NT4和BDNF多肽包括嵌合體、變體、片段(包括肽)、和/或其衍生物。優(yōu)選的片段包括天然存在的多肽的TrkB結(jié)合部分，或嵌合的、共有的或突變的與其相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合部分。片段包括合成的肽。變體包括具有保守和非保守的氨基酸取代的天然存在的氨基酸序列變體。
保守的取代涉及相似大小、電荷或疏水性的氨基酸殘基。例如，Ala可以由Val、Leu或Ile取代。Arg可以由Lys、Gln或Asn取代。Asn可以由Gln、His、Lys或Arg取代。Asp可以由Glu取代。Cys可以由Ser取代。Gln可以由Asn取代。Glu可以由Asp取代。Gly可以由Pro取代。His可以由Asn、Gln、Lys或Arg取代。Ile可以由Leu、Val、Met、Ala、Phe或正亮氨酸取代。Leu可以由正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala或Phe取代。Lys可以由Arg、Gln或Asn取代。Met可以由Leu、Phe或Ile取代。Phe可以由Leu、Val、Ile或Ala取代。Pro可以由GIy取代。Ser可以由Thr取代。Thr可以由Ser取代。Trp可以由Tyr取代。Tyr可以由Trp、Phe、Thr或Ser取代。VaI可以由Ile、Leu、Met、Phe、Ala或正亮氨酸取代。
可以通過選擇性取代實現(xiàn)功能上的重要修飾，其在維持以下的影響上顯著不同(a)在取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊(sheet)或螺旋構(gòu)象，(b)在靶標位點上分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小。基于一般側(cè)鏈特性被分組天然存在的殘基(這些中的一些可以落入數(shù)個功能基團) (1)疏水的Met、Ala、Val、Leu、Ile、正亮氨酸； (2)中性親水的Cys、Ser、Thr； (3)酸性Asp、Glu； (4)堿性Asn、Gln、His、Lys、Arg； (5)芳香族的Trp、Tyr、Phe；和 (6)引起轉(zhuǎn)折的殘基Gly和Pro。
非保守的取代將一類中的成員與另一類中的成員交換或涉及在先前段落中未鑒定為保守的取代。
變體包括天然存在的氨基酸序列變體和基因工程的變體，只要產(chǎn)生的多肽或衍生物結(jié)合于TrkB和作為激動劑起作用。在本文和所引用的參考文獻中描述了測量TrkB活性的測定。
更多的變體包括具有來自酪氨酸受體激酶的Trk家族的其它相關(guān)配體(包括NT3和NGF)的部分氨基酸序列的TrkB激動劑多肽。變體還包括具有共有的Trk或共有的受體酪氨酸激酶結(jié)合和/或激活序列的多肽。
其它衍生物包括共價和非共價修飾的肽和多肽(例如，?；⒕垡叶蓟?、法尼基化、糖基化或磷酸化的多肽)。特殊的聚乙二醇化的和其它修飾形式的NT4被描述在美國專利申請公開2005/0209148中。該多肽可以包括另外的功能基團來調(diào)節(jié)結(jié)合和/或活性，使能夠在體內(nèi)成象、調(diào)節(jié)半衰期、調(diào)節(jié)穿過血腦屏障的運輸或幫助將多肽靶向特定的細胞類型或組織。多肽可以包含氨基酸取代以利于修飾(例如，加入聚乙二醇化、糖基化或其它位點)，只要該取代不實質(zhì)影響該多肽結(jié)合于TrkB或激動劑活性。
常見的修飾是聚乙二醇化以降低系統(tǒng)清除率且最少喪失生物活性。使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，可以將聚乙二醇聚合物(PEG)連接于NT4和BDNF多肽(以及TrkB激動劑抗體)的多個功能基團(見，例如，Roberts等人(2002)，Advanced Drug Delivery Reviews54459-476；Sakane等人(1997)Pharm.Res.141085-91)?？梢詫EG連接于，例如，氨基基團、羧基基團、修飾的或天然的N-末端、胺基團和巰基基團。在一些實施方案中，用PEG分子修飾一個或多個表面氨基酸殘基。PEG分子可以是不同大小的(例如，范圍從約2至40kDa)。連接于NT4、BDNF或其它多肽的PEG分子可以具有的分子量約為2000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000Da的任意。PEG分子可以是單個鏈或支鏈的。為了將PEG連接于TrkB激動劑多肽，可以使用在一個或兩個末端具有功能基團的PEG的衍生物。基于在多肽上可獲得的反應(yīng)基團類型選擇功能基團。連接衍生物到多肽的方法是本領(lǐng)域公知的。
已經(jīng)產(chǎn)生聚乙二醇化的NT4并顯示在動物中作為NT4起作用(見，例如，美國專利申請公開2005/0209148的實施例6和7和PCT WO2005/082401)。在成熟的人NT4位置50的絲氨酸殘基可以被替換為半胱氨酸以產(chǎn)生NT4-S50C，而后被聚乙二醇化，其中所述PEG被連接于在位置50的半胱氨酸。N-末端特異性連接到PEG的一個例子是將位置1的殘基突變?yōu)榻z氨酸或蘇氨酸，以利于聚乙二醇化。相似的方法應(yīng)用于BDNF和在本發(fā)明中使用的其它多肽。
多肽或其衍生物可以直接的或經(jīng)由合成的接頭被連接于其它分子。與其價值已被報道的天然存在的TrkB激動劑相比，優(yōu)選的TrkB激動劑多肽、片段或其衍生物顯示相似或更好的結(jié)合親和力、選擇性和活化。小部分的激動劑多肽可以被稱為“肽”，盡管這一術(shù)語不應(yīng)視為限制。
在本文所述的多個試驗和測定(包括動力學(xué)測定、EAE動物模型、KIRA測定和神經(jīng)元存活測定)中，優(yōu)選的TrkB激動劑顯示與BDNF和NT4相比相似的生物特性。
TrkB抗體激動劑及其衍生物 TrkB激動劑包括激動劑抗體、片段、變體及其衍生物。合適的激動劑抗體是對TrkB有選擇性的，且以與天然存在的NT4和BDNF多肽相似或更多的親和力結(jié)合。然而，與天然存在的TrkB激動劑相比，抗體的長期循環(huán)半衰期使結(jié)合親和力較不關(guān)鍵。測定抗體38B8的結(jié)合親和力為46±10nM(見上述和實施例4)。使用在實施例4中描述的具體的測定條件，優(yōu)選的TrkB激動劑抗體具有的Kd為少于100nM、少于10nM、少于1nM、少于100pM或甚至少于10pM。
在本文所述的多個試驗和測定(包括結(jié)合測定、EAE動物模型、KIRA測定和神經(jīng)元存活測定)中，優(yōu)選的TrkB激動劑也呈現(xiàn)與抗體38B8(和天然存在的激動劑)相比相似的生物特性。例如，在實施例1(包括表1)中所述的神經(jīng)元存活測定中，優(yōu)選的TrkB激動劑呈現(xiàn)的EC50值為少于11pM。優(yōu)選的TrkB激動劑具有的EC50值為從約1pM至約10pM、從約0.1pM至約1pM、從約0.01pM至約0.1pM或甚至低于0.01pM。示例性的EC50值是38B8為0.2pM和36D1為5pM。使用KIRA測定，優(yōu)選的TrkB激動劑也呈現(xiàn)與抗體38B8相比相似的生物特性(實施例1，包括表1)。優(yōu)選的TrkB激動劑具有的EC50值在KIRA測定中為少于50nM，優(yōu)選從約5nM至少于50nM，從約0.5nM至約5nM或甚至低于0.5nM。在提供的測定條件下，示例性的EC50值是約5nM。
TrkB激動劑抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體、雜交的、共有的、嵌合的、雙特異性或綴合的抗體。如果可應(yīng)用，該抗體可以是任意的同種型(即，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)。抗體包括抗體片段(例如，F(xiàn)ab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc和單鏈(ScFv)抗體)。合適的TrkB激動劑抗體或其功能片段或衍生物以本文所述的方式，例如，關(guān)于單克隆抗體激動劑38B8，結(jié)合于并激活TrkB。TrkB激動劑抗體包括抗體片段，其包括包含衍生自抗體的氨基酸序列的多肽。特別重要的是參與抗原識別的氨基酸序列，例如在CDR區(qū)域中的那些。
單克隆抗體和小鼠雜交瘤方法是本領(lǐng)域眾所周知的。非人抗體用于治療人的用途可以耐受與免疫抑制藥物組合。這類藥物被常規(guī)施用治療或減少MS和其它自身免疫和炎癥疾病的癥狀。免疫調(diào)節(jié)藥物是本領(lǐng)域公知的且包括糖皮質(zhì)激素、殺細胞物質(zhì)(例如，烷化劑、抗代謝藥、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巰嘌呤)、細胞毒性抗體(例如，T-細胞受體和IL-2-特異性抗體)、對嗜免疫劑發(fā)揮作用的藥物(例如，環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、雷帕霉素(rapamicin)、雷帕鳴(RAPAMUNE)、普樂可復(fù)(PROGRAF)和FK506)、干擾素(例如，IFN-β)、鴉片、TNF-結(jié)合蛋白(例如，循環(huán)受體)、麥考酚酯和用于抑制動物對外源抗體或治療抗原的免疫應(yīng)答的其它生物劑。
人源化源自不同物種(例如小鼠)的單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。為了治療人，優(yōu)選人或人源化的抗體。人源化的抗體包含最小量的非人氨基酸序列，這樣它們在人中是最小限度免疫原性或非免疫原性的。優(yōu)選的人源化抗體不被人免疫系統(tǒng)識別為外源。這類抗體可以是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段(例如，F(xiàn)v、Fab、Fab′、F(ab′)2)或其它包含抗原結(jié)合必須的氨基酸殘基的免疫球蛋白鏈部分，在抗原結(jié)合位點外的主要氨基酸序列衍生自人免疫球蛋白。在互補決定區(qū)(CDR)之內(nèi)的氨基酸殘基也可以由人特異性的殘基取代，只要抗原結(jié)合沒有不利影響。
人抗體是唯一地或基本包含人抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體也包括包含至少一種人重鏈多肽或至少一種人輕鏈多肽的抗體或其重要片段，任選與來自另一動物的重鏈或輕鏈組合。一個這類例子是包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。
合適的TrkB激動劑抗體、片段或其衍生物可以在轉(zhuǎn)基因動物、哺乳動物細胞(包括B-細胞)、鳥類細胞、昆蟲細胞、酵母或細菌中表達或分泌。例如，可以通過免疫能夠產(chǎn)生全部為人免疫球蛋白或基本為人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)產(chǎn)生合適的人抗體。也可以通過基因改組(gene-shuffling)、噬菌體展示、大腸桿菌展示、核糖體展示、mRNA展示、蛋白質(zhì)片段互補或RNA-肽篩選產(chǎn)生抗體。用于設(shè)計和產(chǎn)生人源化和人的抗體及其衍生物的方法被描述在，例如，美國專利7,005,504、6,800,738、6,407,213、6,054,297、6,331,415，和5,750,373(Genentech)；美國專利6,833,268、6,207,418、6,114,598，和6,075,181(Abgenix)；美國專利6,498,285(Alexion)；美國專利7,074,557、5,885,793、5,837,242、5,733,743、5,565,332(Cambridge Antibody Technology)；美國專利7,118,879、6,979,538、6,326,155、5,994,125、5,837,500(Dyax)；美國專利6,753,136、6,667,150、6,300,064、5,514,548(MorphoGen/Protein Design Labs)；和6,461,824、6,204,023、5,821,123、5,595,898、5,576,184、4,698,420(Xoma)；美國專利7,041,870、6,680,209、6,500,931、6,111,166、6,096,311、6,071,517、6,063,116(Medarex)；和美國專利4,816,397(Celltech)。用于產(chǎn)生人或人源化的抗體的方法也被描述在Vaughan等人(1996)Nature Biotechnology 14309-14；Sheets等人(1998)Proc.Natl Acad.ScL USA 956157-6162；Hoogenboom和Winter(1991)J.MoI.Biol.，227381；Marks等人(1991)J.MoI.Biol.，222581；Cole等人(1985)in Monoclonal Antibodies和CancerTherapy(Alan R.Liss)p.77；和Boerner等人，1991，J.Immunol.，147(1)86-95。
可對TrkB激動劑抗體進行共價或非共價的修飾(例如，乙?；?、聚乙二醇化的(見例如，實施例5)、法尼基化、糖基化、磷酸化等)并也可以包括另外的功能基團來調(diào)節(jié)結(jié)合、調(diào)節(jié)激動劑活性、使多肽在體內(nèi)能夠成象、調(diào)節(jié)多肽的半衰期或調(diào)節(jié)運輸穿過血腦屏障。多肽可能包含利于修飾的氨基酸取代(例如，另外的聚乙二醇化、糖基化或其它位點)，只要該取代基本不影響多肽與TrkB的結(jié)合或激動劑活性。多肽或其衍生物可以直接或經(jīng)由合成的接頭被連接于其它分子。
如本文和所可用的參考文獻中所述，合適的抗體片段或衍生物包含介導(dǎo)TrkB-結(jié)合和激活的氨基酸殘基。主要由在六個小環(huán)區(qū)域中的殘基確定抗體特異性，所述環(huán)區(qū)域被稱為互補決定區(qū)(CDR)或高變環(huán)，位于輕鏈和重鏈的N-末端附近。在輕鏈中的CDR通常是在氨基酸殘基24和34(CDR1-L)、50-56(CDR2-L)和89-97(CDR3-L)之間。在重鏈中的CDR通常是在氨基酸殘基31和35b(CDR1-H)、50-65(CDR2-H)和95-102(CDR3-H)之間。一些CDR的長度比其它更加可變。CDR1-L長度變化從約10-17個殘基，而CDR3-H長度變化從約4-26個殘基。其它的CDR是適當(dāng)?shù)臉藴书L度。Padlan，E.A.等人(1995)FASEB.J.133-39。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的TrkB激動劑抗體片段包含來自CDR或來自CDR內(nèi)的重鏈和/或輕鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。
如上所述和本領(lǐng)域公知的，本發(fā)明使用的抗體包括天然存在的氨基酸序列變體，其具有保守和非保守的氨基酸取代。
與天然存在的TrkB激動劑相比，優(yōu)選的TrkB激動劑抗體、片段或其衍生物顯示出相似或更好的結(jié)合親和力、選擇性和激活能力。小部分的激動劑多肽可以被稱為“肽”，盡管這一術(shù)語不應(yīng)被解釋為限制。
TrkB激動劑制劑 可以將TrkB激動劑用于制備藥物，該藥物用于治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病(例如多發(fā)性硬化)。如本文定義的，在這一方式中，可以使用包含TrkB激動劑的組合物來治療哺乳動物(包括人患者)中的疾病。TrkB激動劑組合物還可以包含合適的藥物可接受的賦形劑，其為本領(lǐng)域公知的。盡管可以使用其它施用形式，TrkB激動劑組合物通常被配制為通過注射(例如，腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)等)施用?？梢詫rkB激動劑配制為用于注射的制劑，通過將其溶解、懸浮或乳化于含水或非水的溶劑(例如植物或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、較高級脂肪酸或丙二醇的酯)；且如果需要，含常規(guī)的添加物，例如，增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
合適的載體、稀釋劑和賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括如下材料例如碳水化合物、蠟、水溶性和/或可膨脹的聚合物、親水或疏水材料、明膠、油、溶劑、水等等。將依賴于應(yīng)用本發(fā)明的化合物的方法和目的來決定使用的具體載體、稀釋劑或賦形劑。通常，安全的溶劑是非毒性的含水溶劑，例如水和其它可以溶解和混合于水中的無毒性溶劑。合適的含水溶劑包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等及其混合物。該制劑也可以包括一個或多個緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、濕潤劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、抗氧化劑、不透明物質(zhì)、助流劑、操作助劑、著色劑、甜味劑、芳香劑、調(diào)味劑和其它已知的添加劑以提供藥物的適當(dāng)存在(即，本發(fā)明的化合物或其藥物組合物)或幫助制備制藥產(chǎn)物(即，藥物)。一些制劑可以包括載體(例如脂質(zhì)體)。脂質(zhì)體的制劑包括，但不限于，細胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂囊和單層囊泡。用于胃腸道和非胃腸道藥物遞送的賦形劑和制劑如Remington，The Science and Practice ofPharmacy(2000)中所述。
施用和劑量 在本文示例的施用方案和治療劑量是基于這類因素，例如動物體重、在血液中TrkB激動劑的半衰期和TrkB激動劑的親和力。優(yōu)選的施用方案和劑量使在施用之間維持TrkB激動劑在體內(nèi)的治療量。NT的有效劑量范圍(包括天然存在的TrkB激動劑)在本文和在Davies等人(1993)和在其它參考文獻中被示例。激動劑抗體的有效劑量范圍在這里被示例(例如，在EAE動物中1-10mg/kg)，并提供用于確定類似激動劑抗體的最適劑量的起點。
如執(zhí)行支持本發(fā)明的試驗證明的(見，例如，圖1B、3和4)，在疾病過程早期的“脈沖治療”似乎足以降低動物的發(fā)病率。對于治療效率無需持續(xù)施用TrkB激動劑。
具體劑量方案(即，劑量、時間和重復(fù))將決定于待治療的人或動物的年齡、病情和體重?？梢詮膭游镌囼炌茢嗥鹗嫉慕o藥方案。TrkB激動劑施用的時間/頻率應(yīng)該基于當(dāng)施用時具體TrkB激動劑的循環(huán)半衰期(或在神經(jīng)組織中的半衰期)、穿過血腦屏障的激動劑的量、激動劑在細胞中的半衰期、毒性和副作用。
在本研究中，通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射來施用TrkB激動劑；但其它施用途徑(例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))也預(yù)期有效。顱內(nèi)或脊柱內(nèi)的施用(或施用于CNS的其它組織)可能是有效的。其它施用途徑也可適合，決定于具體的TrkB激動劑、其包被、綴合或具體的生物特性(例如，口服、舌下、滑膜內(nèi)、粘膜、經(jīng)皮、關(guān)節(jié)內(nèi)、陰道內(nèi)、肛門、尿道、鼻、耳、經(jīng)由吸入、噴注、經(jīng)由導(dǎo)管、作為彈丸、以支架或其它可植入裝置、以栓狀組合物、以靜脈滴注、以貼片或溶解薄膜等)。
TrkB激動劑優(yōu)選是經(jīng)由合適的外周途徑施用。雖然如此，應(yīng)該理解小百分比的激動劑可能穿過血腦屏障并被遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞。在一些情況下，能夠進入CNS的外周施用TrkB激動劑的量很小(甚至少于1％)。
本發(fā)明的特征是將TrkB激動劑直接施用于患有自身免疫疾病的哺乳動物受試者?！爸苯印币庵笇rkB激動劑多肽或多核苷酸通過標準接種途徑遞送于動物?？梢詫rkB激動劑與其它藥理制劑組合遞送于動物，包括免疫抑制劑，例如，糖皮質(zhì)激素、殺細胞劑(例如，烷化劑、抗代謝劑、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巰嘌呤)、細胞毒性抗體(例如，T-細胞受體和IL-2-特異性抗體)、作用于嗜免疫劑的藥物(例如，環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司、雷帕霉素)、干擾素(例如，IFN-β)、鴉片、TNF-接合蛋白(例如，循環(huán)受體)、麥考酚酯和其它用于抑制動物對外源抗體或治療抗原的免疫應(yīng)答的生物物質(zhì)。
TrkB激動劑抗體超過天然存在的TrkB激動劑的優(yōu)點是與循環(huán)的蛋白配體相比傾向具有相對長的循環(huán)半衰期的抗體。例如，當(dāng)天然存在的激動劑可能需要每日施用時，抗體可能僅需要每周施用。另一優(yōu)點是，抗體傾向于具有更高的接合親和力，且相比細胞受體對其蛋白配體而言，抗體對于其抗原更有選擇性。
使用TrkB激動劑的治療可以與對多發(fā)性硬化和相關(guān)病征的常規(guī)治療組合。用于治療和處置多發(fā)性硬化的常規(guī)藥物包括，但不限于ABC(即，Avonex-Betaseron/Betaferon-Copaxone)治療(例如，干擾素β1a(AVONEX，REBIF)、干擾素β1b(BETASERON，BETAFERON)和格拉默乙酸酯(COPAXONE)；化學(xué)治療劑(例如，米托蒽醌(NOVANTRONE)、硫唑嘌呤(IMURAN)、環(huán)磷酰胺(CYTOXAN，NEOSAR)、環(huán)孢菌素(SANDIMMUNE)、甲氨蝶呤和克拉屈濱(LEUSTATIN)；皮質(zhì)類固醇和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)(例如，甲潑尼松龍(DEPO-MEDROL、SOLU-MEDROL)、潑尼松(DELTASONE)、潑尼松龍(DELTA-CORTEF)、地塞米松(MEDROL、DECADRON)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和促皮質(zhì)素(ACTHAR)；疼痛介導(dǎo)(觸物感痛)(例如，卡馬西平(TEGRETOL、EPITOL、ATRETOL、CARBATROL)1加巴噴丁(NEURONTIN)、托吡酯(TOPAMAX)、唑尼沙胺(ZONEGRAN)、苯妥英(DILANTIN)、地昔帕明(NORPRAMIN)、阿米替林(ELAVIL)、丙米嗪(TOFRANIL、IMAVATE、JANIMINE)、多塞平(SINEQUAN1 ADAPIN1 TRIADAPIN，ZONALON)、普羅替林(VIVACTIL)1大麻和合成的大麻素(MARINOL)、已酮可可堿(TRENTAL)、布洛芬(NEUROFEN)、阿司匹林、醋氨酚和羥嗪(ATARAX)；和其它的治療(例如，那他珠單抗(ANTEGREN)、阿侖珠單抗(CAMPATH-1H)、4-氨基吡啶(FAMPRIDINE)、3，4二氨基吡啶、依利羅地、IV免疫球蛋白(GAMMAGARD，GAMMAR-IV，GAMIMUNE N，IVEEGAM，PANGLOBULIN，SANDOGLOBULIN，VENOGLOBULIN)、普瑞巴林和齊考諾肽)。
試劑盒部分 本發(fā)明也提供實踐本發(fā)明的方法的試劑盒部分(試劑盒)。試劑盒包括適當(dāng)分離和滅菌的TrkB激動劑和根據(jù)本文所述本發(fā)明的任意方法使用的說明書。通常，這些說明書包括對如何施用TrkB激動劑的描述。該試劑盒可能還包括說明書，其用于鑒定需要治療和監(jiān)測或測量治療效果的動物。說明書通常包括有關(guān)劑量、劑量方案(施用頻率)和施用途徑的信息。在試劑盒中提供的說明書可以是文字的或以數(shù)據(jù)文件或表格的機器/計算機可讀的形式。
該試劑盒也可以包含施用TrkB激動劑的儀器，包括注射器、針頭、導(dǎo)管、吸入器、泵、乙醇交換、紗布、CNS活組織檢查儀器、組織抗體和染料等。按照需要對試劑盒的成分滅菌。試劑盒還可以提供另外的藥理制劑，包括，但不限于，免疫抑制劑，例如GA和地塞米松。試劑盒可以包括日期郵戳、防撬包裝、和射頻鑒定(RFID)標簽或其它庫存控制特征。
實施例 提供下列實施例進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的另外的方面只要不背離本發(fā)明的范圍對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
實施例1TrkB激動劑抗體的產(chǎn)生和篩選 免疫以產(chǎn)生單克隆抗-TrkB激動劑抗體 用8μg的人TrkB細胞外結(jié)構(gòu)域作為抗原按照常規(guī)方案注射5次Balb/C小鼠。在293細胞中使用載體pTriEx-2Hygro(Novagen，Madison W1)表達His-標記的人TrkB細胞外結(jié)構(gòu)域(殘基31-430)。根據(jù)產(chǎn)品說明書(Qiagen，Valencia，CA)使用Ni-NTA樹脂純化TrkB細胞外結(jié)構(gòu)域。對于先前的4次注射，通過混合人TrkB與RIBI佐劑系統(tǒng)和鋁來制備抗原。在11天過程中約每3天，經(jīng)由頸背、足墊和IP注射獲得總共8μg的抗原。在第13天，將小鼠安樂死和移出脾臟。將淋巴細胞與8653細胞融合以制備雜交瘤克隆。使克隆生長，然后用人和大鼠TrkB ELISA通過ELISA篩選選擇抗-TrkB陽性細胞。
ELISA篩選抗-TrkB抗體 根據(jù)結(jié)合人和大鼠TrkB的能力對來自生長的雜交瘤克隆的上清液進行篩選。用96-孔板進行測定，所述平板使用100μl的0.5μg/ml大鼠或人TrkB-Fc融合蛋白包被過夜。在各個步驟之間使用含有0.05％吐溫-20的PBS從孔洗去多余的試劑。用含有0.5％BSA的磷酸緩沖鹽水(PBS)封閉平板。將上清液加入平板，并在室溫孵育2小時。另入綴合了馬辣根過氧化物酶(HRP)的山羊-抗小鼠Fc以結(jié)合與TrkB結(jié)合的小鼠抗體。然后加入四甲基聯(lián)苯胺作為HRP的底物檢測在上清液中存在的小鼠抗體的量。停止反應(yīng)，并通過讀取在450nm的吸光度定量抗體的相對量。在ELISA測定中顯示五十個抗體陽性。在這些抗體中，進一步檢測五個抗體，并顯示具有激動劑活性。見下表2。
KIRA測定 使用這一測定在ELISA中針對人TrkB誘導(dǎo)受體酪氨酸激酶激活的能力篩選呈陽性的抗體。Sadick，等人(1997)Experimental CellResearch 234354-61。使用用gD標記的人TrkB轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細胞系，檢測從雜交瘤克隆純化的鼠抗體的活化細胞表面受體的能力，所述活化與使用天然配體BDNF和NT-4/5時所見活化相似。天然配體誘導(dǎo)TrkB受體的激酶結(jié)構(gòu)域的自體磷酸化。將細胞暴露于多種濃度的抗體之后，對其裂解和執(zhí)行ELISA以檢測TrkB受體的磷酸化作用。測定各個推定的TrkB激動劑的EC50(在以下表2和圖10顯示)和與天然配體NT-4/5的EC50進行比較。
E15結(jié)狀神經(jīng)元存活測定 獲自E15胚胎的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是由BDNF支持，從而在飽和濃度的神經(jīng)元營養(yǎng)因子下培養(yǎng)48小時的存活率接近100％。在缺少BDNF時，在48小時后少于5％的神經(jīng)元存活。因此，E15結(jié)節(jié)性神經(jīng)元的存活率是評估抗-TrkB抗體的激動劑活性的敏感測定，即，激動劑抗體會促進E15結(jié)節(jié)性神經(jīng)元的存活。
將按時交配的懷孕的Swiss Webster雌性小鼠通過CO2吸入處以安樂死。移出子宮角，并提取在胚胎期E15的胚胎。分離結(jié)節(jié)性神經(jīng)節(jié)，接著用胰蛋白酶消化、機械分離，并在確定的無血清培養(yǎng)液中在用聚-L-鳥氨酸和層粘連蛋白包被的96孔平板中以每孔200-300個細胞的密度平板接種。參考人BDNF，以劑量應(yīng)答的方式一式三份地評估抗TrkB抗體的激動劑活性。對培養(yǎng)48小時的細胞在Biomek FX液體處理工作站(Beckman Coulter)進行自動化免疫細胞化學(xué)操作。該操作包括固定(4％甲醛，5％蔗糖，PBS)、透化(0.3％Triton X-100在PBS中)、非特異性結(jié)合位點的封閉(5％普通山羊血清，0.1％BSA，PBS)并用初級和二級抗體依次孵育以檢測神經(jīng)元。針對蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5，Chemicon)的兔多克隆抗體，其為確立的神經(jīng)元表型標記，被用作初級抗體。Alexa Fluor 488山羊抗-兔(MolecularProbes)被用作二級試劑連同核染料Hoechst 33342(MolecularProbes)來標記在培養(yǎng)液中存在的全部細胞的細胞核。在Discovery-1/Genll圖像儀(Universal Imaging Corporation)執(zhí)行圖像獲取和圖像分析。在Alexa Fluor 488和Hoechst 33342的兩個波長自動獲取圖像，使用核著色作為參考點，因為其存在于所有孔中，用于基于圖像的圖像儀的自動聚焦體系。選擇每個孔的合適目標和數(shù)個成像位點覆蓋各個孔的整個表面?；谟每?PGP9.5抗體的特異性染色，建立自動圖像分析來計算在培養(yǎng)48小時后各個孔中存在的神經(jīng)元的數(shù)目。圖像的精確閾值和形態(tài)學(xué)的應(yīng)用和基于熒光強度的選擇性濾波器得到每孔精確的神經(jīng)元數(shù)值。對于各個推定的TrkB激動劑抗體測定EC50(在以下表1和圖8中顯示)，并與天然配體的EC50進行比較。
下列表格顯示定義的五個抗-TrkB抗體和其對小鼠神經(jīng)元存活的活性和對人TrkB的磷酸化活性 表1五個抗-TrkB抗體對神經(jīng)元存活和磷酸化的影響 將抗-TrkB激動劑抗體對小鼠顱內(nèi)注射雄性C57B6退役種鼠(8-12個月齡)獲自Charles River實驗室(Hollister facility)并使其適應(yīng)控制了溫度/濕度的環(huán)境，12個小時的日/夜循環(huán)，在注射前自由進食和水至少5天。用異氟烷麻醉各個小鼠，以修剪顱上方的毛發(fā)切片。將小鼠固定在立體定位的外科裝置(Kopf model 900)，麻醉并用設(shè)置于培養(yǎng)基的電熱墊保溫。將聚烯吡酮磺擦于頭蓋骨的切刮部分來滅菌該區(qū)域。在顱上制備約1cm長的小的中線經(jīng)度切割，恰好在耳后開始向著眼睛。揭下頭蓋骨，并用棉簽清潔頭蓋骨表面約1cm直徑的圓形空間以除去任何結(jié)締組織。用棉簽沾30％過氧化氫來清潔表面，以暴露前囟點。使用鉆頭作為探針測量頭蓋骨深度，水平和垂直調(diào)節(jié)顱骨以確定其在鉆孔前是水平的。深度的偏差(在前囟點調(diào)零)，從0.5mm近中相對0.5mm側(cè)向，以及0.5mm向前相對0.5mm向后，被最小化在±0.05mm的差異范圍內(nèi)。根據(jù)小鼠腦圖(Franklin，K.B.J.& Paxinos，G.，The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.Academic Press，San Diego，1997)，對單個的、側(cè)向的、下丘腦內(nèi)注射的坐標如下從前囟點向后1.30mm；從正中線-0.5mm；深度，從頭蓋骨(在前囟點)表面5.70mm。通過頭蓋骨鉆小孔，避免接觸腦。將鉆用連接于漢密爾頓氏注射器(84851型)的斜尖的26號注射針代替，并返回至相同的坐標。在2分鐘過程中以量遞增的方式將2μl的化合物注射進外側(cè)下丘腦。注射后將針頭保留在這一位置30秒，然后抬起1mm。另一30秒之后，再抬起該針頭1mm。30秒之后，完全移去該針頭。然后閉合該切口，并用2-9mm傷口夾(Autoclip，Braintree Scientific，Inc.)保持在一起。在第0天執(zhí)行該注射。每天監(jiān)測體重和食物攝取直至第15天。
如在表1(以上)所示，以特定劑量的抗體38B8和36D1的顱內(nèi)注射顯著降低小鼠的體重和食物攝取。以特定劑量給出的對照IgG抗體和23B8，不顯著影響食物攝取或體重。產(chǎn)生抗體38B8的鼠雜交瘤系在2007年11月21號被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并被指定ATCC保藏號PTA-8766。
實施例2TrkB激動劑的鑒定 可以使用本領(lǐng)域承認的方法(包括下列一個或多個方法)鑒定TrkB激動劑(例如抗體)。例如，可以使用在美國專利5,766,863和5,891,650中描述的激酶受體激活(KIRA)測定。這一ELISA-類型測定適合定性或定量的測量激酶活性，通過測量受體蛋白酪氨酸激酶(rPTK，例如Trk受體)的自身磷酸化，以及適合鑒定和表征可能的激動劑或選擇的rPTK的拮抗劑。測定的第一階段涉及激酶受體(在情況下是TrkB受體)的激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，其中該受體存在于真核細胞的細胞膜中。該受體可以是內(nèi)源性受體或編碼所述受體的核酸或受體構(gòu)建體，可以被轉(zhuǎn)化進入細胞。通常，用這類細胞基本均一群(通常是哺乳動物細胞系)包被第一固相(例如，第一測定平板的孔)，從而細胞附著于固相。通常，該細胞是粘附細胞，并由此天然粘著于第一固相。如果使用“受體構(gòu)建體”，其通常包含激酶受體和flag多肽的融合。該flag多肽在ELISA部分的測定中被捕獲劑(通常是捕獲抗體)識別。然后將分析物(例如候選的激動劑)加入具有粘著細胞的孔，從而酪氨酸激酶受體(例如，TrkB受體)被暴露于(或接觸)所述分析物。這一測定使能夠鑒定目標酪氨基激酶受體(例如，TrkB)的激動劑配體。暴露于分析物之后，使用裂解緩沖液(其中具有增溶的去污劑)溶解附著細胞，并溫和振蕩，由此釋放細胞裂解物，可將其直接用于測定的ELISA部分，而無需濃縮或澄清細胞裂解物。
由此制備的細胞裂解物即可接著用于測定的ELISA階段。在ELISA階段的第一步驟，用捕獲劑(通常是捕獲抗體)包被第二固相(通常是ELISA微孔板的孔)，所述捕獲抗體特異性結(jié)合于酪氨酸激酶受體，或在是受體構(gòu)建體的情況下，結(jié)合于flag多肽。進行第二固相的包被，從而該捕獲劑附著于第二固相。該捕獲劑通常是單克隆抗體，但是，如在本實施例中所描述，也可以使用多克隆抗體或其它制劑。然后將獲得的細胞裂解物暴露于或接觸附著的捕獲劑，從而該受體或受體構(gòu)建體附著于(或被捕獲在)第二固相。然后進行清洗步驟，以除去未結(jié)合的細胞裂解物，留下捕獲受體或受體構(gòu)建體。然后，將附著的或捕獲的受體或受體構(gòu)建體暴露于或接觸抗-磷酸酪氨酸抗體，其鑒定在酪氨酸激酶受體中的磷酸化的酪氨酸殘基。在優(yōu)選的實施方案中，將抗-磷酸酪氨酸抗體綴合(直接或間接的)于催化非放射顯色劑的顏色改變的酶。因此，可以通過接下來的試劑顏色改變測量受體的磷酸化。該酶可以被直接結(jié)合于抗-磷酸酪氨酸抗體，或綴合分子(例如，生物素)可以綴合于抗-磷酸酪氨酸抗體，接著該酶可以經(jīng)由綴合分子結(jié)合于抗-磷酸酪氨酸抗體。最后，例如，通過在顯色劑中的顏色改變測量抗-磷酸酪氨酸抗體與捕獲受體或受體構(gòu)建體的結(jié)合。
在最初的鑒定之后，進一步通過已知的測定靶標生物活性的生物測定證實和提煉候選物(例如，抗-TrkB單克隆抗體)的激動劑活性。例如，可以在PC12神經(jīng)突增生測定中使用用全長TrkB轉(zhuǎn)染的PC12細胞測定候選物激動TrkB的能力(Jian等人，Cell Signal.8365-70，1996)。這一測定通過大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)對合適配體刺激的應(yīng)答測量神經(jīng)突進程的增生。這些細胞表達內(nèi)源性TrkA，并因此應(yīng)答NGF。然而，它們不表達內(nèi)源性TrkB，并因此用TrkB表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染以引起對TrkB激動劑的應(yīng)答。在將轉(zhuǎn)染的細胞與候選物孵育之后，測量神經(jīng)突增生，并計數(shù)例如，具有超過細胞直徑2倍的神經(jīng)突的細胞。在經(jīng)轉(zhuǎn)染的PC12細胞中刺激神經(jīng)突增生的候選物(例如，抗-TrkB抗體)證明TrkB激動劑活性。
也可以在胚胎發(fā)育的特異性階段通過使用多個特異性神經(jīng)元測定TrkB的激活。合適選擇的神經(jīng)元的存活可以依賴于TrkB激活，并因此隨著下列這些神經(jīng)元在體外的存活測定TrkB的激活是可能的。如果候選物激活TrkB，向合適的神經(jīng)元的初級培養(yǎng)物加入候選物將導(dǎo)致這些神經(jīng)元的至少數(shù)天期間的存活。這使能夠確定候選物(例如，抗-TrkB抗體)激活TrkB的能力。在這一類型測定的一個例子中，從E15小鼠胚胎分裂、解離結(jié)狀神經(jīng)節(jié)，并將產(chǎn)生的神經(jīng)元以低密度平板接種在組織培養(yǎng)皿中。然后將候選物抗體加入培養(yǎng)液，并將平板孵育24-48小時。這一時間之后，通過多種方法中的任一方法評估神經(jīng)元的存活。與接受對照抗體的樣品相比，接受激動劑的樣品通常呈現(xiàn)增加的存活率，且這使可確定激動劑的存在。見，例如，Buchman等人(1993)Development 118(3)989-1001。
可以在表達TrkB的多種細胞類型通過其激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力鑒定TrkB激動劑，所述細胞是天然的或在轉(zhuǎn)染編碼TrkB的DNA之后表達TrkB。這一TrkB可以是人或其它哺乳動物(例如嚙齒類或靈長類)的TrkB。可以通過改變表達TrkB的細胞的多個生物化學(xué)或生理的參數(shù)，例如蛋白質(zhì)表達水平或蛋白質(zhì)的蛋白磷酸化水平，或改變細胞的代謝或生長狀態(tài)(包括本文所述的神經(jīng)元存活和/或神經(jīng)突增生)來檢測下游信號級聯(lián)。檢測相關(guān)生物化學(xué)或生理參數(shù)的方法是本領(lǐng)域公知的。
實施例3測定抗體結(jié)合親和力 可以通過測量抗體單功能Fab片段的結(jié)合親和力進行確定抗體對TrkB的結(jié)合親和力。為了獲得單功能的Fab片段，可以用木瓜蛋白酶切割抗體(例如，IgG)或重組表達?？贵w的抗-TrkB Fab片段的親和力可以通過表面等離激元測定(BIAcore3000表面等離激元(SPR)系統(tǒng)，BIAcore，INC，Piscaway NJ)。根據(jù)供應(yīng)商的說明書，可以使用N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)激活CM5芯片。人TrkB-Fc融合蛋白(″hTrkB″)(或任何其它的TrkB，例如大鼠TrkB)可以被稀釋在10mM乙酸鈉pH 5.0，并以0.0005mg/ml的濃度注射于激活的芯片。在個體芯片通道使用變速流時間，可以獲得兩個范圍的抗原密度用于詳細動力學(xué)研究的200-400應(yīng)答單位(RU)和用于篩選測定的500-1000RU。用乙醇胺封閉所述芯片。再生研究已經(jīng)顯示，Pierce洗脫緩沖液(產(chǎn)品號21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和4M NaCI(2∶1)的混合物可有效除去結(jié)合的Fab，的混合物時保留在芯片上的hTrkB的活性。使用HBS-EP緩沖液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性劑P29)作為BIAcore測定的電泳緩沖液。將純化的Fab樣品的系列稀釋液(0.1-10x估計的K0)以100μl/min注射1分鐘，并解離至2小時。使用已知濃度(通過氨基酸分析測定)的Fab作為標準物通過ELISA和/或SDS-PAGE電泳測定Fab蛋白質(zhì)的濃度。使用BIAevaluation程序，通過將數(shù)據(jù)擬合至1∶1的Langmuir結(jié)合模式，同時獲得動力學(xué)結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)(通常在25℃測量)(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994)。Methods Enzymology 699-110)。以Koff/kon計算平衡解離常數(shù)(KD)值。
實施例4配體/受體相互作用的動力學(xué)分析，通過Biacore測量 一般方法 使用裝備CM5感應(yīng)芯片的Biacore 3000儀器(Biacore AB，Uppsala，Sweden)在25℃執(zhí)行相互作用分析。HBS-EP電泳緩沖液(用于固定受體)是與胺-偶聯(lián)試劑(NHS、EDC、乙酸鹽pH 4.5和乙醇胺)一起購自Biacore。Fc-融合的重組人受體(TrkA、TrkB、TrkC和P75)和天然配體(NGF、BDNF、NT4/5和NT3)是購自R&D sytems或自己制備。
受體的固定 在低水平(通常500RU或4fmol/mm2)將受體(每個芯片3個)固定在CM5感應(yīng)芯片，留下一個未修飾的流動細胞(每個芯片)作為參考表面。在HBS-EP電泳緩沖液中以5μl/min使用標準胺偶聯(lián)的操作方案并包括三個步驟。簡而言之，這包括三個步驟。首先，使用在50mM NHS中200mM EDC的新鮮制備混合物注射7分鐘來激活流動細胞；這一步驟將芯片的羧酸基團轉(zhuǎn)化為活性酯。接下來，在pH 4.5在10mM乙酸鈉緩沖液中將受體稀釋至～10μg/mL，并偶聯(lián)于芯片直到達到期望的水平。最后，用1M乙醇胺鹽酸鈉(pH 8.5)注射7分鐘封閉多余的活性酯。
配體分析 在電泳緩沖液(10mM Hepes(pH 7.4)，150mM(NH4)2SO4，1.5mM CaCl2，1mM EGTA和0.005％(v/v)吐溫-20)中將配體(NGF、BDNF、NT4/5和NT3)以5倍的梯度稀釋至濃度跨度0.08-250nM。將抗體200.38B8(38B8)的Fab片段以3倍梯度稀釋至從0.7-480nM。將樣品以100μl/min注射30秒使解離時間達10分鐘。在各個結(jié)合周期之后，用溫和的酸性混合物(10mM甘氨酸-HCl(pH 4.0)、500mM NaCl和20mM EDTA)再生受體表面。重復(fù)注射證實該測定是可重現(xiàn)的。通過全面擬合結(jié)合數(shù)據(jù)為物質(zhì)運輸模型來測定動力學(xué)速率常數(shù)(kon和koff)，并由其速率計算結(jié)合親和力，KD＝koff/kon。
結(jié)果 在操作盤中的多數(shù)配體/受體相互作用表征為速率上的快速、限制性擴散，其在Biacore(kon～1x107 1/Ms)的分辨率之上。顯著的例外是ProNGF，其通常表示為慢的速率。解離速率(off rate)是更加可變的，例如，ProNGF或成熟NGF與TrkA的相互作用具有非常慢的解離速率(T1/2＞1小時)，而NT3/TrkA相互作用在數(shù)秒內(nèi)衰變(T1/2＝9秒)。38B8-Fab/TrkB相互作用具有雙相解離速率，所以僅衰變初期被擬合至模型。將受體以低水平包被在芯片上，從而將其空間分開足夠遠(平均而言)這樣二聚化配體不能夠在鄰近受體分子之間分子間順式-橋連。由于空間位阻，在融合了Fc的受體分子的兩臂之間二聚體配體不可能分子內(nèi)的橋連。通過促進其中迫使配體經(jīng)由其兩個可用結(jié)合位點中的僅一個而結(jié)合的條件，我們將親和力問題最小化并合理地將我們的數(shù)據(jù)擬合為簡單的1∶1結(jié)合模型。
表2總體動力學(xué)分析(將結(jié)合根據(jù)親合力由高到低進行排序) 注 1.對于在兩個獨立試驗中分析的那些相互作用給出″平均值±StDev″(即，標準偏差) 2.以斜體顯示的結(jié)合速率表明在Biacore(＞1e7 1/Ms)的分辨率的非常迅速的解離速率，因為它們接近擴散極限。我們使用此作為甄別值(cut-off value)，其意指全部KD僅可被引用作為限制。
3.NB＝對于某些配體/受體配對沒有檢測到結(jié)合(與來自文獻的公知的特異性一致)。
實施例5直接施用TrkB激動劑降低動物中的發(fā)病率 在為支持本發(fā)明而執(zhí)行的試驗中，直接施用TrkB激動劑顯示降低患有CNS特異性自身免疫疾病的動物中的發(fā)病率和CNS組織損害(圖1A和1B)。如在美國專利申請公開2005/0209148中所述產(chǎn)生天然存在的TrkB激動劑NT4的重組形式并在MOG誘導(dǎo)(第0天)之后施用于C57BL/6雌性小鼠。
在MOG誘導(dǎo)后的前10天向動物每日施用NT4(10mg/kg，n＝8)，(圖1A)。向?qū)φ談游锸┯妹劫|(zhì)(n＝8)。
動物的發(fā)病率被計分如下1＝無力尾；2＝中度后肢虛弱；3＝適度的嚴重后肢虛弱(動物仍然能夠艱難行走)；4＝嚴重后肢虛弱(動物可以移動其后肢但是不能行走)；5＝完全的后肢癱瘓；和6＝死亡。與對照動物相比，用NT4治療的動物顯示顯著減少發(fā)病率。這一結(jié)果證明TrkB激動劑可有效減緩慢性EAE的進展。
圖1B顯示在MOG誘導(dǎo)后的不同時期用NT4每日治療的動物的發(fā)病率。用對照IgG(n＝9)、從3天至9天用NT4(n＝8)或從9天至15天用NT4(n＝8)治療動物。兩個施用方案對于減少動物發(fā)病率均有效。當(dāng)早期施用時(即，早期的“脈沖治療”)由NT4提供的保護是比當(dāng)晚期施用時至少同樣好(即便為了治療有效布不是更好)。這些結(jié)果表明，用TrkB激動劑治療不必持續(xù)至癥狀發(fā)作的時間。TrkB激活可以是在EAE誘導(dǎo)中相對上游的靶向步驟。
實施例6鑒定高度選擇性的TrkB激動劑抗體 在實施例1-4中描述了導(dǎo)致鑒定TrkB激動劑抗體的試驗和觀察。進一步表征抗體之一，抗體38B8顯示，盡管標稱結(jié)合于TrkA、TrkC或p75，但該抗體對TrkB是高度選擇性的(圖2)。將38B8Fab片段對TrkA、TrkB、TrkC和p75的相對親和力與天然存在的激動劑NGF、BDNF和NT4的親和力比較。在圖2中的各坐標圖是顯示相對結(jié)合比時間的圖象。抗體38B8是對TrkB特異性的，并顯示對測定的其它受體酪氨酸激酶沒有顯著的結(jié)合。與顯示一些交叉反應(yīng)性的天然存在的激動劑BDNF和NT4相比，38B8對TrkB是甚至有更高的選擇性的。如預(yù)期的，NGF顯示出幾乎不結(jié)合TrkB，并優(yōu)選結(jié)合TrkA和p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體。測定38B8的結(jié)合親和力是46±10nM。實施例4中提供了這些配體-受體相互作用的動力學(xué)分析(包括Kon、Koff和Kd數(shù)據(jù))，特別是在表2中。
BDNF和NT4顯示比38B8抗體激動劑對TrkB具有更高的親和力。然而，用該天然存在的配體的二聚體形式和38B8Fab的單體形式執(zhí)行結(jié)合試驗。此外，抗體通常比生長因子具有更長的循環(huán)半衰期，使它們甚至當(dāng)對于其靶標受體具有較低結(jié)合親和力時是有效的。使用TrkB激動劑抗體用于進一步研究。
實施例7TrkB激動劑抗體在自身免疫疾病中有效降低發(fā)病率 動物試驗顯示與對照免疫球蛋白相比，TrkB激動劑抗體提供顯著的免于EAE發(fā)病的保護(圖3)。在MOG誘導(dǎo)之后，在第9和16天施用5mg/kg激動劑抗體(38B8，n＝9)或?qū)φ誌gG(n＝9)治療小鼠。在MOG誘導(dǎo)后晚至16天和在臨床病征發(fā)作之后施用TrkB激動劑抗體也是有效的(圖4)。較遲的施用，例如，誘導(dǎo)后第18天，減少發(fā)病率的效果較差(圖5A)。基于雙因素方差分析(two-way ANOVAanalysis)，在更遲的治療之后臨床病征的區(qū)別不顯著。
在其它動物中，在MOG誘導(dǎo)之后第22天施用格拉默乙酸酯(GA，COPAXONE，TYSABRI)有效降低發(fā)病率(圖5B)。這些結(jié)果提示TrkB激動劑的作用機制與GA及其它的當(dāng)前MS藥物的機制不同。
將TrkB激動劑抗體與治療MS的另一當(dāng)前藥物地塞米松比較。圖6A描述了顯示動物中發(fā)病率的圖，所述動物是被施用TrkB激動劑抗體38B8(5mg/kg每周在第9和16天)或在第3-12天每日施用地塞米松(4mg/kg)或乙醇媒質(zhì)(對照)之后。該結(jié)果證明TrkB激動劑的有益效果與免疫抑制劑地塞米松相似。與對照動物相比，經(jīng)TrkB激動劑治療的動物傾向于喪失體重(圖6B)。
TrkB激動劑抗體的有益效果是劑量依賴性的。圖7A和7B顯示在施用1(n＝8)或5mg/kg(n＝9)38B8或5(n＝10)和10mg/kg(n＝9)38B8之后，動物發(fā)病率的區(qū)別。該結(jié)果證明5mg/kg激動劑抗體比1mg/kg提供更多免于發(fā)病的保護(即，較少的發(fā)病率)，而與5mg/kg相比，10mg/kg進一步減少發(fā)病率。在更高劑量，保護的增加較不顯著，表明施用額外的TrkB激動劑具有邊緣的治療價值。
實施例8TrkB激動劑抗體和NT保護培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞 使用體外的神經(jīng)元細胞存活測定已經(jīng)顯示，NT促進神經(jīng)元存活(Davies，A.，等人(1993)Neuron 11565-74)。使用相似的測定證明TrkB激動劑抗體以與天然存在的TrkB激動劑一致的方式影響神經(jīng)元細胞(見實施例1)。實際上在對照培養(yǎng)液(即，沒有神經(jīng)營養(yǎng)因子)中的全部神經(jīng)元在48小時之內(nèi)死亡。然而，在BDNF、NT3、NT4或NGF的存在下培養(yǎng)的神經(jīng)元的60-80％存活48個小時(Id.)。
在支持本發(fā)明而執(zhí)行的試驗中，按照前述，將量增加的TrkB激動劑抗體38B8、23B8、36D1、37D12和19H8(見，例如，實施例1，包括表1)加入神經(jīng)元培養(yǎng)液(圖8)。有一些變化，加入量增加的TrkB激動劑抗體導(dǎo)致增加的神經(jīng)元存活(對于38B8在10-100pM范圍內(nèi)高達75％，而對于19H8在0.1-10pM范圍高達100％)。在神經(jīng)元存活測定中抗體38B8的EC50值是0.2pM。在神經(jīng)元存活測定中38B8、23B8、36D1和37D12的EC50值，以及在人KIRA測定中這些抗體的EC50值和它們對動物體重的影響(對TrkB激動劑的識別的應(yīng)答)在實施例1被討論，并在表1中被總結(jié)。注意具有更高的11pM的EC50值的抗體23B8對動物體重不產(chǎn)生影響，表明對于TrkB激動劑生物活性需要低于11pM的EC50值。具有5pM的EC50值的抗體36D1影響動物體重。這些數(shù)據(jù)與對NT的報道結(jié)果一致，證明TrkB激動劑抗體以與天然存在的TrkB激動劑一致的方式影響神經(jīng)元細胞。
實施例9TrkB激動劑不主要通過免疫抑制起作用 治療MS的當(dāng)前藥物(包括GA和地塞米松)是免疫調(diào)節(jié)劑，其顯示免疫抑制和與免疫應(yīng)答有關(guān)的其它影響。為了確定是否TrkB激動劑的治療效果也是在免疫抑制水平，用TrkB激動劑抗體(38B8)或僅媒質(zhì)(對照)治療動物，并測量不同的同種型(即，IgG1、lgG2a、lgG2b、lgG3和IgM)的循環(huán)MOG(髓磷脂)特異性抗體的水平(圖9)。盡管在TrkB激動劑治療之后觀察到MOG-特異性抗體水平的一些變化，似乎不足以解釋動物發(fā)病率的顯著減少。盡管不歸于本發(fā)明的具體機制，該結(jié)果提示TrkB激動劑不是通過抑制抗-MOG抗體的產(chǎn)生而起作用的，因此似乎不如同常規(guī)免疫抑制劑起作用。
為了確定是否TrkB激動劑抑制T-細胞和B-細胞被髓磷脂刺激的能力，使用脾細胞增殖測定測量MOG在TrkB激動劑存在下刺激分離的脾細胞的能力。為了比較，在免疫抑制劑地塞米松存在下用MOG刺激脾細胞。將來自MOG誘導(dǎo)的未治療(對照)動物(n＝9)或MOG誘導(dǎo)的經(jīng)TrkB激動劑抗體(38B8)治療的動物(n＝8)的脾細胞在僅MOG(0)、MOG與TrkB激動劑抗體(38B8；50μl/mg)組合或在兩個不同濃度之一的地塞米松(10-8M和10-5M)的存在下進行體外培養(yǎng)。參考圖10，在Y軸表示脾細胞刺激相對未用MOG體外刺激的脾細胞的不同量。
TrkB激動劑抗體的存在對于脾細胞刺激沒有明顯效果，使用較低濃度的免疫抑制劑地塞米松的情況也是如此。地塞米松在10-5M的更高濃度干擾MOG刺激。
總體而言，從經(jīng)TrkB激動劑治療的動物獲得的脾細胞以與經(jīng)對照治療的動物一致的方式應(yīng)答MOG刺激，表明用TrkB激動劑治療的動物保留產(chǎn)生正?？?MOG T-細胞和/或B-細胞應(yīng)答的能力。此外，從經(jīng)TrkB激動劑治療的動物和對照動物獲得的脾細胞對于在培養(yǎng)基中TrkB激動劑的存在應(yīng)答相似。這些觀察進一步提示免疫抑制劑地塞米松和TrkB激動劑的作用機制是不同的，且TrkB激動劑的作用機制在白細胞增殖水平不是主要的。
實施例10TrkB激動劑阻斷炎癥細胞侵襲CNS，并減少脫髓鞘 執(zhí)行組織學(xué)分析以更好理解在動物中由TrkB激動劑介導(dǎo)的保護機制。從對照和經(jīng)TrkB激動劑抗體(38B8)治療的動物制備脊椎切片，和然后用勒克司堅牢藍染色髓磷脂，并用甲酚紫染色細胞體(圖11)。在對照動物中，該染色顯示白細胞侵襲區(qū)和相對表達髓磷脂的神經(jīng)元細胞的背景的細胞破壞。在從用TrkB激動劑治療的動物制備的切片觀察到減少的白細胞侵襲。一些經(jīng)TrkB激動劑治療的動物顯示實際上沒有CNS白細胞侵襲的跡象。
使用對兩個白細胞標識物特異性的抗體進行侵襲細胞的鑒定，所述白細胞標識物是存在于T-細胞上的CD3和存在于巨噬細胞上的CD68。圖12顯示用CD3抗體染色的結(jié)果。多個亮染色的點區(qū)域是明顯的，特別是在用甲酚紫深染色的相同區(qū)域。從經(jīng)TrkB激動劑治療的小鼠獲得的脊椎切片顯示顯著弱著色，提示T-細胞侵襲在經(jīng)治療的動物中大量減少。也用對與單核細胞相關(guān)的CD68標識物特異性的抗體染色脊椎切片(圖13)。從對照小鼠制備的切片比來自經(jīng)TrkB激動劑治療的小鼠的切片染色更強烈，特別是在用甲酚紫和CD3特異性抗體強染色的相同區(qū)域。這類觀察表明，與對照動物相比，來自經(jīng)TrkB激動劑治療的動物的脊椎組織顯示T-細胞和單核細胞侵襲實質(zhì)性減少。
用勒克司堅牢藍染色脊椎切片測量脫髓鞘。對應(yīng)于具有重度淋巴細胞侵襲的區(qū)域，對照小鼠的腦顯示嚴重脫髓鞘的區(qū)域(即，缺少著色，如在圖14中由黑色箭頭指示的)，其在用TrkB激動劑治療的小鼠中不明顯。在來自經(jīng)TrkB激動劑治療動物的切片中未觀察到嚴重的脫髓鞘和/或神經(jīng)元死亡的區(qū)域。綜上，CNS組織切片的組織化學(xué)染色結(jié)果證明TrkB激動劑治療降低CNS的淋巴細胞和單核細胞侵襲。
天然存在的和人工的TrkB激動劑在減緩EAE進展中都是有效的。天然存在的激動劑NT4和激動劑抗體對于減慢疾病進程都是有效的。激動劑抗體顯示出對TrkB具有最大選擇性，并被用于進一步研究TrkB激動劑影響EAE進展的機制。當(dāng)在EAE癥狀發(fā)作(通常對于這些具體動物是第12或13天)之前和幾天之后施用TrkB激動劑是有效的。在MOG誘導(dǎo)之后施用至16天(或在癥狀發(fā)作之后約4天)對于減少發(fā)病率是有效的。TrkB激動劑的有益效果是劑量依賴性的，減少的發(fā)病率與TrkB激動劑的劑量增加相關(guān)聯(lián)。組織化學(xué)試驗顯示TrkB激動劑降低T-細胞和單核細胞對CNS組織的侵入。對髓磷脂的染色顯示在經(jīng)TrkB激動劑治療的動物中對神經(jīng)細胞損害降低。
與在測定中測試的其它藥物不同，TrkB激動劑不是主要通過免疫抑制起作用。這是由觀察到的TrkB激動劑不影響M0G特異性自身免疫抗體的產(chǎn)生而證明的。此外，從用TrkB激動劑治療的MOG誘導(dǎo)的動物中分離的脾細胞保留了在體外由MOG刺激的能力。因此，TrkB激動劑以與其它化合物(例如GA和地塞米松)不同的方式起作用。
應(yīng)該理解的是，這里所述的實施例和實施方案是僅用于說明目的和暗示本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該考慮到對其的多種修飾或改變和這些修飾或改變被包括在本申請的精神和范圍內(nèi)。本文引用的全部公開案、專利和專利申請是以其整體通過參考被并入，其引用程度就如同將每一個別公開案、專利或?qū)＠暾埌柑囟ㄇ覀€別地以全其整體通過參考方式被并入。
權(quán)利要求
1.TrkB激動劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療影響哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述自身免疫性疾病是試驗性自身免疫性腦脊髓炎。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化。
4.權(quán)利要求1的用途，其中所述TrkB激動劑是天然存在的TrkB激動劑。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述天然存在的TrkB激動劑是NT4。
6.權(quán)利要求4的用途，其中所述天然存在的TrkB激動劑是BDNF。
7.權(quán)利要求1的用途，其中所述TrkB激動劑是抗體。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述TrkB激動劑是抗體片段或其衍生物。
9.由ATCC保藏號PTA-8766進行保藏的雜交瘤系產(chǎn)生的分離的單克隆TrkB激動劑抗體。
10.雜交瘤系，其以ATCC保藏號PTA-8766進行保藏。
全文摘要
本發(fā)明提供酪氨酸受體激酶(TrkB)激動劑減少在自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白細胞侵襲。TrkB激動劑包括天然存在的激動劑，例如NT4和BDNF，以及激動劑例如激動劑抗體。
文檔編號C07K16/18GK101605556SQ200780047255
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者林家揚, 華 龍, D·曹 申請人:瑞納神經(jīng)科學(xué)公司