專利名稱：Aire基因第七號外顯子多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及AIRE基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及分析AIRE基因第七號外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術(shù)：
AIRE(autoimmune regulator)基因是一種自體免疫調(diào)節(jié)因子，具體功能雖然還不是非常清晰，但它所包含的鋅指結(jié)構(gòu)(zinc fmger motifs)表明它是一個轉(zhuǎn)錄因子。其編碼的蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。缺失該基因會導(dǎo)致常染色體隱性自體免疫性疾病APECED(autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermaldystrophy)。(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi？l＝326)在本申請之前，還沒有AIRE基因第七號外顯子多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供AIRE基因第七號外顯子的多態(tài)性及其檢測方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測人AIRE基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人AIRE基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第168位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第168位存在C。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第168位為C。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人AIRE基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第168位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人AIRE基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第168位單核苷酸多態(tài)性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴(kuò)增人AIRE基因第七號外顯子的引物對，(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的AIRE基因第七號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第168位單核苷酸多態(tài)性。
另一種診斷試劑盒包括本發(fā)明上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了AIRE基因第七號外顯子所編碼的蛋白序列中第12位Arg(R)->Ser(S)多態(tài)(即mRNA上168位G->C多態(tài)性)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對正常人AIRE基因測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了該SNP。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致12位氨基酸由Arg(R)->Ser(S)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會導(dǎo)致AIRE基因第七號外顯子所編碼的蛋白的活性發(fā)生改變。
AIRE基因第七號外顯子的eDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開放閱讀框?yàn)榈?34-214位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。AIRE基因第七號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測AIRE基因第七號外顯子中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發(fā)明的檢測方法被用于評估個體患AIRE基因第七號外顯子相關(guān)疾病的易感性。
用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于檢測AIRE基因第七號外顯子活性而言，可以任何含有AIRE基因第七號外顯子的樣品，如血液等。
用于本發(fā)明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據(jù)AIRE基因第七號外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成即可。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因的抽提和測序用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。引物是有義引物5’-ggaacagcgt tgcctctgg-3’(SEQ ID NO3)反義引物5′-gagctgtaccctgtgggtagg-3′(SEQ ID NO4)擴(kuò)增出的426bp的產(chǎn)物，純化后進(jìn)行DNA測序。
實(shí)施例2SNP的獲得對AIRE基因進(jìn)行直接測序。將測定的各樣本序列進(jìn)行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實(shí)施例3檢測試劑盒制備一檢測AIRE基因相關(guān)疾病易感性的檢測試劑盒，其中，含有下列可擴(kuò)增出168位SNP的引物對有義引物5’-ggaacagcgt tgcctctgg-3’(SEQ ID NO3)
反義引物5′-gagctgtaccctgtgggtagg-3′(SEQ ID NO4)對擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，可輕易地檢測出168位的G->C型SNP。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>AIRE基因第七號外顯子多態(tài)性<130>030115<160>4<170>Patent In version 3.1<210>1<211>347<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(134)..(214)<223>
<400>1ggaacagcgt tgcctctggg ggaatggctc tgctgggggc tgggggctgc tgccgagaga 60cgcctggtgc cacagccatg tgcaccctcg ctgctgagac tgcccccatt gctgacgccc120ctcttccttg cag ggt gga ggt gag gct agg ctg ggc cag cag ggc agg 169Gly Gly Gly Glu Ala Arg Leu Gly Gln Gln Gly Arg1 5 10gtt ccc gcc cct ctg gcc ctc ccc agt gac ccc cag ctc cac cag 214Val Pro Ala Pro Leu Ala Leu Pro Ser Asp Pro Gln Leu His Gln15 20 25gtaatgccct agaccacagg agaggcccct gtctgccctt gctcccctcg ggtgggtcct274gctgcctctg cctttacctg ggcactcagg gatgagcacc ggggcctgag cccctaccca334cagggtacag ctc 347<210>2<211>27<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2
Gly Gly Gly Glu Ala Arg Leu Gly Gln Gln Gly Arg Val Pro Ala Pro1 5 10 15Leu Ala Leu Pro Ser Asp Pro Gln Leu His Gln20 25<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ggaacagcgt tgcctctgg 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gagctgtaccctgtgggtagg 2權(quán)利要求
1.一種檢測人AIRE基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人AIRE基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第168位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是在第168位存在C。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第168位為C。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人AIRE基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第168位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人AIRE基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第168位單核苷酸多態(tài)性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴(kuò)增人AIRE基因第七號外顯子的引物對，(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的AIRE基因第七號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第168位單核苷酸多態(tài)性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求4所述的引物和/或權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及AIRE基因第七號外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明提供了分析AIRE基因第七號外顯子的SNP或其活性的方法。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人AIRE基因第七號外顯子的第168位的G－＞C多態(tài)性。該SNP導(dǎo)致編碼蛋白第12位發(fā)生R－＞S改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號C07H21/00GK1519346SQ03115040
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 黃 薇 申請人:上海人類基因組研究中心