一種亞健康康復(fù)用自體免疫細(xì)胞新技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是將自體免疫細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)用于亞健康康復(fù)，涉及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)人類進(jìn)入二十一世紀(jì)，生命質(zhì)量的提高和生命時(shí)間的延長，人們對健康的需求 日益強(qiáng)烈，對疾病認(rèn)識的水平也不斷提高。醫(yī)學(xué)的發(fā)展也從過去的疾病治療策略轉(zhuǎn)向生 物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式，當(dāng)今醫(yī)學(xué)的主題是預(yù)防疾病，特別是亞健康人群的保健。一項(xiàng) WHO的調(diào)查顯示：真正健康的人群僅占5 %，疾病者為20 %，而75 %的人群處于亞健康狀況。 我國亞健康人群約為70%。何為亞健康，它是指是介于健康和疾病之間的一種生理功能低 下的狀態(tài)，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)明顯身心不適現(xiàn)象但機(jī)體無結(jié)構(gòu)和代謝的異常。亞健康狀態(tài)是 沒有明顯臨床癥狀的，也不能用相關(guān)臨床診斷指標(biāo)確診，而疾病的發(fā)生往往都有個(gè)量變到 質(zhì)變的發(fā)展過程，亞健康狀態(tài)正是從健康向疾病發(fā)展的過渡階段。常見"亞健康"狀態(tài)表 現(xiàn)：渾身無力，容易疲倦，思想渙散，頭痛，耳鳴，眼睛疲勞，鼻塞眩暈，咽喉異物感，手足發(fā)涼 麻木，便秘，頸肩僵硬，胃悶不適，睡眠不良，心悸氣短，容易暈車，起立時(shí)眼前發(fā)黑，早晨起 床有不快感等。關(guān)于亞健康病因?qū)W說，當(dāng)前比較流行的是免疫學(xué)說、自由基學(xué)說，同時(shí)與遺 傳背景相關(guān)。亞健康的治療目前常用的方法有傳統(tǒng)療法、心理疏導(dǎo)、運(yùn)動療法、營養(yǎng)療法等， 這些療法具有一定的效果，但不能很好地改善亞健康人群身體狀況。
[0003] 免疫系統(tǒng)是人體最重要的組成部分，是人體健康的保護(hù)墻，由免疫器官（骨髓、胸 腺、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、小腸集合淋巴結(jié)、闌尾、胸腺等）、免疫細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核吞噬 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板等）和免疫分子（補(bǔ)體、免疫 球蛋白、干擾素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等）等組成，起著免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān) 視的功能。免疫系統(tǒng)功能紊亂，尤其是免疫細(xì)胞的質(zhì)和量的改變會對機(jī)體健康產(chǎn)生重大影 響。亞健康狀態(tài)時(shí)，人體生理功能下降，免疫力低下，導(dǎo)致身體疾病癥狀加重和身體的社會 功能的缺陷，致使慢性疾病的調(diào)節(jié)機(jī)能削弱，進(jìn)而引起軀體功能性或器質(zhì)性病變。這種改變 正是免疫細(xì)胞發(fā)生了變化，如在消極情緒狀態(tài)下淋巴細(xì)胞增殖減少，自然殺傷細(xì)胞活性降 低，血液循環(huán)中白細(xì)胞和抗體的數(shù)量改變，導(dǎo)致免疫功能減退。免疫系統(tǒng)是一個(gè)高度復(fù)雜的 系統(tǒng)，它與機(jī)體內(nèi)部其它各系統(tǒng)、各臟器相輔相成，幫助我們抵御外部微生物的侵入。免疫 系統(tǒng)功能的低下將會導(dǎo)致：①免疫防御功能降低，各種來自外界的病毒、細(xì)菌入侵人體，導(dǎo) 致感冒和腹瀉。②機(jī)體自身穩(wěn)定破壞，協(xié)調(diào)系統(tǒng)內(nèi)各細(xì)胞、器官之間的能力下降，導(dǎo)致身體 出現(xiàn)一些異常癥狀，如內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，在女性會出現(xiàn)月經(jīng)失調(diào)而經(jīng)前腹痛、煩躁易怒、面 色萎暗和肥胖等；神經(jīng)系統(tǒng)紊亂就容易出現(xiàn)心悸、多夢、失眠等癥狀；同時(shí)會出現(xiàn)過敏如常 因花粉、塵埃、動物皮毛、藥物、食物敏感而打噴嚏、流眼淚、臉部瘙癢、皮疹等免疫反應(yīng)。③ 免疫細(xì)胞監(jiān)視能力降低。亞健康狀態(tài)時(shí)，人們常輕微發(fā)燒、咽喉痛、淋巴結(jié)腫大、注意力不易 集中、全身無力、體內(nèi)荷爾蒙代謝失調(diào)。長久以后引起正常細(xì)胞的異常突變，由于機(jī)體清除 能力下降，使得這些細(xì)胞得以繁殖擴(kuò)散而最終形成腫瘤。
[0004] 免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主角，改善和提高免疫系統(tǒng)細(xì)胞的質(zhì)和量是亞健康康復(fù)的 關(guān)鍵。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killers, CIK)，是將亞健康者外周 血淋巴細(xì)胞在體外與多種細(xì)胞因子共培養(yǎng)后所獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞。CIK細(xì)胞具有增殖 快速、殺傷能力強(qiáng)、具有廣譜殺傷效應(yīng)、對正常細(xì)胞無損傷作用、可調(diào)整人體的免疫狀態(tài)、刺 激骨髓造血等重要作用，是目前已知活性最高的非特異性殺傷免疫效應(yīng)細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞 (dendritic cell, DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，也是唯一能激活幼稚T細(xì) 胞的抗原遞呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特地位。它最重要的作用是可攝取腫瘤抗 原，提呈給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)、激活、增殖細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)，從而介導(dǎo)強(qiáng)大的特異性 細(xì)胞免疫功能。同時(shí)DC細(xì)胞對機(jī)體還可以發(fā)揮非特異性免疫保護(hù)作用。DC細(xì)胞和CIK細(xì) 胞共培養(yǎng)（DCIK)可以相互促進(jìn)對方的保護(hù)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提高彼此的免疫功效。利用 亞健康者外周血免疫細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的DCIK細(xì)胞回輸，啟動人體免疫機(jī)制，提高 人體免疫力，可使亞健康者提高生活質(zhì)量，增強(qiáng)食欲、改善睡眠、增強(qiáng)體力，且安全無毒副作 用，是任何傳統(tǒng)康復(fù)法所無法比擬的。通過體外體內(nèi)法將自體免疫細(xì)胞回輸可使亞健康者 恢復(fù)其原有的健康狀況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種亞健康康復(fù)新技術(shù)，它是獲取亞健康者外周血，并在100 級GMP廠房分離單個(gè)核細(xì)胞，添加相關(guān)營養(yǎng)因子等誘導(dǎo)培養(yǎng)并經(jīng)質(zhì)檢，合格的免疫細(xì)胞回 輸給亞健康者本人，達(dá)到其康復(fù)的目的。這種自體免疫細(xì)胞康復(fù)無需配型，無需檢測特定的 病毒，簡單易行、安全可靠，并具有良好的康復(fù)效果。
【具體實(shí)施方式】
[0006] 通過本實(shí)施例來具體說明本發(fā)明一種亞健康康復(fù)用自體免疫細(xì)胞新技術(shù)，將亞健 康者外周血單個(gè)核細(xì)胞分離，并誘導(dǎo)培養(yǎng)用于亞健康自身康復(fù)。本發(fā)明操作步序如下：
[0007] (1)亞健康人群篩選，入選者年齡35-55歲成年男女，沒有重大疾病，身體狀況穩(wěn) 定。參與者進(jìn)行健康問卷、自評、問診、一級檢查和二級檢查。評價(jià)結(jié)果符合亞健康標(biāo)準(zhǔn)即 疲勞（休息不能緩解的疲勞；往常從事的活動下降50% )加任意6項(xiàng)次要癥狀（①畏寒、 低熱，②咽喉不適，③淋巴結(jié)腫大，④不能解釋的全身無力感，⑤肌肉酸痛，⑥頭痛，⑦日常 活動后疲勞感不能回復(fù)，⑧關(guān)節(jié)疼痛，⑨睡眠紊亂，⑩精神、神經(jīng)癥狀；急性、亞急性出現(xiàn)） 和任意2條體征（①頸淋巴結(jié)腫大< 2cm，②低熱，②咽喉炎），或者疲勞加任意8項(xiàng)次要癥 狀。自我評價(jià)（早上起床時(shí)發(fā)絲掉落，情緒抑郁，健忘，工作令人厭倦，有自閉癥式的渴望， 工作效率明顯下降，身體倦怠，工作情緒無法高漲，進(jìn)餐少，盼望早點(diǎn)逃離辦公室，對污染、 噪聲非常敏感，比常人渴望清幽，不再熱衷于朋友聚會，經(jīng)常失眠，體重明顯下降，易感冒， 性能力下降）大于等于50分。一般身體檢查正常，二級檢查包括免疫細(xì)胞分類（總T淋巴 細(xì)胞、總B淋巴細(xì)胞、輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞、抑制/殺傷T細(xì)胞、r / & T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK-T細(xì) 胞，總白細(xì)胞及分類，DC細(xì)胞，CIK細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞即Treg、髓源性抑制細(xì)胞即MDSCs)、 免疫細(xì)胞功能（T、B、NK免疫細(xì)胞增殖檢測，超敏反應(yīng)）、免疫分子（補(bǔ)體、免疫球蛋白、干擾 素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子）和SOD (superoxide dismutase，超氧化物歧化酶）檢測有 三項(xiàng)以上陽性或者高于/低于正常值。根據(jù)這些結(jié)果制定康復(fù)方案，即自體免疫細(xì)胞康復(fù) 療程及輔以心理疏導(dǎo)、飲食調(diào)整、生理（包括休息、鍛煉等）調(diào)節(jié)、傳統(tǒng)康復(fù)（中藥、推拿按 摩、針灸艾灸等）。
[0008] (2)自體免疫細(xì)胞的采集。無菌條件下靜脈抽取亞健康者外周血50毫升，肝素 (20U / mL)抗凝，混勻并填寫樣本信息表，在4°C無菌環(huán)境下運(yùn)至100級G M P車間加工。
[0009] (3)自體免疫細(xì)胞在GMP車間培養(yǎng)誘導(dǎo)。①CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增。在百 級G M P車間條件下，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將分離得到的 單個(gè)核細(xì)胞（用毛細(xì)管插到云霧層，該層白色略帶黃色）按照細(xì)胞濃度為5X10 5 / ml接種 于 PRMI1640 培養(yǎng)基，添加 1000u / ml of IFN-gama、100u / ml of IL-la、500u / ml of IL-2細(xì)胞因子、lOOu / ml青霉素、lOOu / ml鏈霉素，1%自體血清，置37°C、5%C02條件下 常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)上清液（粘附細(xì)胞供DC細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增所用）即非粘附性 細(xì)胞至另一經(jīng)5ug / ml of anti-⑶3單抗包被的培養(yǎng)瓶，在37°C、5%C02條件下常規(guī)培養(yǎng) 7天，期間3-4天更換培養(yǎng)液并添加細(xì)胞因子及血清，此為CIK (cytokine induced killer, 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）細(xì)胞。未轉(zhuǎn)移的粘附細(xì)胞用PRMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)并添加 100u / ml 青霉素、100u / ml 鏈霉素、1000u / ml of GM-CSF、500u / ml of IL-4 及 2% 的自體血清等培養(yǎng)7天，期間更換一次培養(yǎng)液并添加相應(yīng)因子和血清，此為DC (dendritic cells，樹突狀細(xì)胞）細(xì)胞。②DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)及分子表達(dá)的檢測：將培養(yǎng)7天的DC 和CIK細(xì)胞以1 :3比例混合，培養(yǎng)液為上述CIK細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C、5 % C02條件下常規(guī)培 養(yǎng)7天，期間3-4天更換培養(yǎng)液并添加細(xì)胞因子及血清。檢測粘附細(xì)胞DC細(xì)胞表達(dá)CD80、 ⑶40、MHC-DR、IL-12水平及非粘附細(xì)胞CIK表達(dá)⑶28、⑶40和⑶40L的表達(dá)水平。
[0010] (4)免疫細(xì)胞制劑的質(zhì)量控制。細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)完成或培養(yǎng)過程中進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的 檢測，這些指標(biāo)包括：
[0011] ①無菌檢測。?細(xì)菌檢測：參照藥典2010版附錄XII A無菌檢測法或用BD公司 的血細(xì)菌培養(yǎng)瓶，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液3-5ml于BD血細(xì)菌培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)儀培養(yǎng)2周后觀 察結(jié)果。另一種簡易方法是將細(xì)胞培養(yǎng)上清液離心后取沉淀物涂片革蘭氏染色鏡檢。結(jié)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性。?內(nèi)毒素檢測：參照藥典2010版附錄XII E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，內(nèi)毒素限 值的確定按照相關(guān)說明計(jì)算。?支原體檢測：參照藥典2010版附錄XII B支原體檢查法， 結(jié)果應(yīng)為無支原體生長。
[0012] ②生物活性檢測。效應(yīng)細(xì)胞DCIK體外生物活性分析（以同源CIK細(xì)胞、DC細(xì)胞 作為對照），將誘導(dǎo)培養(yǎng)的DCIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞分別加適量培養(yǎng)液（上述CIK細(xì) 胞培養(yǎng)液），計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度4X106個(gè)/ml，并經(jīng)培養(yǎng)液倍比稀釋后其密度各分別為： 4\106、2\106、1\10 6和0.5父106個(gè)/1111。靶細(xì)胞4549的準(zhǔn)備：貼壁生長細(xì)胞用胰蛋白 酶消化液處理、離心后，取懸浮