專利名稱：自體胸水上清培養(yǎng)til細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法，特別涉及一種利用自體胸水上清培養(yǎng)TIL細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，簡稱TIL)是繼LAK細(xì)胞之后第二代抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，抗腫瘤活性較LAK細(xì)胞強(qiáng)50～100倍，成為臨床上主要應(yīng)用抗腫瘤細(xì)胞免疫治療的手段選擇之一。
在本發(fā)明作出之前，制備TIL的方法主要是經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心法分離獲得TIL，然后在體外用人工合成的培養(yǎng)基，通常是含有10％人AB型血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2周左右時間，再回輸病人胸腔，殺傷病人體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。這種TIL培養(yǎng)方法存在著諸多缺陷。一是體外培養(yǎng)時間過長，增加了污染機(jī)率，導(dǎo)致不能回輸；二是有血清培養(yǎng)基應(yīng)用人AB型血清，具有潛在的導(dǎo)致乙肝、愛滋病等傳染病的可能；三是培養(yǎng)時間長、使用人AB型血清導(dǎo)致成本增加，增加了病人的財務(wù)負(fù)擔(dān)，也延長了病人的治療時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研究、開發(fā)了一種利用病人自己胸水上清培養(yǎng)TIL細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案自體胸水上清培養(yǎng)TIL細(xì)胞的方法，無菌收集癌性胸水，離心后保存上清，用淋巴細(xì)胞分離液分離下層細(xì)胞，去除下層細(xì)胞中的紅細(xì)胞、壞死組織碎片，其主要技術(shù)特征在于(1)將上清留作培養(yǎng)基；(2)取下層細(xì)胞中的白膜層細(xì)胞至上清培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)12～24小時后，腫瘤細(xì)胞全部貼壁，懸浮的是TIL細(xì)胞；(4)將濃度在5×105/ml～1×106/ml的TIL細(xì)胞置于飽和濕度、5％二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在37℃內(nèi)；(5)1天后，加入終濃度50～100ng/ml的OKT3、800～6000U/ml的IL-2、50～100ug/ml的PHA；(6)隔1～2天，加入含800～6000U/ml的IL-2的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于體外培養(yǎng)時間約在2～3天內(nèi)完成，大大節(jié)約了時間，減輕病人的痛苦，降低病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；當(dāng)其活化后即可回輸體內(nèi)進(jìn)一步培養(yǎng)，避免了自身資源的浪費(fèi)，減少了體外培養(yǎng)時污染的機(jī)率，也避免了有血清培養(yǎng)基所可能導(dǎo)致的各種傳染病的傳染發(fā)生；其方法本身過程簡單、易于操作，花費(fèi)少，效果好。
具體實(shí)施例方式
無菌收集患者的癌性胸水各約1000ml，立即在百級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行TIL與腫瘤細(xì)胞的分離，胸水離心后，保存上清留作培養(yǎng)基；下層細(xì)胞應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，取白膜層細(xì)胞用留作培養(yǎng)基的自體上清培養(yǎng)，12～24小時，一般取16小時，可見腫瘤細(xì)胞全部貼壁，懸浮細(xì)胞幾乎都是TIL；將得到的TIL按1×106/ml的濃度懸于自體上清中，置于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)；在24小時內(nèi)，即一天后加入終濃度為100ng/ml的OKT3、6000U/ml的IL-2、100ug/ml的PHA；隔1～2天，加入含6000U/ml的IL-2的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)所獲得的TIL在3天即回輸患者胸腔，治療惡性胸水。
將TIL應(yīng)用自體胸水上清培養(yǎng)與TIL用含10％人AB型血清的RPMI 1640培養(yǎng)進(jìn)行對比。
在培養(yǎng)的第3、7、14、21天，經(jīng)t檢驗(yàn)比較對TIL擴(kuò)增速率的影響發(fā)現(xiàn)，二者間無統(tǒng)計(jì)意義上的差別，P＞0.05；自體上清培養(yǎng)的TIL各亞型與用含10％人AB型血清的RPMI 1640培養(yǎng)的TIL各亞型所占比例間無統(tǒng)計(jì)意義上的差別，P＞0.05；培養(yǎng)一周后，用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的TIL對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性與培養(yǎng)前及培養(yǎng)第3天的殺傷活性比較，差異顯著，自體上清組尤為顯著；培養(yǎng)一周后，其殺瘤活性明顯提高，P＜0.05，以自體上清組最為明顯；兩種培養(yǎng)方法培養(yǎng)的TIL在第3天及第7天的殺瘤活性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
應(yīng)用自體上清作為培養(yǎng)基培養(yǎng)TIL，結(jié)果證明，對TIL的生長速度、免疫表型變化及對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性與含有10％人AB型血清的RPMI 1640培養(yǎng)基間無差異，因此自體上清作為培養(yǎng)基培養(yǎng)TIL是可行的；TIL分離后，短期培養(yǎng)3天，當(dāng)其開始出現(xiàn)增殖、抑制狀態(tài)可能剛被解除時回輸體內(nèi)，繼續(xù)依賴自體胸水存活并進(jìn)一步擴(kuò)增，發(fā)揮殺瘤效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.自體胸水上清培養(yǎng)TIL細(xì)胞的方法，無菌收集癌性胸水，離心后保存上清，用淋巴細(xì)胞分離液分離下層細(xì)胞，去除下層細(xì)胞中的紅細(xì)胞、壞死組織碎片，其特征在于(1)將上清留作培養(yǎng)基；(2)取下層細(xì)胞中的白膜層細(xì)胞至上清培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)12～24小時后，腫瘤細(xì)胞全部貼壁，懸浮的是TIL細(xì)胞；(4)將濃度在5×105/ml～1×106/ml的TIL細(xì)胞置于飽和濕度、5％二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在37℃內(nèi)；(5)1天后，加入終濃度50～100ng/ml的OKT3、800～6000U/ml的IL-2、50～100ug/ml的PHA；(6)隔1～2天，加入含800～6000U/ml的IL-2的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用自體胸水上清進(jìn)行TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明采用將收集的癌性胸水離心后保存上清，用作培養(yǎng)基，將下層細(xì)胞中的白膜層細(xì)胞至該上清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得懸浮的TIL細(xì)胞，再至孵箱內(nèi)培養(yǎng)，1天后加入OKT3、IL－2、PHA等，1、2天再加入IL－2進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明該方法是可行的，與現(xiàn)有方法相比，某些方面相同，某些方面更優(yōu)。而本發(fā)明卻避免了現(xiàn)有方法使用人AB血清可能導(dǎo)致的乙肝、愛滋病等傳染，體外培養(yǎng)時間過長所增加的污染機(jī)率，以及培養(yǎng)時間過長增加病人負(fù)擔(dān)，延長治療時間和成本增加等缺陷。
文檔編號C12N5/08GK1560234SQ20041001409
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月18日
發(fā)明者劉寶瑞, 鄒征云 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院