專利名稱：用于治療炎癥、自體免疫或過敏性疾病的結(jié)合劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療炎癥、自體免疫或過敏性疾病的特定結(jié)合劑。
CD23(FCεRII)是C外源凝集素家族的II型分子，該家族還包括淋巴細(xì)胞尋靶(homing)受體(MEL-14)和內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子1(ELAM-1)。CD23是IgE的低親和性受體。人體中許多造血細(xì)胞類型在其表面表達(dá)CD23，包括囊泡狀樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。CD23分子還以可溶形式存在于生物液體中?？扇苄訡D23(sCD23)分子是由跨膜受體的蛋白水解切割形成的。CD23具有多效活性，包括介導(dǎo)細(xì)胞粘附，調(diào)節(jié)IgE和組胺釋放，使B細(xì)胞免于凋亡，調(diào)節(jié)髓細(xì)胞生長。這些功能活性是由與細(xì)胞相連的CD23或sCD23的特定配體相結(jié)合而介導(dǎo)的，sCD23的作用方式類似細(xì)胞因子(Conrad，D.H.，免疫學(xué)年度綜述(Annu Rev Immunol)8，623-645(1990)；Delespesse，G.等，免疫學(xué)進(jìn)展(Adv Immunol)49，149-191(1991)；Bonnefoy，J.Y.等，免疫學(xué)當(dāng)代觀念(Curr Opin Immunol)5，944-947(1993))。
在許多炎癥中觀察到CD23表達(dá)增加。在慢性滑膜炎(synovitis)患者的滑液活檢組織檢查中鑒定出CD23，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清和滑液中檢測到sCD23濃度超過正常水平(Bansal，A.S.，Oliver，W.，Marsh，M.N.，Pumphrey，R.S.和Wilson，P.B.，免疫學(xué)(Immunology)79，285-289(1993)；Hellen，E.A.，Rowlands，D.C.，Hansel，T.T.，Kitas，G.D.和Crocker，J.J.，臨床病理學(xué)(Clin Pathol.)44，293-296(1991)；Chomarat，P.，Brioloay，J.，Banchereau，J.和Miossec，P.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Arthritis Rheum.)86，234-242(1993)；Bansal，A等，臨床實驗免疫學(xué)(Clin Exp Immunol.)89，452-455(1992)；Rezonzew，R和Newkirk，M.M.，臨床免疫學(xué)和免疫病理學(xué)(ClinImmunol Immunopathol)，71，156-l63(1994)。另外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清sCD23水平與疾病狀態(tài)有關(guān)，并與血清類風(fēng)濕因子相關(guān)(Bansal，A.S.等，臨床實驗類風(fēng)濕病學(xué)12，281-285(1994))。前炎性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子好象在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中特別重要，據(jù)推測，TNF-α和IL-1β在關(guān)節(jié)的破壞中起關(guān)鍵作用(Brennan，F(xiàn).M.，Chantry，D.，Jackson，A.，Maini，R.和Feldman，M.Lancet，2，244-247(1989)；Brennan，F(xiàn).M.，Maini，R.M.和Feldman，M.英國類風(fēng)濕病學(xué)雜志(BrJ Rheumatol)31，293-298(1992))。
還推測CD23-CD23相互作用在調(diào)節(jié)IgE生成中起作用(Flores-Romo，L.等，科學(xué)(Science)261，1038-1041(1993)；Aubry等，自然(Nature)358，505-507(1992))。
CD11b和CD11c是參與許多細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的粘附分子。據(jù)報道，CD11b/CD18和CD11c/CD18(分別是CD11b與CD18以及CD11c與CD18的聯(lián)合)結(jié)合許多配體，包括CD54，血纖維蛋白原，X因子，LPS，ConA和酵母聚糖(Springer，T.A.，自然346，425-434(1990))。但這些結(jié)合因子的作用尚未被完全了解，CD11b/CD18和CD11c/CD18又分別被稱為MAC-1和P150，95。它們是β2整合素家族的成員(有時被稱為Leu-CAM，即白細(xì)胞粘附分子)。該家族還包括LFA-1(又稱CD11a/CD18)。
EP0205405公開了IgE(FCεR)淋巴細(xì)胞受體的Mab與人類E免疫球蛋白結(jié)合因子(IgE-BF)及其衍生物的交叉反應(yīng)。
WO93/04173公開了一種多肽，它能結(jié)合FCEL(低親和性IgE受體FCεRII)或FCEH(高親和性受體FCεRI)中的一種，但基本不結(jié)合其他的FCEL或FCEH。據(jù)稱用FCEL或FCEH特異性多肽可以治療一種過敏性疾病(條件是FCEH特異性多肽不能與FCEH進(jìn)行交叉反應(yīng)，也不能誘導(dǎo)組胺釋放)。
EP0269728公開了人類淋巴細(xì)胞IgE受體的Mab。
EP0259585公開了識別人類B淋巴細(xì)胞上IgE的表面受體(FCεR)的Mab。
WO93/02108公開了用于治療的靈長化(primatised)抗體。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)CD21、CD11b、CD11c、一種內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70-85KDa的蛋白或一種內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa的蛋白的結(jié)合劑可用于治療或預(yù)防多種疾病，特別是治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎。在本發(fā)明之前盡管出版了大量的論文討論了CD21、CD11b或CD11c，但沒有提供資料來支持這一用途。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種CD21、CD11b、CD11c、內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70-85KDa的蛋白或內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa的蛋白的結(jié)合劑，它被用于炎癥、自體免疫或過敏性疾病的治療或預(yù)防。
結(jié)合劑可通過阻遏蛋白和與之結(jié)合的受體之間的相互作用而起作用。體外檢測例如放射性免疫檢測可用于研究這種阻遏作用。
結(jié)合劑可以是分離形式或作為藥物組合物的一部分。合乎需要的是無菌形式。一般來說，CD21、CD11b、CD11c、一種內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70-85KDa的蛋白(例如內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的76KDa、80KDa或85KDa蛋白)或內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa的蛋白的特異性結(jié)合劑可用于治療或預(yù)防。
優(yōu)選的結(jié)合劑包括抗體、其片段或含有抗體或其片段的人工構(gòu)建體或被設(shè)計成模擬抗體或其片段結(jié)合的人工構(gòu)建體。該結(jié)合劑的討論見Dougall等，Tibtech12，372-379(1994)。
它們包括完整的抗體、F(ab′)2片段、Fab片段、Fv片段、ScFv片段、其他片段、CDR肽及模擬物。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可獲得或制備它們。例如，可利用酶消化得到F(ab′)2片段和Fab片段(將IgG分別用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶切割)。下列描述中提到的“抗體”應(yīng)包括所有上述可能。
可用重組抗體?？贵w可被人化(humanized)或被嵌合化。
EP-A-0239400公開了一種典型的人化抗體制備物，其中CDR來源于與抗體可變區(qū)骨架不同的物質(zhì)。CDR可來自大鼠或小鼠單克隆抗體。被改變的抗體的可變區(qū)及恒定區(qū)骨架來源于人的抗體。將這種人化抗體施用給人體后，與人抗大鼠或小鼠抗體的免疫應(yīng)答相比，其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以忽略。
可選地，該抗體可以是嵌合抗體，例如WO86/01533中描述的那種類型。
WO86/01533的嵌合抗體含有一個抗原結(jié)合區(qū)和一個非免疫球蛋白區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)是抗體輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)。典型地，嵌合抗體同時含有輕鏈和重鏈的可變區(qū)。非免疫球蛋白區(qū)在其C末端與抗原結(jié)合區(qū)相融合。非免疫球蛋白區(qū)典型地是非免疫球蛋白，也可能是一酶區(qū)域，該區(qū)域來自具有已知結(jié)合特性的蛋白，來自一種蛋白毒素或就是來自基因表達(dá)的任何蛋白。嵌合抗體的兩個區(qū)域可通過一段可切割連接物序列連接起來。
抗體可以是人類IgG，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4；IgM；IgA；IgE或IgD，并攜帶大鼠或小鼠的可變區(qū)(嵌合的)或CDR(人化的)?？捎萌鏦O93/02108公開的靈長化技術(shù)。
其他優(yōu)選結(jié)合劑(除去抗體或其衍生物)有X因子(即因子10)、Epstein Barr病毒或其部分。
若將完整的病毒用于治療，其通常是無致病性的形式。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員用已知技術(shù)，如減毒或誘變可達(dá)到此目的。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)理解，凡是本文描述的特異性結(jié)合劑，均可以用其衍生物。術(shù)語“衍生物”包括所描述試劑的變異體，其與所述試劑相比，具有一個或多個氨基酸替換、缺失或插入，但仍具有所述的結(jié)合活性。優(yōu)選地，這些衍生物與指定的結(jié)合劑具有足夠的氨基酸序列一致性。
可用如“bestfit”(Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances inApplied Mathematics)，482-489(1981))的程序計算氨基酸序列一致程度，來找到任意兩段序列中最相似的片段。這種調(diào)正基于用氨基酸相似性矩陣將所得分值最大化，描述見Schwarz和Dayhohof(1979)，蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖譜，Dayhof，M.O.編，353-358頁。
優(yōu)選的序列一致程度為至少50％，更優(yōu)選的為至少75％。最優(yōu)選的是序列一致程度為至少90％或至少95％。
但專業(yè)人員應(yīng)理解，高的序列一致程度并非必需，因為經(jīng)?？梢詫⒉煌被崽鎿Q成其他性質(zhì)相似的氨基酸，而基本不改變或不會對蛋白的某些性質(zhì)帶來負(fù)面影響。這有時被稱為“保守”氨基酸變化。因此，甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸通?？上嗷ヌ鎿Q(具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸)。其他通?？上嗷ヌ鎿Q的氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族側(cè)鏈氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。因此術(shù)語“衍生物”還包括這樣一段氨基酸序列的變異體，它含有一個或多個這樣與所說序列相關(guān)的“保守”變化。
本發(fā)明還包括仍具有所述結(jié)合活性的本發(fā)明結(jié)合劑或其衍生物的片段。優(yōu)選的片段至少有十個氨基酸長，也可更長(例如長到50或100個氨基酸)。
據(jù)信，本發(fā)明的結(jié)合劑可用于治療或預(yù)防多種人類疾病，包括關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、Mashimotos甲狀腺炎、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、糖尿病、眼色素層炎、皮炎、牛皮癬、蕁麻疹、腎病綜合癥、腎小球腎炎、發(fā)炎性腸道疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏癥、Sjogren氏綜合癥、過敏、哮喘、鼻炎、濕疹、GVH、COPD、胰島炎、支氣管炎(尤其是慢性支氣管炎)或糖尿病(主要是I型糖尿病)。這些結(jié)合劑也可用于研究CD23與不同配體間的相互作用，例如CD23與CD21，CD23與CD116，CD23與CD11c，CD23與前述的70-85KDa的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白(也可以是80或85KDa內(nèi)皮細(xì)胞蛋白)或CD23與115KDa的內(nèi)皮蛋白(該蛋白據(jù)信與70-85KDa內(nèi)皮蛋白相關(guān))。據(jù)信上述相互作用的一種或多種在體內(nèi)存在。特別優(yōu)選能阻遏這些相互作用的抗體或其他結(jié)合劑，因為據(jù)信它們特別適于減少或緩解細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥效應(yīng)。它們也被用于治療B細(xì)胞惡性病，例如慢性淋巴細(xì)胞白血病以及毛細(xì)胞白血病。
本發(fā)明的結(jié)合劑特別適用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。不受理論束縛，我們提出下列可能的解釋在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)炎的滑膜里，巨噬細(xì)胞表達(dá)CD23和β2整合素CD11b和CD11c，使得該組織中可能發(fā)生同型相互作用(homotypicinteraction)。另外，可溶性CD23分子可能在滑膜中擴(kuò)散并結(jié)合整合素配體。因此體內(nèi)可能存在涉及正激活環(huán)路的CD23-CD11c/CD11c相互作用。若類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中有該作用，則可解釋某些疾病惡化與變成慢性的成病機(jī)制，并支持下面的假設(shè)，即巨噬細(xì)胞一旦在關(guān)節(jié)處定位，其自身便可通過一種涉及CD23分子、β2整合素CD11b和CD11c以及前炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的途徑維持炎癥并使炎癥惡化。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CD23與CD11b和CD11c的結(jié)合被X因子阻遏，因為X因子結(jié)合CD11b和CD11c。因此本發(fā)明包括X因子或其片段在阻遏CD23與CD11b和/或CD11c結(jié)合方面的應(yīng)用。
抗CD23療法的可選作用機(jī)制可能涉及對IgE免疫應(yīng)答的阻遏。
在以前出版的著作中已表明用抗CD23抗體體內(nèi)處理大鼠，會抗原特異性地抑制IgE生成，這可能是通過阻遏IgE定型B細(xì)胞完全分化所必需的CD23-CD21相互作用實現(xiàn)的(Flores-Romo等，科學(xué)261，1038-1041(1993))。
本發(fā)明還包括阻遏此種應(yīng)答的CD21的結(jié)合劑(例如Epstein Barr病毒或其部分)。
CD21蛋白在結(jié)構(gòu)上由下述結(jié)構(gòu)組成含有15個(Moore等，編碼人類B淋巴細(xì)胞Epstein Barr病毒C3d受體(補(bǔ)體受體2型)的cDNA的分子克隆，美國國家科學(xué)院院刊849194(1987))或16個(Weis等，人類B淋巴細(xì)胞C3d和Epstein Barr病毒受體的結(jié)構(gòu)及其與C3/C4結(jié)合蛋白家族其他成員的關(guān)系，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1671047(1988))60到75個氨基酸的稱為短一致重復(fù)(SCR)的重復(fù)單位的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，后面跟著跨膜結(jié)構(gòu)域(24個氨基酸)和34個氨基酸的胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域。用帶有胞漿外SCR缺失的CD21突變體(Carel等，C3d，g/Epstein Barr病毒受體(CR2/CD21)配體結(jié)合、內(nèi)在化和病毒感染的結(jié)構(gòu)要求，生物化學(xué)雜志26512293(1990))，本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)CD23結(jié)合CD21上的SCR5-8和SCR1-2。CD23與SCR5-8結(jié)合是一種類似外源凝集素的作用，涉及Asn295和370上的碳水化合物。與之對照，CD23結(jié)合SCR1-2是蛋白-蛋白作用(Aubry等，CD23與新的有功能的胞漿外結(jié)構(gòu)域作用，該作用涉及CD21上N連接的寡糖，免疫學(xué)雜志1525806(1994))。本發(fā)明人已經(jīng)檢測了CD21其他配體(EBV，C3d，g和IFN-α)對CD23結(jié)合CD21和IL-4存在時Ig的生成的調(diào)節(jié)的影響。只有EBV顆粒和來自EBV的肽能抑制CD23與CD21的結(jié)合。另外，EBV-肽選擇性地降低IgE和IgG4的產(chǎn)生而增加IgM的產(chǎn)生。這些資料顯示結(jié)合到CD21上的EBV結(jié)合位點(diǎn)上的CD23，選擇性地調(diào)節(jié)IL-4存在時的人類Ig的產(chǎn)生。
因而本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括用Epstein Barr病毒或其一部分阻遏CD23對CD21的結(jié)合。Epstein Barr病毒的優(yōu)選部分是gp350/gp220糖蛋白或其片段?？蛇x地可用該糖蛋白或其片段的非糖基化形式。
不受理論束縛，據(jù)信本發(fā)明通過抑制前炎性細(xì)胞因子的重新合成而能有效地進(jìn)行治療。
這與以前簡單地用抗體來直接中和發(fā)炎組織中已經(jīng)存在的細(xì)胞因子形成對照。
還應(yīng)注意本領(lǐng)域中有許多推測性的出版物，它們列出許多抗體以及大量據(jù)說可以用這些抗體治療的疾病，但沒有提供大多數(shù)這樣的可能組合的任何可信的證據(jù)或資料。這樣的出版物之一是WO93/02108，它主要是關(guān)于生成特定的嵌合抗體的。
通過提供特定分子的結(jié)合劑，本發(fā)明與這類出版物明顯不同，基于本文提供的資料與解釋，已清楚地表明它可特別用于治療或預(yù)防某些疾病。
本發(fā)明的結(jié)合劑也可用于治療或預(yù)防過敏性疾病，包括非IgE介導(dǎo)的疾病。它們可用于治療和預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎，也可用于治療和預(yù)防Crohn氏癥。
本發(fā)明的結(jié)合劑可單獨(dú)使用或與免疫抑制劑如固醇、環(huán)孢素(cyclosporin)或如抗白細(xì)胞抗體，或優(yōu)選地與耐受誘導(dǎo)劑、抗自體免疫劑或抗炎癥劑如CD4+T細(xì)胞抑制劑，例如抗CD4抗體(優(yōu)選的是阻遏性或非耗盡性抗體)、抗CD8抗體，TNF拮抗劑例如抗TNF抗體或TNF抑制劑例如可溶性TNF受體或藥劑如NSAIDS組合使用。
結(jié)合劑通常作為無菌的藥用組合物的一部分提供。該藥用組合物可以是任何合適的形式，這依賴于對患者施用所需的方法。它可以以單位劑量形式或作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒通常(但不是必需)包括使用說明。
結(jié)合劑通常通過胃腸外給藥，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥。結(jié)合劑通常通過注射或輸注給藥。為此，結(jié)合劑被配制成含有藥用載體與稀釋劑的藥物組合物?？捎萌魏芜m當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑，例如等滲溶液?？杉臃€(wěn)定劑如金屬螯合劑來避免銅誘導(dǎo)的切割。合適的螯合劑可以是EDTA、DTPA或檸檬酸鈉。
它們可口服或通過噴劑鼻腔給藥，特別是用于呼吸系統(tǒng)疾病時。
它們可以配制成乳油或軟膏，特別是用于治療皮膚病時。
它們可以配制成滴劑等，用于對眼給藥或用于治療如春季結(jié)膜炎的疾病。
對于注射液，可用的賦形劑包括例如水、酒精、多醇、甘油和植物油。
藥物組合物可包含保鮮劑、助溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香味劑、鹽(本發(fā)明的物質(zhì)本身即可以藥用鹽形式提供)、緩沖液、包囊劑或抗氧化劑。還可以包含其他治療活性物質(zhì)。
本發(fā)明物質(zhì)的適當(dāng)劑量要根據(jù)待治療疾病或失調(diào)、給藥途徑及受治療者的年齡和體重等因素而變化。不受任何具體劑量限制，據(jù)信，例如胃腸外給藥，本發(fā)明結(jié)合劑的0.01-50mg/kg每日劑量(通常作為上述藥物組合物的一部分)可能適于治療一位普通成年人。更合適的劑量可能是0.05-10mg/kg，如O.1-2mg/kg。
該劑量可適時重復(fù)。典型的給藥次數(shù)為每周1到7次。若發(fā)現(xiàn)有副作用，每劑的量或給藥頻率可以酌減。
因此，摻入藥物組合物的典型單位劑量至少為1mg結(jié)合劑，適當(dāng)?shù)氖?-1000mg。
本發(fā)明范圍包括一種確定結(jié)合CD21、CD11b、CD11c或內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70-85KDa或115KDa蛋白的某種特定藥劑是否可用于治療炎癥、自體免疫或過敏性疾病的試驗，它包括確定該藥劑是否阻遏CD23與CD11b，或CD23與CD11c，或CD23與CD21，或CD23與內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70-85KDa或115KDa蛋白的相互作用。
該試驗可用于利用表達(dá)適當(dāng)分子的細(xì)胞系篩選化合物或分子。優(yōu)選地在此試驗中，CD11b以CD11b/CD18形式，CD11c以CD11c/CD18形式使用。CD11b/CD18和CD11c/CD18可以在細(xì)胞表面共表達(dá)。
可用任何合適的試驗技術(shù)，例如蛋白-非蛋白試驗(例如試驗蛋白與化學(xué)品或糖類的相互作用)，蛋白-蛋白試驗或蛋白-細(xì)胞試驗。
本發(fā)明現(xiàn)在將用實施例方式來描述，僅參考下列附圖，其中

圖1給出CD23-脂質(zhì)體結(jié)合CD14陽性血液單核細(xì)胞；圖2給出SDS-PAGE凝膠中不同CD23親和性純化的蛋白；圖3給出CD23-脂質(zhì)體結(jié)合各種轉(zhuǎn)染細(xì)胞；圖4給出各種物質(zhì)對CD23-CD11b和CD23-CD11b相互作用的影響；圖5給出CD23結(jié)合CD11b和CD11c造成的對單核細(xì)胞中亞硝酸鹽生成和氧化突升(burst)的影響；圖6給出重組CD23結(jié)合CD11b和CD11c特異性地增加單核細(xì)胞的細(xì)胞因子生成；圖7a給出各種CD21配體對CD23-脂質(zhì)體結(jié)合RPM18226細(xì)胞的抑制；圖7b給出EBV肽結(jié)合CD21對IL-4誘導(dǎo)的IgE和IgG4生成的抑制；圖7c給出EBV肽結(jié)合CD21對免疫球蛋白生成的調(diào)節(jié)；圖7d給出C3肽結(jié)合CD21不抑制IgE生成；圖8給出抗CD23 Mab存在對CD23-脂質(zhì)體結(jié)合某種內(nèi)皮細(xì)胞的抑制。
實施例(下面某些實施例中用到術(shù)語“ip”，“id”和“n”，分別是指“腹膜內(nèi)”，“皮內(nèi)”和“動物數(shù)”)實施例1-6CD23和CD11b之間以及CD23和CD11c之間的相互作用實施例1至6及附圖(見后)描繪了CD23與CD11b和/或CD11c的相互作用。
在這些實施例中顯示加入熒光脂質(zhì)體的全長重組CD23結(jié)合用編碼CD11b/CD18或CD11c/CD18的cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞但不結(jié)合表達(dá)CD11a/CD18的轉(zhuǎn)染體。CD23-脂質(zhì)體和CD11b/CD18或CD11c/CD18轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的相互作用分別被抗CD11b或抗CD11c，也被抗CD23單克隆抗體特異性抑制。用重組CD23或抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體激發(fā)單核細(xì)胞上的CD11b和CD11c使亞硝酸根(NO2-)、氧化產(chǎn)物(H2O2)和前炎性細(xì)胞因子(IL-1β，IL-6和TNFα)顯著增長，這顯示了這種配體配對在功能上的重要性。CD11b、CD11c和CD23的單克隆抗體Fab片段減少這些CD23介導(dǎo)的活性。這些結(jié)果顯示表面粘附分子CD11b和CD11c是CD23的受體，并且這種新的配體配對調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的重要活動。
下述討論簡要解釋了實驗設(shè)計和實施例1-6的理論基礎(chǔ)(如下)全血單核細(xì)胞與加入熒光脂質(zhì)體的重組全長CD23共溫育，用流式細(xì)胞計(Pochon，S.等，實驗醫(yī)學(xué)雜志176，389-398(1992)分析。結(jié)合上CD23-脂質(zhì)體的部分(實施例1，圖1a)復(fù)染顯示含有CD14陽性細(xì)胞(即單核細(xì)胞)。為了驗證單核細(xì)胞能結(jié)合CD23-脂質(zhì)體，將血單核細(xì)胞FACS分選成CD14陽性和CD14陰性群體(實施例1，圖1a)。CD23-脂質(zhì)體只結(jié)合CD14陽性群體(實施例1，圖1a)。由于單核細(xì)胞不表達(dá)膜IgE和CD21(未顯示)這兩種CD23配體，研究單核細(xì)胞是否表達(dá)另一種CD23受體。裂解單核細(xì)胞，細(xì)胞提取物用重組可溶CD23偶聯(lián)的親和柱純化。洗脫物的SDS-PAGE和銀染分析顯示約80和160Kda分子量的帶(實施例1，圖1b)。對于識別這個分子量范圍的抗原并有報道在單核細(xì)胞上表達(dá)的抗體，用PACS檢查其抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合單核細(xì)胞的能力(實施例2，圖2)?？笴D11b和抗CD11c單克隆抗體均抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合單核細(xì)胞，能力大小有所不同(實施例2，圖2)?？笴D13、抗CD49d、抗CD21(不在單核細(xì)胞上表達(dá))和抗CD11a(粘附分子β2整合素家族的第3個成員)沒有明顯效果(實施例2，圖2)?？箚魏思?xì)胞上高度表達(dá)的MHCI類，II類，CD14和CD45的抗體，也檢查其對CD23-脂質(zhì)體結(jié)合的影響。但均無任何效果(未給出)?？笴D18單克隆抗體部分地抑制CD23結(jié)合。這可能由于空間位阻或CD11b和CD11c分子結(jié)合抗CD18Mab誘導(dǎo)的構(gòu)型變化。CD23親和柱洗脫下來的單核細(xì)胞來源蛋白與抗CD11c(實施例1，圖1B)和抗CD11c/CD18抗體(未給出)免疫反應(yīng)。
為了驗證CD11b/CD18和CD11c/CD11b的α鏈?zhǔn)荂D23的受體，編碼CD11b和CD11c的全長cDNA與CD18cDNA暫時性共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。表達(dá)CD11b/CD18和CD11c/CD18的轉(zhuǎn)染體均結(jié)合CD23-脂質(zhì)體，與表達(dá)CD11A/CD18的轉(zhuǎn)染體形成對照(實施例3，圖3)。這可以由CD11b和CD11c同源性比它們與CD11A的同源性高來解釋。用抑制抗CD11b，抗CD11c和抗CD23單克隆抗體結(jié)合CD23-脂質(zhì)體來顯示作用特異性。用表達(dá)CD11b/CD18和CD11c/CD18(未給出)的BHK細(xì)胞得到相同的結(jié)果。CD23相互作用特異性的進(jìn)一步證據(jù)是，白細(xì)胞粘附缺陷癥患者的激活血單核細(xì)胞，由于編碼β亞基的基因中有一突變而缺少β2整合素，不能結(jié)合CD23-脂質(zhì)體(未給出)。這些數(shù)據(jù)一起顯示CD23與正常人類白細(xì)胞和轉(zhuǎn)染體上CD11b和CD11c相互作用。CD11b和CD11c是參與許多細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的粘附分子。實施例顯示CD11b/CD18和CD11c/CD18由于能結(jié)合CD23，還表現(xiàn)出粘附功能。觀察到X因子能以劑量依賴形式抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合(實施例4，圖4)，而不影響單核細(xì)胞表面CD11b或CD11c的表達(dá)(未給出)，有可能CD23能識別與C因子相近或相同的表位。其他受檢查的配體均無效果。CD23與CD11b和CD11c相互作用時可能作為C型外源凝集素。EDTA螯合CD23結(jié)合必需的Ca2+和/或螯合配體結(jié)合CD11b和CD11c必需的二價陽離子(Altieri，D.C.，免疫學(xué)雜志147，1891-1898(1991))而減少CD23與單核細(xì)胞的結(jié)合(實施例4，圖4)。觀察到衣霉素(tunicamycin)能減少CD23與單核細(xì)胞的結(jié)合，而神經(jīng)氨酸苷酶不能，可能CD23-CD11b/CD11c相互作用涉及糖，而非水楊酸。CD23在細(xì)胞外有一氨基酸三聯(lián)體(Asp.Gly.Arg)(Kitutani，H.等，細(xì)胞47，867-885(1986))，其反向即整合素受體的普遍識別位點(diǎn)。因此檢驗多克隆抗體對該三肽的效果，得到其抑制CD23結(jié)合單核細(xì)胞的能力。未觀察到任何抑制，這驗證了血纖維蛋白原無抑制(實施例4，圖4)。IgE結(jié)合CD23的外源凝集素結(jié)構(gòu)域，部分地抑制CD23結(jié)合單核細(xì)胞(實施例4，圖4)。這些結(jié)果顯示CD23可能作為C型外源凝集素，識別部分的糖和蛋白結(jié)構(gòu)，這使人想起CD23與CD21相互作用的觀察結(jié)果(Aubry，J-P等，免疫學(xué)雜志152，5806-5813(1994))。
為了評價CD23與CD11b或CD11相互作用的功能重要性，我們研究CD23-CD11b/CD11c相互作用是否引發(fā)單核細(xì)胞釋放前炎性介體如氧化氮，H2O2和細(xì)胞因子。用重組可溶CD23，抗CD11b或抗CD11c抗體激發(fā)粘附激活的正常單核細(xì)胞增加NO2的生成，顯示激活了NO途徑(Moncada，S.，Palmer，R.M.J.和Higgs，E.A.，Phamacol.Rev.43，109-144(1991))。用抗CD23單克隆抗體和硝基精氨酸，一種NO合成酶途徑的特異性抑制物可以抑制CD23對硝酸根生成的效果(實施例5，圖5a)。CD11b和CD11c均調(diào)節(jié)氧化突升，因為重組可溶CD23，抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體均使單核細(xì)胞中氫化乙錠(hydroethidine)氧化成溴乙錠(實施例5，圖5)。這驗證并擴(kuò)展了抗CD11b單克隆抗體誘導(dǎo)單核細(xì)胞中氧化突升這一發(fā)現(xiàn)(Trezzini，C.Schuepp，B.Maly，F(xiàn).E.和Jungi，T.W.，英國血液學(xué)雜志(Brit.J.Haematol.)77，16-24(1991))。CD23結(jié)合CD11b和CD11c與血單核細(xì)胞中早期特異性Ca2+流有關(guān)聯(lián)(未給出)。
由于激活的巨噬細(xì)胞是前炎性細(xì)胞因子的重要來源，我們評價重組可溶CD23和抗CD11b及抗CD11c單克隆抗體對于單核細(xì)胞生成這些細(xì)胞因子的影響。重組可溶CD23，抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體是IL-1β，IL-6和TNFα的強(qiáng)力激活物。用抗CD11b，抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體可顯示這種誘導(dǎo)的特異性(實施例6，圖6)。有趣的是，IL-1和TNFα是CD23-脂質(zhì)體結(jié)合單核細(xì)胞的強(qiáng)力誘導(dǎo)物(未給出)，表明有潛在的通過CD11b和CD11c激發(fā)和調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的自分泌環(huán)路。
實施例1a)CD23-脂質(zhì)體結(jié)合CD14陽性血單核細(xì)胞(見圖1a)血單核細(xì)胞先用CD21單克隆抗體(Becton Dickinson，Erembodegem，比利時)染色，再用抗小鼠IgG和IgM(Bioart，Meudon，法國)的綿羊FITC偶聯(lián)F(ab′)2抗體染色，二者在FACS分選(FACStan Plus.Becton Dickinson)成CD14陽性和CD14陰性細(xì)胞群體之前均溶于PBS，0.5％BSA和0.05％迭氮化鈉。分離的細(xì)胞再用CD23-脂質(zhì)體或?qū)φ?血型糖蛋白A)脂質(zhì)體染色，脂質(zhì)體溶于0.5％BSA，0.1％迭氮化鈉，2mM CaCl2，140mM NaCl，20mM Hepes，pH7，4℃溫育2小時(Pochon，S.等，實驗醫(yī)學(xué)雜志176，389-398(1992))。洗滌后，用FACS分析細(xì)胞(每種條件5,000個事件)。
b)CD23親和純化血單核細(xì)胞蛋白質(zhì)表觀分子量和與抗CD11c單克隆抗體的免疫反應(yīng)性(見圖1B)血單核細(xì)胞裂解物在CD23柱上親和純化，洗脫的蛋白用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。左邊是分子量標(biāo)記。凝膠銀染(左泳道)。濾膜用同型匹配抗體(中泳道)或抗CD11c單克隆抗體(BU-15，右泳道)溫育，然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗小鼠抗體(Kpl；Gaithersberg，麻省)溫育。
實施例2抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體減少CD23-脂質(zhì)體結(jié)合激活的血單核細(xì)胞(見圖2)用Ficoll和過夜在補(bǔ)充了2mM谷酰胺和10％熱失活FCS(FlowLaboratories，Irvine，蘇格蘭)的RPM11640(Seromed，Berlin，德國)吸附塑料對單核的細(xì)胞(mononuclear cell)富集單核細(xì)胞(monocyte)。激活的單核細(xì)胞然后在不同單克隆抗體(αCD)或同型匹配對照(CTRL)(BectonDickinson)，檢測濃度均為10μg/ml存在下與CD23-脂質(zhì)體溫育?？笴D11a單克隆抗體25.3和B-B15分別得自Immunotech(Luminy，法國)和Serotec(牛津，英國)?？笴D11b單克隆抗體44得自Serotec，mongranl得自Janssen(Beerse，比利時)，Leu-15得自Becton Dickinson(Eremodegem，比利時)，(Bear-1)得自Sera-Lab Ltd(Sussex，GB)。抗CD11c單克隆抗體3.9得自Serotec，SL9得自Sera-Lab，Bu-15得自The Binging Site(伯明翰，英國)?？笴D13(SJ1D1)，抗CD18(BL5)，抗(mAB25)和抗CD49d(HP2.1)單克隆抗體得自Immunotech?？笴D21單克隆抗體BL13得自Immunotech，OKB7得自O(shè)rtho，Bu-33得自MacLennan博士(伯明翰大學(xué)，英國)，HB-5得自ATCC，OKB7得自O(shè)rtho Diagnostics SystemInc.(Raritan，新澤西州)?？笴D14、抗CD3、抗CD16和抗CD20單克隆抗體得自Becton Dickinson。細(xì)胞用FACS分析，測量平均熒光強(qiáng)度(MFI)。給出了代表性實驗的數(shù)據(jù)。對照脂質(zhì)體染色的細(xì)胞MFI是6.5而CD23-脂質(zhì)體染色的細(xì)胞MFI是84.5。根據(jù)下列公式
用算術(shù)線性MFI值計算抑制百分比。實施例3CD23-脂質(zhì)體結(jié)合重組轉(zhuǎn)染體上CD11b/CD18和CD11c/CD18的α鏈(見圖3)編碼CD11a的cDNA(Corbi，A.L.，Miller，L.J.，O’Connor，K.，Larson，R.S.和Springer，T.A.，EMBO雜志6，4023-4028(1987))再克隆至pcDNA1(Invitrogen，圣迭戈，加州)。CD11b的cDNA(Corbi，A.L.，Kishimoto，T.K.，Miller，L.J.和Springer，T.A.，生物化學(xué)雜志263，12403-12411(1988))和CD18的cDNA(Kishimoto，T.K.，O’Conner，K.，Lee，A.，Roberts，T.M.和Springer，T.A.，細(xì)胞48，681-690(1987))再克隆至PCDM8(Seed，B.，自然329，840-842(1987))。用Gene Pulser器件(Bio-Rad，Richmond，加州)和0.4cm小池，在20mM Hepes pH7.4，150mM NaCl中用電穿孔法將20μg等分試樣的DNA轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞(ATCC)中。用CD11a，b或c與CD18共轉(zhuǎn)染得到細(xì)胞表面β2整合素的表達(dá)。以單鏈轉(zhuǎn)染作對照。轉(zhuǎn)染48小時后，COS細(xì)胞用抗CD11a，抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體或同型匹配單克隆抗體(對照)染色，然后用FITC標(biāo)記的羊抗小鼠染色。10-15％的細(xì)胞用相應(yīng)單克隆抗體染色顯示表達(dá)CD11a，b，c或CD18。用CD23-脂質(zhì)體染色之前，CD18陽性轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞作FACS分選以增大表達(dá)β2整合素的細(xì)胞的百分比。CD11a/CD18，CD11b/CD18和CD11c/CD18轉(zhuǎn)染體然后與CD23-脂質(zhì)體(跡2)或?qū)φ?血型糖蛋白A)脂質(zhì)體(跡1)共溫育。分別用抗CD11b(跡4)，抗CD23(跡5)和抗CD11c(跡6)單克隆抗體抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合CD11b/CD18和CD11c/CD18轉(zhuǎn)染體來顯示CD23與CD11b和CD11c相互作用的特異性。在CD11a/CD18轉(zhuǎn)染體上未觀察到CD23-脂質(zhì)體結(jié)合，未發(fā)現(xiàn)抗CD11A單克隆抗體的作用(跡3)。
實施例4CD23-CD11b，CD11c相互作用的結(jié)構(gòu)特征確定(見圖4)。
(a)糖和二價陽離子的參與用衣霉素(10μg/ml)40分鐘或神經(jīng)氨酸酶(0.1U/ml.；均得自寶靈曼，曼海姆，德國)45分鐘處理純化的激活血單核細(xì)胞或不處理。然后在EDTA(5mM，左上版)，Ca2+或Mn2+(1到10mM，右上版)不存在或存在時將細(xì)胞與CD23-脂質(zhì)體或?qū)φ罩|(zhì)體共溫育。
(b)X因子不抑制CD23結(jié)合單核細(xì)胞在X因子(0.1-10U/ml；Sigma)(左下版)，血纖維蛋白原(50μg/ml；Sigma)，純化的重組ICAM-1(本實驗室制備)，LPS(1μg/ml；Sigma)，人類血清調(diào)理的酵母聚糖(1mg/ml；Sigma)，IgE(50μg/ml；The Binding Site，伯明翰)或RGD肽的多克隆抗體(1/500，ATCC)(右下版)不存在或存在時將純化的激活血單核細(xì)胞與CD23-脂質(zhì)體溫育。FACS分析細(xì)胞，測量MFI。如實施例2計算抑制百分比。
實施例5重組CD23通過結(jié)合CD11b和CD11c特異性增加單核細(xì)胞的a.亞硝酸根產(chǎn)物和b.氧化突升在重組可溶CD23(Traber，P.等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)149，215-226(1992))150ng/ml，抗CD11a(克隆253)，抗CD11b(克隆44)，抗CD11c(克隆BU-15)單克隆抗體(均為10μg/ml)不存在或存在時溫育單核細(xì)胞a.37℃4天或b.過夜。
為了評估產(chǎn)生的NO量(由圖5a給出)，根據(jù)Green等，免疫學(xué)年度綜述2，199-218(1984)對培養(yǎng)物上清檢測穩(wěn)定終產(chǎn)物NO、NO2-和NO3-。用抗CD23單克隆抗體Fab片段(mab25)(檢測濃度10μg/ml)抑制NO2-生成以及用硝化精氨酸(N-Arg，1mM)(Sigma)抑制顯示CD23介導(dǎo)的NO2-生成增加的特異性。
激活的單核細(xì)胞與氫化乙錠(Molecular Probes，Eugene，俄勒岡州)10μg/ml溫育37℃30分鐘(Rothe，G.等，白細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Leukoc.Biol.)47，440-448(1990))并且FACS分析。與未處理的單核細(xì)胞比較顯示激活單核細(xì)胞紅色熒光的百分比增加(見圖5B)。與未處理的單核細(xì)胞相比，經(jīng)過氧化突升的單核細(xì)胞的紅色熒光信號增大，顯示氫化乙錠被氧化成溴乙錠(Lacal，P.M.等，生化雜志268，707-712(1990))。單核細(xì)胞自己的MFI值為159+/-10。給出6個實驗的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。用已知能誘導(dǎo)單核細(xì)胞氧化突升的ConA作陽性對照。用抗CD11b(克隆44)，抗CD11c(克隆BU-15)和抗CD23(mAB25)單克隆抗體(檢測濃度為10μg/ml)的Fab片段抑制CD23介導(dǎo)的H2O2生成增加來顯示CD23與CD11b和CD11c相互作用的特異性。
實施例6重組CD23結(jié)合CD11b和CD11c特異性增加單核細(xì)胞的細(xì)胞因子生成(見圖6)
在重組可溶CD23(Graber，P.等，免疫學(xué)方法雜志149，215-226(1992))(50ng/ml)，抗CD11a(克隆25.3)，抗CD11b(克隆44)，抗CD11c(克隆BU-15)，抗CD23(mAB25，該抗體可得自Immunotech，已出版的歐洲專利申請EP-A-0269728對其進(jìn)行了討論)單克隆抗體，ConA(Sigma)(均為10μg/ml)，LPS(1ng/ml)(Sigma)或PMA(5ng/ml)(Calbiochem，LaJolla，加州)不存在或存在時在37℃溫育單核細(xì)胞過夜。在培養(yǎng)物上清中用特異性ELISA測量細(xì)胞因子。ELISA靈敏度限度對IL-1β是0.05ng/ml(Ferrua等，免疫學(xué)方法雜志114，41-48(1988))，對TNF α是0.01ng/ml(Medgenix，Biotechnie，Rungis，法國)，對IL-6小于0.01ng/ml(Manie等，Eur.Cytokine Netw.4，51-56(1993))。用抗CD11b(克隆4)，抗CD11c(克隆BU-15)和抗CD23(mAB25)單克隆抗體(試驗濃度10μg/ml)的Fab片段抑制CD23介導(dǎo)的細(xì)胞因子生成增長來顯示CD23與CD11b和CD11c相互作用的特異性。給出4個實驗的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。
實施例7下列材料與方法用于本實施例細(xì)胞系用綿羊紅血細(xì)胞玫瑰環(huán)技術(shù)將扁桃體或單核細(xì)胞分成T和B細(xì)胞亞群體。
B細(xì)胞系RPMI8226得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，馬里蘭州)，培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基中。
肽和CD21配體合成兩種來自EBV的gp350和C3的肽，已知它們能結(jié)合CD21(Servis等，C3合成肽支持人類CR2陽性B淋巴母細(xì)胞的生長，免疫學(xué)雜志1422207(1989))。PepEBV(TGEDPGFFNVEIC-NH2)用FastMoc化學(xué)法在ABI431A合成儀上生成，RepC3(GKQLYNVEATSYAC-NH2)得自Neosystem(Strasboury，法國)。如以前描述的(Carel等(1990)，引文見上)制備聚集的C3d，g。蔗糖梯度純化的EBV得自AdvancedBiotechnologies(Columbia，ML)，IFN-α得自Sigma(圣路易，密蘇里州)。
脂質(zhì)體的制備如前述(Pochon等，用重新加入熒光脂質(zhì)體的重組CD23顯示IgE低親和性受體的另一種配體(CD23)，實驗醫(yī)學(xué)雜志176389(1992))用10μmol合成磷脂POPC(Avanti Polarlipids Inc.，Alabaster，AL)與50nmol熒光染料Dio18(Molecular Probes，Eugene，俄勒岡州)混合，然后對HEPES緩沖液及純化的重組CD23或稱為對照蛋白的血型糖蛋白A(各為0.2μmol)透析制備CD23-脂質(zhì)體。
流式細(xì)胞計脂質(zhì)體結(jié)合試驗將細(xì)胞(105)重懸與50μl脂質(zhì)體懸液中，10倍稀釋于0.5％BSA，0.1％NaN3，2mM CaCl2，140mM NaCl，20mM Hepes，pH7.0，4℃溫育2小時。
將細(xì)胞洗兩遍，再在FALStar plus(Becton Dickinson，Erembodeggen，比利時)上分析。
CD23-脂質(zhì)體與EBV、EBV肽、IFN-α、C3肽和C3d，g的競爭RPMI8226細(xì)胞與血型糖蛋白脂質(zhì)體或CD23-脂質(zhì)體和EBV(1×105到1×109顆粒/毫升)，EBV肽和C3肽(50nM至50μM)，聚集的C3d，g(4ng/ml至1μg/ml)和IFN-α(1000U/ml)共溫育4℃2小時。如上述分析細(xì)胞。
IL-4誘導(dǎo)的Ig生成試驗細(xì)胞以106/ml在富集轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、油酸、亞油酸、軟脂酸、BSA(均來自Sigma)和10％FCS(Flow Laboratories，Irvine，蘇格蘭)的Iscove培養(yǎng)基中溫育14天，描述見Claassen等(一種增強(qiáng)重組白介素4誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IgE合成的細(xì)胞培養(yǎng)體系，免疫學(xué)方法雜志126213(1990))。用僅含IL-4(200U/ml)或IL-4加抗CD40(1μg/ml)(SerotecLtd，牛津，英國)的完全PBMNC，或用含IL-4和抗CD40的純化扁桃體B細(xì)胞進(jìn)行試驗。如前述(Bonnefoy等，用抗CD23/FcεR11單克隆抗體亞群抑制人類白介素4誘導(dǎo)的IgE合成，歐洲免疫學(xué)雜志20139(1990))用特異性ELISA對IgE，G，A和M定量。如下用ELISA測量IgG4。小鼠抗人IgG4抗體(Southern Biotechnology，伯明翰)在碳酸氫鹽緩沖液pH9.6中稀釋至10μg/ml，在96孔板中包被過夜(100μl/孔)。然后在室溫下用PBS加1％BSA(200μl/孔)飽和2小時。待測樣品用PBS加0.5％BSA和0.1％吐溫(100μl/孔)稀釋，4℃溫育過夜。用PBS加吐溫洗過后，加入用PBS/BSA加吐溫稀釋5000倍的過氧化物標(biāo)記的羊抗人IgG4抗體(VitalProducts，圣路易，密蘇里州)，室溫1小時。用PBS加吐溫洗過后，加入鄰苯二胺(Sigma)并用2M H2SO4終止顯色反應(yīng)。最后在492nm讀板。
得到的結(jié)果討論如下人類CD21以前被描述成補(bǔ)體系統(tǒng)的C3d，g和iC3b蛋白(Weis等，一種145,000Mr的膜蛋白被鑒定為人類B淋巴細(xì)胞的C3d受體(CR2)，美國國家科學(xué)院院刊81881(1984))，EBV的gp350/220包被糖蛋白(Nemerow等，gp350被鑒定為介導(dǎo)Epstein Barr病毒(EBV)附著B細(xì)胞EBV/C3d受體的病毒糖蛋白gp350與C3補(bǔ)體片段C3d的序列同源性，病毒學(xué)雜志611416(1987)；Janner等，Epstein Barr病毒gp350/220結(jié)合B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)吸附、成帽與內(nèi)吞作用，細(xì)胞50203(1987))，和IFN-α(Delcayre等，Epstein Barr病毒/補(bǔ)體C3d受體是干擾素α受體，EMBO雜志，10919(1991))的受體。因此我們對所有這些CD21配體檢查其抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合CD21表達(dá)細(xì)胞，RPMI8226細(xì)胞，的能力(Pochon等(1992)引文見上)。EBV未受處理的顆粒能以劑量依賴形式抑制CD23結(jié)合CD21。這由圖7a給出，該圖描繪了某些CD21配體抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合RPMI8226細(xì)胞。[RPMI8226細(xì)胞與CD23-脂質(zhì)體或血型糖蛋白脂質(zhì)體和各種濃度的EBV(顆粒數(shù)/毫升)PepEBV和PepC3(μM)共溫育2小時。抑制百分比如下計算
從CD23-脂質(zhì)體的MFI中減去血型糖蛋白脂質(zhì)體的MFI。插圖＝用血型糖蛋白脂質(zhì)體(跡1)單用CD23-脂質(zhì)體(跡3)或在EBV顆粒(上)、PepEBV(中)和PepC3(下)(跡2)存在下染色的RPMI8226細(xì)胞的FACS圖。結(jié)果選自一個有代表性的實驗。]在其他檢查對CD23-脂質(zhì)體結(jié)合的抑制的CD21配體中，僅有EBV減少CD23的結(jié)合。用未受處理的EBV顆粒觀察到完全的對CD23結(jié)合的抑制，盡管據(jù)報道EBV結(jié)合CD21的SCR2而非SCR5-8，而CD23結(jié)合后一區(qū)域的糖(Aubry等(1994)引文見上)。這種對CD23結(jié)合完全抑制可能由于病毒顆粒的大小或EBV可能修飾CD21分子構(gòu)型這一事實。為了排除抑制是由于病毒顆粒的空間位阻，我們檢查了一種已知結(jié)合CD21的gp350/220肽(Servis等(1989)引文見上)。該EBV肽能夠以劑量依賴方式抑制CD23結(jié)合CD21，最大抑制為55％(圖7a)。這些實驗表明EBV肽結(jié)合接近CD23結(jié)合位點(diǎn)并部分阻遏CD23結(jié)合。這些數(shù)據(jù)證實了我們以前的發(fā)現(xiàn)，即CD23的確結(jié)合CD21(Aubry等，CD21是CD23的配體并調(diào)節(jié)IgE生成，自然358505(1992))并擴(kuò)展了該發(fā)現(xiàn)，即顯示SCR2可能是與CD23相互作用的區(qū)域。與之對照，對應(yīng)于C3d(Servis等(1989)引文見上)(圖7a)，聚集的C3d，g和IFN-α(數(shù)據(jù)未給出)的CD21結(jié)合位點(diǎn)的C3肽不能抑制CD23結(jié)合RPMI8226細(xì)胞。這表明C3和IFN-α分別結(jié)合的SCR1和3-4可能不參與CD23結(jié)合。
EBV結(jié)合CD21并不需要CD21的SCR2糖苷化(Moore等，用含有兩個短一致重復(fù)序列的可溶性SCR2體外和體內(nèi)抑制Epstein Barr病毒轉(zhuǎn)染，病毒學(xué)雜志673559(1991))。同樣，CD23結(jié)合SCR2區(qū)域不依賴糖(Aubry等(1994)引文見上)。這與我們的觀察，即非糖苷化的合成肽能減少CD23結(jié)合CD21，相一致。因此CD23結(jié)合CD21上SCR2的一個結(jié)合位點(diǎn)，它接近或等于EBV結(jié)合位點(diǎn)，而后者不同于對C3d，g和IFN-α描述的結(jié)合位點(diǎn)。
以前表明CD23通過結(jié)合B細(xì)胞上的CD21正調(diào)節(jié)IgE生成(Aubry等(1992)引文見上)。基于EBV肽阻遏CD23結(jié)合CD21這一事實，我們研究該EBV肽對IgE生成的影響。該EBV肽能夠以劑量依賴形式抑制IL-4誘導(dǎo)的IgE生成。這由圖7b給出，該圖描繪通過EBV肽結(jié)合CD21抑制IL-4誘導(dǎo)的IgE和IgG4生成。[PBL或純化的扁桃體B細(xì)胞(106/ml)僅用200U/ml的IL-4或當(dāng)抗CD40抗體(1μg/ml)存在且EBV肽遞增的濃度下溫育14天。用特異性ELISA測量IgE和IgG4，給出一個代表性實驗的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4)。]在T細(xì)胞依賴的和非T細(xì)胞依賴的IgE生成體系中均觀察到該效果(圖7b)，其中后面的T細(xì)胞幫助由抗CD40抗體取代。這證實了我們以前的觀察結(jié)果(Henchoz等，抗CD21單克隆抗體的一個亞群激活人類IgE生成需要一個協(xié)同信號來調(diào)控ε轉(zhuǎn)錄物，81285(1994))，即即使T細(xì)胞不存在，CD23-CD21也能通過同型B-B細(xì)胞相互作用調(diào)節(jié)IgE生成，因為B細(xì)胞CD23和CD21分子都表達(dá)。據(jù)報道，未受處理的EBV提供IgE轉(zhuǎn)換的容許信號(Thyphrontis等，Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染的純化人類B淋巴細(xì)胞分泌IgE受白介素4激活被干擾素γ阻遏，美國國家科學(xué)院院刊865580(1989))，就象T細(xì)胞或CD40L一樣。與EBV顆粒相對照，EBV肽可能不能將膜CD21交聯(lián)，因而不能增加IgE生成。EBV肽甚至有阻遏性，通過阻止CD23-CD21相互作用而減少IgE生成。
由于已知IL-4誘導(dǎo)IgG4和IgE(Lundgren等，白介素4誘導(dǎo)人類B細(xì)胞合成IgE和IgG4，歐洲免疫學(xué)雜志191311(1989))，我們研究EBV肽對IL-4誘導(dǎo)的IgG4生成的作用。如圖7b所示，EBV肽也能以劑量依賴形式抑制IgG4。該觀察結(jié)果表明CD23-CD21相互作用也控制IgG4生成。
然后研究EBV肽對其他類型Ig生成的作用。未發(fā)現(xiàn)對多克隆IgG和IgA生成有明顯影響。這由圖7c給出，該圖描繪通過EBV肽激活CD21調(diào)控免疫球蛋白的生成[PBL或純化的扁桃體B細(xì)胞(106/ml)僅用200U/ml的IL-4或當(dāng)抗CD40抗體(1μg/ml)存在且EBV肽遞增的濃度下溫育14天。用特異性ELISA測量Ig，給出一個代表性實驗的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4)。]與之對照，當(dāng)EBV肽存在時，尤其是用整個PBL時，IgM生成明顯增加(圖7C)。
不是所有的CD21配體都能調(diào)節(jié)IgE/IgG4生成。一種結(jié)合CD21的C3肽不抑制IgE和IgG4的生成(未給出)。這由圖7d給出，該圖描繪用結(jié)合CD2l的C3肽不能抑制IgE生成。[純化的扁桃體B細(xì)胞與200U/ml的IL-4和抗CD40抗體(1μg/ml)及遞增濃度的C3肽或EBV肽溫育14天。用特異性ELISA測量IgE，給出一個代表性實驗的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4)。]C3肽不抑制CD23結(jié)合(圖7a)。這些結(jié)果又一次強(qiáng)調(diào)了CD23-CD21配對與IgE/IgG4生成的相關(guān)性。未檢查IFN-α因為已知IFN-α抑制IgE生成(Pene等，正常人類淋巴細(xì)胞的IgE生成受IL-4誘導(dǎo)并被α干擾素、γ干擾素和前列腺素E2阻遏，美國國家科學(xué)院院刊858166(1988))，雖然IFN-α對CD23結(jié)合CD21并無影響(未給出)。
總而言之，本研究表明EBV肽減少CD23與CD21的結(jié)合，并且選擇性地減少人類B細(xì)胞的IgE和IgG4生成。
實施例8CD23結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞一種內(nèi)皮細(xì)胞系(LT2，Endolethium，第2卷，191-201頁，1994)或純化的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與CD23-脂質(zhì)體(CD23L)或血型糖蛋白-脂質(zhì)體(L-Gly)對照溫育。用抗CD23mAb(mAb25＝a-CD23)抑制CD23-脂質(zhì)體結(jié)合來顯示結(jié)合的特異性。FACS分析細(xì)胞，測量MFI。
結(jié)果由圖8給出。
LT2來源的蛋白在CD23親和柱上純化。鑒定到115和76KDa的兩條帶。
權(quán)利要求
1.一種CD21、CD11b、CD11c、內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70到85KDa蛋白或內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa蛋白的結(jié)合劑，它被用于治療或預(yù)防炎癥、自體免疫或過敏性疾病。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合劑，其中結(jié)合劑是抗體、其片段、含有抗體或其片段的人工構(gòu)建體、模擬物、或這些結(jié)合劑中任一種的衍生物。
3.權(quán)利要求1或2的結(jié)合劑，它是人化的或嵌合的抗體。
4.權(quán)利要求1的結(jié)合劑，它是Epstein Barr病毒、X因子、EpsteinBarr病毒的一部分(可為糖基化或非糖基化形式)、X因子片段、或這些結(jié)合劑中任一種的衍生物。
5.權(quán)利要求4的結(jié)合劑，它是Epstein Barr病毒的gp350/220糖蛋白、相應(yīng)的非糖基化形式的蛋白、上述糖蛋白或蛋白的片段、或這些結(jié)合劑中任一種的衍生物。
6.權(quán)利要求5的結(jié)合劑，它是具有氨基酸序列TGEDPGFFNVEIC的肽、其片段，或該肽或片段的衍生物。
7.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項的結(jié)合劑，它阻遏CD23和在體內(nèi)與之結(jié)合的配體的相互作用。
8.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項的結(jié)合劑，它被用于治療關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、全身性紅斑狼瘡、Mashimotos甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、眼色素層炎、皮炎、牛皮癬、蕁麻疹、腎病綜合癥、腎小球腎炎、發(fā)炎性腸道疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏癥、Sjogren氏綜合癥、過敏反應(yīng)、哮喘、濕疹、GVH、COPD、支氣管炎、胰島炎、鼻炎或糖尿病。
9.權(quán)利要求1至7中任一權(quán)項的結(jié)合劑，它被用于治療關(guān)節(jié)炎、過敏反應(yīng)、潰瘍性結(jié)腸炎或Crohn氏癥。
10.權(quán)利要求9的結(jié)合劑，它被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
11.CD21、CD11b、CD11c、內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70至85KDa蛋白或內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa蛋白的結(jié)合劑在制造藥物方面的應(yīng)用，所述藥物被用于治療關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、全身性紅斑狼瘡、Mashimotos甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、眼色素層炎、皮炎、牛皮癬、蕁麻疹、腎病綜合癥、腎小球腎炎、發(fā)炎性腸道疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn氏癥、Sjogren氏綜合癥、過敏反應(yīng)、哮喘、濕疹、GVH、COPD、支氣管炎、胰島炎、鼻炎或糖尿病。
12.權(quán)利要求11的結(jié)合劑在制造藥物方面的應(yīng)用，所述藥物被用于治療關(guān)節(jié)炎、過敏反應(yīng)、潰瘍性結(jié)腸炎或Crohn氏癥。
13.權(quán)利要求12的結(jié)合劑在制造藥物方面的應(yīng)用，所述藥物被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
14.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1至7中任一權(quán)項的結(jié)合劑和藥用載體。
15.權(quán)利要求1的結(jié)合劑，它基本如前所述。
16.一種治療炎癥、自體免疫或過敏性疾病的方法，它包括用藥學(xué)有效量的CD21、CD11b、CD11c、內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70到85KDa蛋白或內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa蛋白的結(jié)合劑對患者給藥。
全文摘要
CD11b、CD11c、CD21、CD23、一種內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的70到85KDa蛋白質(zhì)或一種內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的115KDa蛋白質(zhì)的結(jié)合劑可用于治療炎癥、自體免疫或過敏性疾病。
文檔編號A61P31/04GK1171119SQ95197075
公開日1998年1月21日 申請日期1995年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月25日
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