專利名稱：P2y12受體的h2單元型與增加的血栓形成和外周動(dòng)脈疾病的危險(xiǎn)相關(guān)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與血小板凝集(platelet aggregation)和血栓形成的危險(xiǎn)相關(guān)的P2Y12受體的多態(tài)性的鑒定。
ADP(腺苷5′-二磷酸)是止血和血栓形成的最重要的介體之一(Storey等，2000)。ADP在血小板上的作用是通過(guò)被稱為P2Y1和P2Y12的兩種P2Y受體介導(dǎo)的。大量的證據(jù)表明，P2Y12受體在止血血栓的形成和動(dòng)脈血栓形成的發(fā)生方面起著關(guān)鍵作用(Mills等，1996；Cattaneo等，1999)。P2Y12在動(dòng)脈血栓形成中的關(guān)鍵作用得到噻吩并吡啶類抗血栓形成藥物，如靶向P2Y12受體(Hollopeter等，2001；Quinn等，1999)的氯吡格雷和噻氯匹定，對(duì)諸如中風(fēng)，心肌梗塞和周圍性血管疾病的多種血栓形成疾病的有益作用的證實(shí)(Quinn等，1999；和參見(jiàn)CAPRIESteering Committee.Lancet.1996；3481329-1339)。ADP信號(hào)傳導(dǎo)涉及由Gq-結(jié)合的P2Y1受體介導(dǎo)的Ca++的瞬時(shí)升高(Jin等，1998a)，和由Gj-結(jié)合的P2Y12受體介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶的抑制(Hollopeter等，2001；Foster等，2001)。由ADP同時(shí)活化Gq和Gj途徑是正常凝聚所必須的(Jin等，1998b；Hechler等，1998a)。通過(guò)P2Y1活化Gq途徑導(dǎo)致了血小板形狀的改變，和血小板凝集的可快速逆轉(zhuǎn)波(Jin等，1998a；Hechler等，1998a)，而通過(guò)P2Y12活化Gi途徑引起了緩慢發(fā)展和持久的血小板凝集(Hechler等，1998b)。P2Y12的作用并不局限于抑制腺苷酸環(huán)化酶，以及細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的隨后降低。實(shí)際上，業(yè)已證實(shí)P2Y12受體能通過(guò)磷酸肌醇3-(PI3-)激酶途徑(Kauffenstein等，2001)和/或另一種未鑒定的G蛋白(Daniel等，1999)激活糖蛋白(GP)IIbIIIa整聯(lián)蛋白。因此，P2Y12表現(xiàn)出在接觸ADP時(shí)出現(xiàn)的血小板凝集的不可逆轉(zhuǎn)波方面具有重要作用。
最近，由兩個(gè)研究小組鑒定了編碼342個(gè)氨基酸的受體的P2Y12基因(Hollopeter等，2001；Foster等，2001；Zhang等，2001)。業(yè)已描述了上四位患者，在接觸ADP之后，他們的血小板發(fā)生了很少或沒(méi)有可逆的凝集，并且表現(xiàn)出降低前列腺素E1(PGE1)-刺激的血小板的正常腺苷酸環(huán)化酶抑制作用(Nurden等，1995；Cattaneo等，1992)。在一位患者中，這種表型與P2Y12基因異常相關(guān)(Hollopeter等，2001)。
業(yè)已報(bào)導(dǎo)了產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的凝集所需要的ADP的濃度在個(gè)體之間具有很大變化(Feng等，1999)。
由于遺傳因素在血小板凝集方面具有重要作用(O′Donnell等，2001)，本發(fā)明人研究了P2Y12基因上的序列變異，這些變異可能解釋血小板凝集對(duì)ADP的反應(yīng)的個(gè)體間差異。
本發(fā)明人在P2Y12受體基因上鑒定了三個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)和核苷酸插入，它們確定了被稱為H1和H2的兩種單元型。H2單元型與響應(yīng)ADP的較高的最大血小板凝集相關(guān)。
與提高的ADP誘導(dǎo)的血小板凝集強(qiáng)烈相關(guān)的P2Y12受體單元型的鑒定具有重要的臨床意義，特別是在篩查具有血栓形成，特別是動(dòng)脈血栓形成(atherothrombosis)的危險(xiǎn)，和對(duì)噻吩并吡啶類藥治療欠佳反應(yīng)的對(duì)象方面具有重要作用。
考慮到高危外周動(dòng)脈疾病(PAD)患者中P2Y12受體的特異性，和H 2等位基因在血小板凝集中的功能的增加，本發(fā)明人在病例-對(duì)照研究中進(jìn)一步研究了P2Y12基因H2單元型與PAD的關(guān)系。
他們發(fā)現(xiàn)了P2Y12H2單元型與PAD的強(qiáng)烈相關(guān)。
根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明提供了用于區(qū)分P2Y12受體中的H1和H2單元型的方法，后者與出現(xiàn)血栓形成的較高的危險(xiǎn)和/或?qū)︵绶圆⑦拎ゎ愃幹委熭^低的敏感性相關(guān)。
因此，該方法可用于測(cè)定在對(duì)象體內(nèi)出現(xiàn)血栓形成，特別是動(dòng)脈血栓形成的危險(xiǎn)。
該方法還可用于測(cè)定對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性。
P2Y12受體如上文所述，業(yè)已克隆了人P2Y12受體。另外，已表征了其他物種中的變體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“P2Y12受體”表示任何物種，特別是人類的P2Y12受體，不過(guò)，還表示如果需要的話，可以使用本發(fā)明的方法的其他哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物的P2Y12受體。因此，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”表示任何人類患者或任何哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物。
人P2Y12cDNA序列可以從Genbank獲得(登記號(hào)AF313449和AY136754)。
本發(fā)明人分析了健康人群中的P2Y12基因，并且發(fā)現(xiàn)它包括由位于ATG密碼子的上游、長(zhǎng)度大約為1700bp的一個(gè)內(nèi)含子分開(kāi)的至少二個(gè)外顯子。外顯子2編碼完整的342個(gè)氨基酸的蛋白。因?yàn)榫哂?個(gè)核苷酸(nt)的重復(fù)序列(表1)，無(wú)法確定外顯子1的確切的3′末端和外顯子2的5′起始位點(diǎn)。
表1描述外顯子1的確切的3′末端和外顯子2的5′起始位點(diǎn)的可能的核苷酸序列模式。內(nèi)含子序列用小寫字母表示。在重復(fù)序列下面劃線。本發(fā)明人隨意選擇模式1進(jìn)行核苷酸編號(hào)。
表1表示三種可能的序列模式，模式3是最可能的。不過(guò)，本發(fā)明人在開(kāi)始他們的研究工作時(shí)隨意選擇了模式1，對(duì)研究的多態(tài)性進(jìn)行編號(hào)。因此，對(duì)下面的多態(tài)性進(jìn)行編號(hào)時(shí)，遵循模式1。
根據(jù)模式1，序列SEQ ID No 1代表內(nèi)含子的5′序列，而序列SEQID No 2代表外顯子2的5′序列，根據(jù)本發(fā)明，它們是P2Y12基因中的感興趣的部分。這兩種序列都顯示下面定義的H2單元型。起始密碼子ATG的A核苷酸是SEQ ID No 2上的17號(hào)核苷酸。
H1/H2單元型本發(fā)明人業(yè)已對(duì)P2Y12基因進(jìn)行了測(cè)序，并且發(fā)現(xiàn)三種感興趣的單核苷酸多態(tài)性(SNPS)和單核苷酸插入多態(tài)性(表2)。在本發(fā)明中，這些多態(tài)性有時(shí)又被稱作″感興趣的多態(tài)性位置″。
表2在所述研究群體中檢測(cè)的多態(tài)性的描述。所述H1/H2單元型是由i-C139T，i-T744C(也被錯(cuò)誤地稱為i-T745C)，i-ins801A(也被錯(cuò)誤地稱為i-ins802A)和G52T多態(tài)性確定的。
兩種變異位于5′內(nèi)含子(在本文中被縮寫為″i″)起始位點(diǎn)后139個(gè)核苷酸和744個(gè)核苷酸，所述變異分別由C至T(i-C139T)和T至C(i-T744C)的轉(zhuǎn)換構(gòu)成。另一種多態(tài)性由位于內(nèi)含子的801號(hào)位置上的單核苷酸插入(A)(i-ins801A)構(gòu)成。另外兩種多態(tài)性出現(xiàn)在外顯子2上，并且分別由位于ATG密碼子的第一個(gè)核苷酸后17個(gè)核苷酸和35個(gè)核苷酸的C至T轉(zhuǎn)換(C34T)和G至T顛換(G52T)構(gòu)成；它們都不改變編碼的氨基酸(分別為Asn6和Gly12)。C34T多態(tài)性與對(duì)ADP響應(yīng)的最大凝集沒(méi)有關(guān)系。
由于在100位白色人種的健康志愿者群體中i-C139T，i-T744C，i-ins801A和G52T多態(tài)性是完全連鎖不平衡的，本發(fā)明人將主要等位基因的單元型命名為″H1″(139號(hào)位置上的C，744號(hào)位置上的T，和i-ins801A在所述內(nèi)含子上的缺乏，以及外顯子2的52號(hào)位置上的G)，并且將次要等位基因的單元型命名為″H2″(139號(hào)位置上的T，744號(hào)位置上的C，i-ins801A在所述內(nèi)含子上的存在，和外顯子2的52號(hào)位置上的T)。單元型H1和H2的相應(yīng)的等位基因頻率為86％和14％。所有多態(tài)性的等位基因頻率符合哈迪-溫伯格平衡。
與H2等位基因的非攜帶者(H1/H1)相比，H2等位基因的攜帶者(H1/H2或H2/H2)在體外具有更強(qiáng)的ADP-刺激的血小板凝集，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的調(diào)節(jié)不同。
具有H2單元型的P2Y12受體基因的分離的核酸同樣是本發(fā)明的一部分。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是編碼P2Y12受體的分離的核酸，所述核酸包括P2Y12基因序列，它同時(shí)具有T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在。
所述核酸優(yōu)選包括SEQ ID No 1和/或SEQ ID No 2。
血栓形成危險(xiǎn)本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定在對(duì)象體內(nèi)患血栓形成的危險(xiǎn)的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號(hào)位置，和在外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在的同時(shí)出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且指示了與對(duì)照對(duì)象相比，患血栓形成的更高危險(xiǎn)，其中所述對(duì)照對(duì)象即在所述任何等位基因上都沒(méi)有H2單元型的對(duì)象(即H1/H1對(duì)象)。
患血栓形成的更高的危險(xiǎn)是指，與非攜帶者相比，在H2等位基因攜帶者中的明顯更大的危險(xiǎn)。
這種相對(duì)危險(xiǎn)性通常是通過(guò)病例-對(duì)照研究并且使用比數(shù)比(oddsratio，OR)評(píng)估的。1.1的OR相當(dāng)于患病的危險(xiǎn)提高了10％，而2的OR相當(dāng)于危險(xiǎn)增加了100％。
患血栓形成的危險(xiǎn)與血小板凝集的誘導(dǎo)相關(guān)。
血小板對(duì)于動(dòng)脈血栓形成來(lái)說(shuō)是特別重要的，并且還通過(guò)與功能紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的釋放參與動(dòng)脈粥樣硬化損傷的開(kāi)始和發(fā)展。動(dòng)脈粥樣硬化疾病的最重要的血管靶標(biāo)包括腦動(dòng)脈床、冠狀動(dòng)脈床和下肢動(dòng)脈床。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)″血栓形成″表示在血管中或在心臟管腔中血液凝塊的形成。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，包括動(dòng)脈血栓形成。
術(shù)語(yǔ)″動(dòng)脈血栓形成″，″動(dòng)脈粥樣硬化″和″動(dòng)脈的血栓形成″是同義詞。
動(dòng)脈血栓形成是很多血栓形成疾病，如中風(fēng)，心肌梗塞和外周動(dòng)脈疾病(PAD)的主要現(xiàn)象。
動(dòng)脈血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的同時(shí)出現(xiàn)在外周動(dòng)脈疾病(PAD)中是特別重要的。實(shí)際上，PAD與冠狀動(dòng)脈和腦血管的動(dòng)脈硬化癥事件的高危險(xiǎn)相關(guān)，并且流行病學(xué)研究業(yè)已證實(shí)了75％的PAD患者死于血管疾病(Ouriel等，2001)。
因此，在對(duì)象體內(nèi)鑒定P2Y12受體的H2單元型進(jìn)一步指示了患這種血栓形成疾病，特別是PAD的較高危險(xiǎn)。
在本發(fā)明的含義內(nèi)，上文所定義的″血栓形成″包括其他血栓形成狀態(tài)，如靜脈血栓形成和靜脈血栓栓塞病，以及血栓性微血管病或血管內(nèi)彌散性血凝固。
對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性本發(fā)明還提供了一種用于測(cè)定對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號(hào)位置，和在外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子的52號(hào)位置上的存在的同時(shí)出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當(dāng)存在于至少一個(gè)等位基因上時(shí)，指示與對(duì)照對(duì)象相比，所述對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療具有較低的敏感性，其中所述對(duì)照對(duì)象即沒(méi)有H2等位基因的對(duì)象(即H1/H1對(duì)象)。
在本發(fā)明中，″噻吩并吡啶類藥治療″表示目前所采用的抗血栓形成治療，它包括施用諸如氯吡格雷或噻氯匹定等噻吩并吡啶類藥物，或能阻斷ADP和P2Y12之間的相互作用的任何其他制劑。
″對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性″表示進(jìn)行這種治療的對(duì)象的反應(yīng)的多樣性。對(duì)所述治療較低的敏感性相當(dāng)于較差的反應(yīng)，因此是不理想的。
為了在早期階段幫助醫(yī)生設(shè)計(jì)最適用于所述對(duì)象的治療方案，確定對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性是特別有價(jià)值的。
H2等位基因之存在的鑒定上述方法，即用于測(cè)定血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的方法和測(cè)定對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的方法，包括鑒定P2Y12受體基因的H1/H2單元型。
所述鑒定可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何技術(shù)進(jìn)行。
在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可以通過(guò)從所述個(gè)體內(nèi)獲得DNA，并且確定感興趣的P2Y12受體基因的多態(tài)性位置上的序列，來(lái)確定個(gè)體的有關(guān)H1/H2單元型的多態(tài)性形式。
所述DNA可以從任何細(xì)胞來(lái)源獲得。臨床應(yīng)用中可以使用的細(xì)胞來(lái)源的非限定性例子包括血細(xì)胞，口腔細(xì)胞，子宮頸陰道細(xì)胞，來(lái)自尿道的上皮細(xì)胞，胎兒細(xì)胞，毛發(fā)，或通過(guò)活組織檢查獲得的存在于組織中的任何細(xì)胞。細(xì)胞還可以從體液中獲得，體液包括，但不局限于血液，唾液，汗液，尿液，腦脊髓液，糞便，在感染或發(fā)炎部位的組織分泌液。DNA可以利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的多種方法中的任意一種從所述細(xì)胞來(lái)源或體液中提取。應(yīng)當(dāng)理解的是，用于提取DNA的特定方法取決于所述來(lái)源的性質(zhì)。在另一種實(shí)施方案中，分析是在不提取DNA的情況下進(jìn)行的，例如，對(duì)全血進(jìn)行(Mercier等，1990)。
對(duì)H1/H2單元型的多態(tài)性位置上的DNA序列的確定，是通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)的。用于基因型分析的多種方法是現(xiàn)有的(Antonarakis等，1989；Cooper等，1991；Grompe，1993)。所述方法包括，但不局限于直接測(cè)序，限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，與標(biāo)記特異性寡核苷酸雜交，等位基因特異性PCR，使用誘變引物的PCR，連接酶-PCR，HOT裂解，變性梯度凝膠電泳(DGGE)，溫度變性梯度凝膠電泳(TGGE)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和變性高效液相層析(Kuklin等，1997)。直接測(cè)序可以通過(guò)任何方法進(jìn)行，包括，但不局限于使用Maxam-Gi1bert方法的化學(xué)測(cè)序；使用Sanger方法的酶促測(cè)序；質(zhì)譜分析測(cè)序；使用芯片型技術(shù)的測(cè)序(例如，參見(jiàn)Little等，1996)；和實(shí)時(shí)定量PCR。優(yōu)選的是，首先使用特定的擴(kuò)增引物，通過(guò)凝集酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)來(lái)自對(duì)象的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。不過(guò)，還可以采用若干種其他方法，可以不依賴于PCR對(duì)DNA進(jìn)行研究，如寡核苷酸連接測(cè)定(OLI)，滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)或InvaderTM測(cè)定。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，提供了用于鑒定對(duì)象體內(nèi)與血栓形成相關(guān)或與對(duì)噻吩并吡啶類藥治療較低的敏感性相關(guān)的P2Y12受體的單元型的至少一種多態(tài)性的體外方法，該方法包括在P2Y12受體基因的至少一個(gè)區(qū)域上分析生物學(xué)樣品的基因組DNA，所述區(qū)域位于內(nèi)含子(SEQ IDNo 1)的139，744，和801號(hào)位置和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置周圍；其中，T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在的同時(shí)出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當(dāng)存在于至少一個(gè)等位基因上時(shí)，指示與對(duì)照對(duì)象相比，具有患血栓形成的較高危險(xiǎn)或?qū)︵绶圆⑦拎ゎ愃幹委熅哂休^低敏感性。
所述分析優(yōu)選可以包括擴(kuò)增所述基因組DNA的所述區(qū)域的步驟(例如，通過(guò)PCR擴(kuò)增)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述分析是對(duì)分離的(即提取的)基因組DNA進(jìn)行的。
用于鑒定P2Y12受體多態(tài)性的優(yōu)選技術(shù)包括測(cè)序。
試劑盒根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，H1/H2單元型是通過(guò)讓所述對(duì)象的DNA與任選地標(biāo)記過(guò)的核酸探針接觸檢測(cè)的。
還可將引物用于擴(kuò)增包括感興趣的多態(tài)性位置的P2Y12基因的部分或?qū)λM(jìn)行測(cè)序。
所述探針或引物是能夠與包括所述感興趣的多態(tài)性位置的P2Y12基因序列的部分特異性雜交的核酸。這意味著，它們是能夠與所提及核酸序列在高嚴(yán)格條件下雜交(Sambrook等，1989)的序列。所述條件是根據(jù)解鏈溫度Tm和高離子強(qiáng)度確定的。優(yōu)選的是，最理想的序列是能夠在(Tm-5℃)至(Tm-30℃)的溫度范圍，更優(yōu)選(Tm-5℃)至(Tm-10℃)溫度范圍內(nèi)雜交的序列。6×SSC的離子強(qiáng)度是更優(yōu)選的。例如，高嚴(yán)格性雜交條件相當(dāng)于最高Tm，例如，50％甲酰胺，5×或6×SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉。雜交要求兩種核酸包括互補(bǔ)序列，不過(guò)，根據(jù)雜交的嚴(yán)格性，堿基之間的錯(cuò)配是可能的。用于雜交核酸的合適的嚴(yán)格性取決于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度，本領(lǐng)域眾所周知的變量。兩種核酸序列之間相似或同源程度越高，具有所述序列的核酸雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(相對(duì)于較高的Tm)按以下順序減弱RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。對(duì)于長(zhǎng)度超過(guò)100個(gè)核苷酸的雜交來(lái)說(shuō)，業(yè)已推導(dǎo)出了用于計(jì)算Tm的方程(參見(jiàn)Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對(duì)于較短核酸，即寡核苷酸的雜交來(lái)說(shuō)，錯(cuò)配的位置變得更為重要，并且寡核苷酸的長(zhǎng)度決定它的特異性(參見(jiàn)Sambrook等，同上，11.7-11.8)?？呻s交核酸的最低長(zhǎng)度至少為大約10個(gè)核苷酸；優(yōu)選至少大約15個(gè)核苷酸；更優(yōu)選所述長(zhǎng)度至少為大約20個(gè)核苷酸。
優(yōu)選的探針或引物在下面的


或?qū)嵤├信丁?br> 當(dāng)所述引物是誘變引物時(shí)，用于確定所述雜交條件的上述規(guī)則需要調(diào)整。誘變引物的序列可能實(shí)際上相對(duì)野生型序列是部分改變了的，以便在擴(kuò)增特定等位基因時(shí)導(dǎo)入限制位點(diǎn)。另外，所述誘變引物的長(zhǎng)度常常為30-40個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還提供了適用于確定P2Y12受體的H1/H2單元型的至少一種多態(tài)性的試劑盒。
所述試劑盒可以包括以下部分(i)……of DNA，并且可以預(yù)先標(biāo)記?；蛘撸鎏结樋梢允俏礃?biāo)記過(guò)的，并且用于標(biāo)記的成分可以包含在所述試劑盒的獨(dú)立容器中；和(ii)雜交試劑所述試劑盒還可以包括特定雜交方法所需要的其他適當(dāng)包裝的試劑和材料，如果適合的話包括固相基質(zhì)，和標(biāo)準(zhǔn)物。
在另一種實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包括(i)序列確定或擴(kuò)增引物測(cè)序引物可以是預(yù)先標(biāo)記的或可以包括親和純化或連接部分；和(ii)序列確定或擴(kuò)增試劑所述試劑盒還可以包括特定測(cè)序擴(kuò)增方法所需要的其他適當(dāng)包裝的試劑和材料。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一組測(cè)序或擴(kuò)增引物，它們的序列相應(yīng)于靠近至少一個(gè)所述多態(tài)性位置的序列，以及用于檢測(cè)每一種多態(tài)性序列的存在的工具。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，它包含對(duì)擴(kuò)增包括內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744和801號(hào)位置和/或外顯子2(SEQ IDNo 2)的52號(hào)位置中的至少一個(gè)的全部或部分P2Y12基因特異的核苷酸引物對(duì)。
下面的附圖和實(shí)施例舉例說(shuō)明了本發(fā)明，而不限定它的范圍。

圖1是表示在P2Y12基因中所述引物和多態(tài)性的位置的示意圖。
用引物E和J獲得了大約3100bp的PCR產(chǎn)物。然后，用以下引物進(jìn)行序列分析B5’TCATGCCAGACTAGACCGAA3’(SEQ ID N°3)，C5’ATCGATCGCTACCAGAAGACCACC3’(SEQ ID N°4)，E5’GGCTGCAATAACTACTACTT3’(SEQ ID N°5)，F(xiàn)5’AATTCCTTTCTGTCCTTAATT3’(SEQ ID N°6)，G5’TAAATAGGTGAGGAGATGCTG3’(SEQ ID N°7)，H5’TGCATTTCTTGTTGGTTACCT3’(SEQ ID N°8)，J5’GTCGTTTGTTTTGCTGCTAATA3’(SEQ ID N°9)，K5’CATTGAGAATTTCAGCTCCC3’(SEQ ID N°1O)，L5’ATACTAACTACTACAATGAAGAT3’(SEQ ID N°11)和M5’CCTTACACCCTGAGCCAAAC3’(SEQ ID N°12).
ATG和TAA分別是起始和終止密碼子。i-C139T，i-T744C，i-ins801A，C34T和G52T是存在于所述研究群體中的多態(tài)性。
圖2是顯示在98位健康志愿者中對(duì)ADP的最大血小板凝集反應(yīng)的圖。在3分鐘的孵育時(shí)間之后，用2μM ADP刺激血小板(250×109/L，存在于檸檬酸化的PRP中)。在第一次觀察和第二次觀察(一周之后)時(shí)記錄的凝集之間的和諧系數(shù)(concordance coefficient)為77％(P＜0.001)。
圖3是顯示P2Y12單元型響應(yīng)2μM ADP的最大凝集的圖。將每一位志愿者在第一次觀察和第二次觀察時(shí)記錄的最大凝集值的平均值用于分析。不具有H2等位基因的對(duì)象(H1/H1，n＝74)的中間值為34.7％，而攜帶一個(gè)H2等位基因(H1/H2，n＝21)的對(duì)象的中間值為67.9％，而攜帶兩個(gè)H2等位基因的三個(gè)對(duì)象(H2/H2)的中間值為82.4％(P＝0.0071)。
圖4是顯示在H2單元型的攜帶者和非攜帶者中ADP對(duì)伊洛前列素誘導(dǎo)的cAMP形成的抑制作用的圖。在37℃下孵育1分鐘之后，將伊洛前列素(20μg/μL最終濃度)添加到檸檬酸化的PRP中。1分鐘之后添加鹽水(對(duì)照)或1、2或5μM的ADP。3分鐘之后終止反應(yīng)，并且使用商業(yè)化測(cè)定試劑盒測(cè)定cAMP濃度。三角形和圓分別表示H2單元型的攜帶者和非攜帶者。平均值±SEM。
實(shí)施例實(shí)施例1P2Y12基因序列變異的鑒定方法對(duì)象招募年齡在18-35歲之間的98位不相關(guān)的健康的白色人種男性志愿者，并且在Clinical Investigation Center of Hpital Européen Georges Pompidou進(jìn)行研究。這些志愿者是不吸煙者，沒(méi)有明顯的個(gè)人和家族性醫(yī)學(xué)病史，并且在采集血液之前至少10天沒(méi)有進(jìn)行過(guò)任何藥物治療。在被招募進(jìn)來(lái)之前，進(jìn)行了身體檢查和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，包括白血細(xì)胞，紅血細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)，平均血小板體積，凝血酶原時(shí)間(PT)，活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)，血漿血纖蛋白原和C-反應(yīng)性蛋白測(cè)定。對(duì)在第0天(觀察1)和第7天(觀察2)從所有志愿者體內(nèi)獲得的血液進(jìn)行凝集測(cè)定。從20位志愿者的小組中獲得第三種血液樣品進(jìn)行血小板cAMP測(cè)定，并且比較在檸檬酸化的和水蛭素抗凝的富含血小板的血漿(PRP)中的最大凝集。所有志愿者都提供了他們的書面知情同意，并且這項(xiàng)研究方案得到了地方道德協(xié)會(huì)的同意。
樣品制備在過(guò)夜禁食之后，使用19號(hào)針頭，在上午8點(diǎn)到10點(diǎn)之間將靜脈血液采集到裝有0.105M檸檬酸鈉(1體積/9體積)(BD VacutainerR，Becton Dickinson，Le Pont de Claix，法國(guó))或50μg/mL lepirudine(Refludan，Hoechst，Paris，法國(guó))的試管中，并且不使用止血帶。將前2ml血液扔掉。通過(guò)在室溫下以1000rpm的速度離心10分鐘獲得富含血小板的血漿(PRP)。
將通過(guò)以4000rpm的速度進(jìn)一步離心15分鐘獲得的自身的缺少血小板的血漿用于把PRP的血小板數(shù)量調(diào)整到250×109/L。
血小板凝集研究在血液采集之后2小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行凝集研究。在37℃下，通過(guò)采用光度測(cè)定方法在四通道凝集檢測(cè)儀(RegulestAmneville，F(xiàn)rance)上測(cè)定凝集。在37℃下將PRP的280-μL等份樣品培養(yǎng)3分鐘，然后以1100rpm的速度攪拌2分鐘，然后添加20μL的鹽水或ADP(Sigma-Aldrich，St Quentin Fallavier，F(xiàn)rance)，ADP濃度為1，2或5μM(最終濃度)。記錄血小板凝集反應(yīng)5分鐘時(shí)間。
cAMP測(cè)定在20位挑選的對(duì)象中測(cè)定血小板cAMP含量，這包括將270μL的PRP與10μL穩(wěn)定的前列環(huán)素類似物伊洛前列素溶液一起孵育(20g/L，最終濃度)(Ilom édine，Schering-PLough)1分鐘，邊進(jìn)行攪拌，然后添加20μL的鹽水或ADP(1，2或5μM)。3分鐘之后，通過(guò)添力20μL的12％三氯乙酸終止該反應(yīng)。然后提取cAMP，并且按照生產(chǎn)商的說(shuō)明用酶免疫測(cè)定(EIA)(Amersham，Pharmacia Biotech，Orsay，F(xiàn)rance)進(jìn)行測(cè)定，而不了解所述對(duì)象的P2Y12基因型。
基因分型研究按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，通過(guò)使用Qiamp Maxi Kit(Qiagen，Courtaboeuf，F(xiàn)rance)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離基因組DNA。
P2Y12受體。本發(fā)明人利用了Hollopeter等，(2001)報(bào)導(dǎo)的cDNA序列，該序列可以通過(guò)GenBank登錄號(hào)AF313449獲得。假設(shè)P2Y12基因組構(gòu)與七種其他跨膜結(jié)構(gòu)域受體基因的組構(gòu)相同，其中這些基因大部分包括由一個(gè)內(nèi)含子隔開(kāi)的兩個(gè)外顯子，本發(fā)明人用被稱為E和J的兩種寡核苷酸作正義和反義引物進(jìn)行了初步擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)；它們位于所述報(bào)導(dǎo)過(guò)的cDNA的5′和3′末端(圖1)。然后用Pre-Sequencing Kit(AmershamPharmacia Biotech)純化所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
純化之后，使用引物E，B和J進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。隨后用若干種其他引物(G，H，K和L)(圖1)進(jìn)行的測(cè)序，使得我們能夠測(cè)定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列。用ABI Prism 3700(Applera)進(jìn)行序列分析。
對(duì)群體中的40位對(duì)象進(jìn)行篩選，足以鑒定頻率為5％或以上的多態(tài)性，置信區(qū)間(CI)為95％。因此，通過(guò)用引物K對(duì)外顯子1的58個(gè)核苷酸進(jìn)行測(cè)序，用引物E和G對(duì)它的3′側(cè)翼區(qū)的947個(gè)核苷酸進(jìn)行測(cè)序，用L，C和M對(duì)外顯子2的1274個(gè)核苷酸進(jìn)行測(cè)序，并且用引物H對(duì)它的5′側(cè)翼區(qū)的570個(gè)核苷酸進(jìn)行測(cè)序，篩選了第一個(gè)系列的48位連續(xù)健康志愿者的P2Y12基因多態(tài)性。
所述引物如圖1所示。然后通過(guò)使用靶向所述鑒定的多態(tài)性的引物在另外50位對(duì)象中對(duì)P2Y12基因進(jìn)行測(cè)序。
在不了解血小板凝集結(jié)果的情況下分析PCR和測(cè)序結(jié)果。在模棱兩可的情況下重復(fù)基因分型。對(duì)所有98位對(duì)象進(jìn)行了成功的基因分型。
血小板RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄通過(guò)以4000rpm的速度離心15分鐘，使4ml的PRP(109血小板)沉淀，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用RNeasy試劑盒(Qiagen)提取RNA。用10單位的RNasinTM核糖核苷酸酶抑制劑(Promega，Charbonnières，F(xiàn)rance)，100單位的Superscript II RnaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和1.5mM隨機(jī)六核苷酸(Amersham Pharmacia biotech)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA在-20℃下保存。
統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表示為平均值±SEM，偏斜變量(skewed variables)除外，后者被表示為中間值。用和諧檢驗(yàn)(concordance test)比較在第一次觀察和第二次觀察獲得的每一個(gè)對(duì)象的值(Lin，1989)。利用x2測(cè)定比較觀察到的等位基因和基因型頻率和哈迪-溫伯格平衡預(yù)測(cè)結(jié)果。采用非參數(shù)Kruskall-Wallis測(cè)定測(cè)試在基因型組之間的趨勢(shì)。在校正其他變量之后測(cè)定了基因型和對(duì)ADP的最大血小板凝集反應(yīng)之間的關(guān)系，這使用多變量對(duì)數(shù)回歸模型，其中，最大凝集＜50％被編碼為0，而最大凝集≥50％被編碼為1?？紤]突變等位基因純合的對(duì)象數(shù)量少(＜7)，無(wú)論何種多態(tài)性，將這些對(duì)象與雜合的對(duì)象合并在一起進(jìn)行回歸分析。
用STATA 7.0軟件包(Stata Corp，College Station，TX)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，并且將P值＜0.05的差別視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
結(jié)果為了評(píng)估ADP-誘導(dǎo)的血小板凝集的可變性，本發(fā)明人測(cè)試了從98位健康志愿者中每一個(gè)的體內(nèi)獲得的間隔一周的兩份樣品。圖2比較了在兩次觀察中在檸檬酸化的PRP中對(duì)2μM ADP的最大凝集反應(yīng)。鑒定了至少兩種表現(xiàn)型類型。
在47位對(duì)象中在兩次觀察時(shí)的最大凝集都低于50％(48.0％)。另外，在該小組中的43位對(duì)象(91.5％)具有與可逆的第一階段吻合的凝集特征。相反，在29位對(duì)象中(29.6％)在兩次觀察中的最大凝集超過(guò)50％，這些對(duì)象中的28位(96.5％)具有ADP-誘導(dǎo)的凝集的不可逆轉(zhuǎn)的第二階段。由于在兩次觀察之間的最大凝集是穩(wěn)定的(r2＝77％，P＜0.001)，我們將每個(gè)對(duì)象的平均值(以下稱之為最大凝集)用于隨后的分析。
兩組不同表型的血小板凝集的存在，以及隨時(shí)間發(fā)展的ADP反應(yīng)的穩(wěn)定性，暗示了ADP對(duì)血小板凝集之影響的可能的遺傳控制作用。因此，本發(fā)明人在所述研究群體中分析了P2Y12基因，并且發(fā)現(xiàn)它包括由一個(gè)長(zhǎng)度大約為1700bp的內(nèi)含子隔開(kāi)的至少兩個(gè)外顯子，內(nèi)含子位于ATG密碼子的上游(圖1)。外顯子2編碼完整的342個(gè)氨基酸的蛋白。由于6個(gè)核苷酸(nt)的重復(fù)序列(表1)，不能確定外顯子1的確切的3′末端和外顯子2的5′起始位點(diǎn)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了確定H1和H2單元型的三個(gè)SNPs和單核苷酸插入多態(tài)性(表2)。
H2單元型與對(duì)ADP反應(yīng)的較高的最大凝集相關(guān)，在不攜帶H2等位基因的對(duì)象(H1/H1，n＝74)中的中值為34.7％，在攜帶一個(gè)H2等位基因的對(duì)象(H1/H2，n＝21)中為67.9％，而在攜帶兩個(gè)H2等位基因的對(duì)象(H2/H 2)中為82.4％(圖3，P＝0).0071)。多變量對(duì)數(shù)回歸分析表明，該相關(guān)性的比數(shù)比(OR)(OR 3.3，95％C11.1-10.4)在對(duì)年齡，體重指數(shù)，血小板數(shù)，平均血小板體積，白細(xì)胞數(shù)，血纖蛋白原，PT，aPTT和PIA1/PIA2基因型進(jìn)行校準(zhǔn)之后沒(méi)有明顯改變。C34T多態(tài)性與響應(yīng)ADP的最大凝集沒(méi)有關(guān)系。
為了研究H2單元型和位于外顯子1和2之間的內(nèi)含子的可能的剪接變體的關(guān)系，本發(fā)明人對(duì)P2Y12cDNA進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，所述cDNA是通過(guò)對(duì)來(lái)自具有H1/H1(n＝3)，H1/H2(n＝3)和H2/H2(n＝3)基因型的志愿者的血小板mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的。核苷酸測(cè)序沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變異，而無(wú)論單元型如何。另外，所述序列特征與H1/H2對(duì)象中的兩個(gè)等位基因的擴(kuò)增一致，表明了這兩種mRNA變體都是轉(zhuǎn)錄的(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了進(jìn)一步研究H2單元型和ADP-刺激的血小板凝集之間的關(guān)系，本發(fā)明人隨機(jī)挑選H2單元型的10個(gè)攜帶者和10個(gè)非攜帶者。由于ADP-誘導(dǎo)的血小板凝集被認(rèn)為是依賴于細(xì)胞外Ca++濃度的(Packam等，1987)，他們?cè)诤械虲a++濃度(檸檬酸-抗凝PRP)的培養(yǎng)基和在含有生理學(xué)Ca++濃度(水蛭素-抗凝PRP)的培養(yǎng)基中測(cè)定了對(duì)2μM ADP的最大凝集。對(duì)于檸檬酸化的血液來(lái)說(shuō)，H2等位基因的攜帶者和非攜帶者分別具有71.5％±5.2％和50.7％±7.2％的最大凝集(P＝0.023)。類似的，在水蛭素-抗凝固血液中，H2等位基因的攜帶者和非攜帶者分別具有53.8％±3.9％和42.8％±3.4％的最大凝集(P＝0.034)。
為了確定H2單元型和腺苷酸環(huán)化酶的P2Y12調(diào)控之間可能的聯(lián)系，本發(fā)明人測(cè)定了ADP在來(lái)自相同的20位對(duì)象的血小板中抑制伊洛前列素刺激的cAMP積累的能力。ADP以濃度依賴性方式在來(lái)自非攜帶者的血小板中抑制cAMP形成，在1，2和5μM ADP的濃度下的抑制率分別為13％，31％和37％(圖4)，與之對(duì)照的是在H2單元型攜帶者中的抑制率分別為31％，39％和50％(P＝0.028)。
討論本發(fā)明人在P2Y12受體基因中鑒定了三種單核苷酸多態(tài)性(SNP)和核苷酸插入，由此確定了被稱為H1和H2的兩種單元型。H2單元型與對(duì)ADP反應(yīng)的增加的最大血小板凝集相關(guān)。這至少部分與通過(guò)ADP調(diào)控cAMP抑制作用的機(jī)制的差異相關(guān)。
業(yè)已證實(shí)，在大群體研究中，ADP-誘導(dǎo)的血小板反應(yīng)表現(xiàn)出在產(chǎn)生＞50％凝集的二相性反應(yīng)需要的ADP濃度方面具有顯著的可變性(Feng等，1999)。在本研究中，在98位健康志愿者中ADP-誘導(dǎo)的凝集在間隔一周的兩次測(cè)定之間是穩(wěn)定的，即在更新大部分血小板之后。以上結(jié)果指示了ADP-誘導(dǎo)的血小板凝集的遺傳學(xué)控制。
為了進(jìn)一步研究H2單元型的攜帶者和非攜帶者對(duì)ADP的凝集反應(yīng)之間的差異，本發(fā)明人檢查了伊洛前列素-刺激的血小板的腺苷酸環(huán)化酶抑制。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)了H2單元型和由ADP導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低之間的相關(guān)性。
用諸如噻吩并吡啶類藥噻氯匹定和氯吡格雷等特異性P2Y12受體抑制劑獲得的數(shù)據(jù)，證實(shí)了P2Y12是負(fù)責(zé)腺苷酸環(huán)化酶抑制和隨后的細(xì)胞內(nèi)cAMP減少的僅有的已知血小板ADP受體(Geiger等，1999)。另外，選擇性的P2Y1受體拮抗劑對(duì)ADP-誘導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶抑制不起作用(Jin等，1998a)。因此，在ADP刺激之后，H2單元型的攜帶者和非攜帶者之間的血小板cAMP濃度的差別，是對(duì)在這兩組對(duì)象中觀察到的最大ADP-誘導(dǎo)的凝集的差別的似乎合理的解釋，不過(guò)，我們不能排除腺苷酸環(huán)化酶獨(dú)立型機(jī)制的作用(Kauffenstein等，2001)。
業(yè)已用洗滌過(guò)的血小板表征了Ca++濃度對(duì)ADP-誘導(dǎo)的凝集的影響(Packam等，1987)。在將水蛭素用作抗凝血?jiǎng)r(shí)，血液Ca++濃度為大約1.1mM，并且與檸檬酸化的PRP相比，ADP誘導(dǎo)更少的顆粒內(nèi)容物釋放(Mustard等，1975)。不過(guò)，盡管在我們的研究中，水蛭素抗凝PRP中的最大凝集較低，但H2等位基因保持與凝集反應(yīng)相關(guān)。
H2單元型增強(qiáng)針對(duì)ADP反應(yīng)的血小板凝集的分子機(jī)制尚有待確立。由于在本研究群體中篩查了P2Y12基因的完整的編碼序列，可以排除影響蛋白結(jié)構(gòu)的氨基酸取代。另外，對(duì)兩種單元型進(jìn)行的cDNA分析，在外顯子1-外顯子2結(jié)合部分發(fā)現(xiàn)了正常序列，排除了剪接片體。因此，血小板上受體數(shù)量的增加最有可能解釋H2單元型和對(duì)ADP的血小板反應(yīng)性之間的關(guān)系。業(yè)已披露了其他基因上的能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率和蛋白合成數(shù)量的內(nèi)含子和外顯子增強(qiáng)子區(qū)上的多態(tài)性(Scohy等，2000；Watakabe等，1993)。
實(shí)施例2H2單元型與下肢外周動(dòng)脈疾病(PAD)的相關(guān)方法從巴黎地區(qū)招募了年齡小于70歲的連續(xù)的白種人男性PAD患者。PAD患者被定義為具有下肢癥狀性動(dòng)脈粥樣硬化疾病，踝/臂收縮壓比＜0.90，或具有以前有手術(shù)或血管內(nèi)血管再生的、有癥狀的下肢動(dòng)脈粥樣硬化疾病的病史。在先前所述對(duì)照組的703位白種人男性中隨機(jī)選擇年齡匹配的沒(méi)有動(dòng)脈疾病病史的對(duì)照對(duì)象，所述對(duì)照組是為了研究血管疾病中的遺傳學(xué)危險(xiǎn)因素而設(shè)計(jì)的(Arnaud等，2000)。所需對(duì)象數(shù)量的計(jì)算，是基于實(shí)施例1中所述P2Y12H2單元型的等位基因頻率，并且進(jìn)行測(cè)定，以便檢測(cè)2或2以上的比數(shù)比。當(dāng)α＝0.05和β＝0.20時(shí)，需要對(duì)150個(gè)病例和300個(gè)對(duì)照進(jìn)行研究。在兩年時(shí)間內(nèi)，包括185個(gè)病例，和與331個(gè)對(duì)照匹配。每一個(gè)病例與兩個(gè)對(duì)照匹配，其中的38個(gè)病例除外，這些病例各自與一個(gè)對(duì)照匹配。
病例和對(duì)照對(duì)象提供了書面知會(huì)同意，并且研究方案得到了Paris-Cochin道德協(xié)會(huì)的批準(zhǔn)。
P2Y12基因的H2等位基因的測(cè)定是通過(guò)如實(shí)施例1所披露的凝集酶鏈反應(yīng)和序列分析完成的。
結(jié)果和討論表3歸納了病例和對(duì)照的特征(表3)。
表3對(duì)象特征。數(shù)值是以每一組的平均值±SD或百分比的形式提供的。LDL和HDL，低和高密度脂蛋白；BMI，體重指數(shù)。

兩組的吸煙狀態(tài)，高血壓和糖尿病的發(fā)病率顯著不同。在這兩組中高膽固醇血癥是類似的。
病例更經(jīng)常用降脂藥物處理，并且具有較低的總膽固醇值和LDL膽固醇值。大部分PAD患者患有間歇性跛行，并且在31％的患者中目前存在冠狀動(dòng)脈或缺血性腦血管疾病。在PAD患者中，30％的對(duì)象具有至少一個(gè)H2等位基因，而在對(duì)照組中的比例為21％(p＝0.03)。在表4中提供了對(duì)數(shù)回歸結(jié)果。
表4.在病例和對(duì)照中P2Y12H1/H2單元型的基因型頻率，具有PAD的單變量和多變量OR。將H1/H2和H2/H2組合合并在一起，進(jìn)行OR計(jì)算。多變量分析的OR對(duì)在“方法”中定義的高血壓，高膽固醇血癥，糖尿病和煙草使用進(jìn)行校準(zhǔn)。

H2等位基因與PAD相關(guān)，在單變量分析中，OR＝1.6。在對(duì)包括高血壓，高膽固醇血癥，糖尿病和吸煙狀態(tài)在內(nèi)的常見(jiàn)的心血管危險(xiǎn)因素進(jìn)行校正后，所述相關(guān)得到加強(qiáng)，OR＝2.2(p＝0.004)。
這是表明功能性P2Y12基因多態(tài)性和動(dòng)脈粥樣硬化疾病之間相關(guān)的第一項(xiàng)研究。P2Y12是在PAD患者體內(nèi)導(dǎo)致血栓形成并發(fā)癥的一系列事件中的重要步驟。
H2單元型和PAD的相關(guān)突出了血小板在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用。
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序列表<110>INSERM et al.
<12D>P2Y12受體的H2單元型與增加的血栓形成和外周動(dòng)脈疾病的危險(xiǎn)相關(guān)<130>BET 03P0927<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>947<212>DNA<213>智人<400>1aggtaatgtt atttctacaa gtacttgaca aatatatgta tttacactct gatatgtgtg 60tacatttttt ccaagtttct cttaaaattg taaaccttaa taactatcaa tgcaagcatg 120tatttggaat aaaaattata attaaaatag aagtctaatt agtgatgtca gagacaattg 180ttaattagcc tctttattaa gaaaaattat acaaagcata gaaataaaat ataaatggtc 240ttagttactt tgcctcaagt ataaaatgag atttaaatac agataaaggg agctgaaatt 300ctcaatgtca agaatacttg ttaaatatct tacagactac acaaaatgta tattcactaa 360gtcgaatttc caaaacggtc agggatgaac taagaccaca cagcagtagc aggaaaggtt 420aaaatcagtg atcttgtatt ggaaaacatt aggttttgtt tagcattatt ttaaagcgct 480aaataggtga ggagatgctg aaaattgaag ccatactgtg acaacatgat tcttaatcgt 540tttccttcca taattaagga cagaaaggaa ttccatggac attttgggga atttaagtgc 600tacattcatt tatctaaata tcttttacac gaaagttatt ttttaaaatt tgttatttgt 660actttcaata tatctctgat tattaagaat attttatata gaatcaattt cacttatctc 720tggtgaaata aaaagattac aaacgtcatt tcaaattccc aagatgtaga tgccatatag 780catattcaag tcacttgtta agttttcatt atagctgcct attgtggtaa taacctatat 840tttattttag ctaccattac acactccata aatctggaaa gtatgccctg ttttgaggaa 900tgccaactca tgaccatata tacacaggcc atttctgact cttattt 947<210>2<211>130<212>DNA<213>智人<400>2aggtaaccaa caagaaatgc aagccgtcga caatctcacc tctgcgcctg gtaacaccag 60
tctgtgcacc agagactaca aaatcaccca ggtcctcttc ccactgctct acactgtcct 120gttttttgtt130<210>3<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>3tcatgccaga ctagaccgaa 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工引物<400>4atcgatcgct accagaagac cacc 24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>5ggctgcaata actactactt 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>6aattcctttc tgtccttaat t21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>7taaataggtg aggagatgct g21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>8tgcatttctt gttggttacc t21<210>9<211>22
<212>DNA<213>人工引物<400>9gtcgtttgtt ttgctgctaa ta 22<210>10<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>10cattgagaat ttcagctccc 20<210>11<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>11atactaacta ctacaatgaa gat 23<210>12<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>12ccttacaccc tgagccaaac 20
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定在對(duì)象體內(nèi)患血栓形成危險(xiǎn)的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號(hào)位置，和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在的同時(shí)出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當(dāng)存在于至少一個(gè)等位基因上時(shí)，指示與沒(méi)有任何H2等位基因的對(duì)照對(duì)象相比，出現(xiàn)血栓形成的危險(xiǎn)較高。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述血栓形成是動(dòng)脈血栓形成。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，H2單元型在至少一個(gè)等位基因上的存在進(jìn)一步指示出現(xiàn)外周動(dòng)脈疾病(PAD)的較高危險(xiǎn)。
4.一種用于測(cè)定對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號(hào)位置，和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在的同時(shí)出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當(dāng)存在于至少一個(gè)等位基因上時(shí)，指示與沒(méi)有任何H2等位基因的對(duì)照對(duì)象相比，所述對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療具有較低的敏感性。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述噻吩并吡啶類藥治療是使用噻氯匹定或氯吡格雷治療。
6.一種用于鑒定對(duì)象體內(nèi)與血栓形成相關(guān)或與對(duì)噻吩并吡啶類藥治療較低的敏感性相關(guān)的P2Y12受體單元型的至少一種多態(tài)性的體外方法，該方法包括分析生物學(xué)樣品的基因組DNA，以對(duì)P2Y12受體基因的至少一個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析，所述區(qū)域位于內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號(hào)位置，和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置周圍；其中，T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在的同時(shí)出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當(dāng)存在于至少一個(gè)等位基因上時(shí)，指示與對(duì)照對(duì)象相比，具有患血栓形成的較高危險(xiǎn)或?qū)︵绶圆⑦拎ゎ愃幹委熅哂休^低敏感性。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述分析是在從所述生物學(xué)樣品中提取的基因組DNA上進(jìn)行的。
8.如權(quán)利要求6或7中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述分析包括擴(kuò)增所述基因組DNA的所述區(qū)域的步驟。
9.如權(quán)利要求6-8中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述P2Y12受體的多態(tài)性是通過(guò)測(cè)序鑒定的。
10.一種編碼P2Y12受體的分離的核酸，所述核酸包括P2Y12基因序列，該序列中同時(shí)出現(xiàn)T在所述內(nèi)含子的139號(hào)位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號(hào)位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號(hào)位置上的插入，和T在外顯子2的52號(hào)位置上的存在。
11.一種適用于如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法的試劑盒，該試劑盒包括特異用于擴(kuò)增包括內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744和801號(hào)位置和/或外顯子2(SEQ ID No 2)的52號(hào)位置中的至少一個(gè)的P2Y12基因之全部或部分的核苷酸引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定在對(duì)象體內(nèi)出現(xiàn)血栓形成的危險(xiǎn)的體外方法，并且涉及一種用于測(cè)定對(duì)象對(duì)噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的體外方法。這兩種方法都涉及鑒定P2Y
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1705754SQ200380101367
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2003年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月15日
發(fā)明者M·艾阿馳, P·高瑟姆, P·方塔納, S·甘德利勒, A·杜邦, J－L·倫尼 申請(qǐng)人:國(guó)家健康醫(yī)學(xué)研究所, 公共救濟(jì)事業(yè)局-巴黎醫(yī)院, 雷內(nèi)笛卡爾巴黎第五大學(xué)