專利名稱：：一種哺乳動(dòng)物通用的免疫避孕靶標(biāo)及其特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物通用的免疫避孕靶標(biāo)及其特異性抗體。我國作為發(fā)展中的人口大國，人口數(shù)量和質(zhì)量的控制等生殖健康是關(guān)系國計(jì)民生的大事。在過去的幾十年中，還沒有出現(xiàn)可與女性口服避孕藥相比的男用藥品。盡管女用避孕藥減緩了人口的增長，但其副作用及遠(yuǎn)期安全性還有待改進(jìn)。許多婦女不愿采用荷爾蒙藥物，生殖道內(nèi)置器械和埋植物，因此在方法可能的條件下，男性將為減緩人口增長承擔(dān)更多的責(zé)任和風(fēng)險(xiǎn)。近年以來，盡管在男性避孕方面開展了一些研究，除了傳統(tǒng)的體外排精，避孕套和結(jié)扎手術(shù)，還沒有更加通用的方法出現(xiàn)。最近通過荷爾蒙可逆地抑制男性精子生成的避孕方法被認(rèn)為可在預(yù)期(24個(gè)月)內(nèi)完全恢復(fù)精子數(shù)量，但荷爾蒙對包括心血管和前列腺等的副作用仍值得關(guān)注。|3-防御素(beta-defensin)家族是近年來發(fā)現(xiàn)的參與天然免疫和其它生理過程及疾病的具有多種生物學(xué)功能的多肽家族。作為抗菌肽，P-防御素具有與傳統(tǒng)抗生素不同的廣譜抗菌機(jī)理。防御素可以結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜，造成膜滲漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。由于細(xì)菌細(xì)胞膜的復(fù)雜性，相對傳統(tǒng)抗生物而言，細(xì)菌不容易進(jìn)化出對防御素的抗性，因而在利用防御素對付抗生素耐藥菌方面得到了大量的關(guān)注。最近有報(bào)道(http:〃technology.newscientist.com/channel/tech/dnl3924_manmade_defensin_rips_resistant_bacteria-即art.htmlfeedld=online-news_rss20)稱第一個(gè)基于防御素的人造抗生素藥物已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究。顯然，這對于解決越來越嚴(yán)重的抗生素耐藥菌和醫(yī)院感染問題是個(gè)極好的消息，也使本發(fā)明人認(rèn)識到新型天然防御素的基礎(chǔ)研究對于新型抗生素類藥物研究|3-防御素也是聯(lián)系天然免疫和適應(yīng)性免疫的樞紐，與趨化因子(chemokines)具有功能上的重疊，起到了調(diào)節(jié)天然免疫和適應(yīng)性免疫的作用。此外，P-防御素還具有多種生物學(xué)功能，包括參與腫瘤的血管生成、抗艾滋病毒、腫瘤抑制和抗白血病，以及參與精子的運(yùn)動(dòng)起始和成熟、保護(hù)、獲能和抗免疫識別等等。已有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠P-防御素-6的高表達(dá)，可引起肌肉退行性病變，這就把機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)和退行性疾病病理學(xué)研究聯(lián)系了起來；而狗P_防御素_103(CBD103)可與Mclr(melanocortinrec印tors)高親和地結(jié)合，與動(dòng)物毛色的確定有關(guān)。特別是，已有研究證實(shí)，人P-防御素-l(HBDl)的低表達(dá)則與口腔鱗狀細(xì)胞癌、腎癌和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程有關(guān)。同時(shí)，令人感興趣的是，附睪組織中有豐富的P-防御素，而臨床上也極少發(fā)現(xiàn)附睪原發(fā)性的腺癌發(fā)生，而且轉(zhuǎn)移到附睪的癌也極為罕見，提示其不僅具有抗菌作用，也可能有抗惡性腫瘤作用。在大鼠、小鼠、犬、大猩猩和人類，迄今分別發(fā)現(xiàn)了43、52、43、37和39個(gè)P_防御素基因，其中絕大多數(shù)都是功能未知的基因。幾乎所有的P_防御素都優(yōu)先在雄性生殖系統(tǒng)表達(dá)，尤其是在睪丸和附睪組織中表達(dá)，只有較少數(shù)量的P-防御素在其它部位表達(dá)。附
背景技術(shù)：
：意義重大。睪組織中包含了幾乎所有的P-防御素家族成員，并呈現(xiàn)多樣化的e-防御素區(qū)段特異的表達(dá)模式，且大鼠和小鼠的13-防御素家族附睪表達(dá)模式具有一定的保守性。由于附睪是雄性生殖系統(tǒng)一個(gè)重要的附屬性器官，它與精子成熟、儲存和保護(hù)等有密切的關(guān)系，本發(fā)明人早先根據(jù)e-防御素在體內(nèi)的表達(dá)特征，可以將P-防御素分為三類即雄性生殖系統(tǒng)特異表達(dá)的P-防御素、附睪特異表達(dá)的e-防御素和非特異廣泛表達(dá)的P-防御素。Binlb(又被稱作spagll)基因是本發(fā)明人在大鼠附睪中克隆到的一個(gè)附睪特異表達(dá)的天然抗菌肽(LiP，C.H.，HeB，SoSC，ChungYW，ShangQ，ZhangYD，ZhangYL.，Anantimicrobialpeptidegenefoundinthemaler印roductivesystemofrats.Science,2001.291(5509):p.1783-5.)，論文發(fā)表在Science雜志上并獲得了專利(中國專利ZL01105283.X，美國專利US6，887，981，B2)。后來的研究又發(fā)現(xiàn)Binb除具有抗菌肽的功能以外，還與起始精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)，論文發(fā)表在NatureCellBiology(ZhouCX，ZhangYL，XiaoLetal.，An印ididymis—specificbeta—defensinisimportantfortheinitiationofspermmaturation.NatCellBiol.，2004.6(5):p.458—64.)，其能與附睪頭部的精子結(jié)合，通過L-型鈣通道啟動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)，抑制binb表達(dá)可以使精子失去起始運(yùn)動(dòng)的能力，因而binb可以作為潛在的抗生殖道感染和男性避孕的靶標(biāo)。因此，本領(lǐng)域還有必要基于此進(jìn)行進(jìn)一步的研究以期開發(fā)出有應(yīng)用價(jià)值的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種哺乳動(dòng)物通用的免疫避孕靶標(biāo)及其特異性抗體。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的多肽具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列；并且，所述的多肽來源于哺乳動(dòng)物Binlb(或稱為SPAG11)蛋白，且由7_30個(gè)(較佳地7-20個(gè)；更佳地7-15個(gè))氨基酸組成。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供所述的多肽的用途，用于制備特異性結(jié)合Binlb蛋白的抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體)。在本發(fā)明的第三方面，提供一種特異性結(jié)合Binlb蛋白的抗體，所述的抗體特異性識別Binlb蛋白上具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的位點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體由保藏號為CCTCC-C200847(rBinlblOA5，簡稱10A5)的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的抗體的用途，用于制備抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是避孕藥。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物選自(但不限于)人、鼠、狗、貓、牛、豬、蝙蝠、猴、樹駒、馬、大象、松鼠、豚鼠、犰狳。在本發(fā)明的第五方面，提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的組合物，所述的組合物包括(1)有效量的所述的抗體；禾口(2)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的第六方面，提供一種雜交瘤細(xì)胞株，所述的雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC-C200847。在本發(fā)明的第七方面，提供一種所述的抗體的用途，用于制備定性或定量檢測樣品中Binlb蛋白存在情況的試劑。在本發(fā)明的第八方面，提供一種非治療目的地抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)(如非治療目的的避孕)的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的所述的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的給予為外用涂抹。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1.免疫后的11只小鼠的抗體滴度水平用間接ELISA檢測?？v坐標(biāo)為滴度，橫坐標(biāo)為免疫小鼠的編號。只有一只小鼠(9號)到達(dá)較高滴度水平，用來進(jìn)行細(xì)胞融合。圖2.用WesternBlot(左圖)和DotBlot(右圖)進(jìn)行單克隆抗體的特異性檢驗(yàn)。所用抗原為重組表達(dá)的雙拷貝串聯(lián)蛋白rBD14、rBD15、rBD42、rBD1、mBD15、mBD30;rBD14單和rBD15單分別為rBD14、rBD15的單體活性重組多肽。每泳道上樣量在2ng的蛋白水平，進(jìn)行Westernblot(2ng/孔)，ECL顯色。把蛋白量提高到1Pg，進(jìn)行Dotblot(liig/dot)試驗(yàn)，單克隆抗體特異的識別rBinlb。所用單抗為10B4，一抗1:5000稀釋，二抗山羊抗鼠IgG-HRP1:1000稀釋。圖3.單抗10B4為例，Westernblot結(jié)果表明單抗特異識別附睪頭部精子上的rBinlb，而不識別精子上其它蛋白。rC即Sperm，rCorSperm，rCauSperm分別為等量的附睪頭部、體部和尾部精子蛋白。圖4.附睪頭部、體部和尾部精子免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明單抗比多抗血清更特異地識別附睪頭部精子上的rbinlb。單克隆抗體10B4只與附睪頭部的精子rBinlb有反應(yīng)，而不與體部和尾部的精子蛋白反應(yīng)，與rBinlb在附睪頭部特異表達(dá)是一致的。圖5.粗篩抗原表位融合蛋白的重組表達(dá)和多抗血清的Westernblot鑒定。小鼠多抗血清與粗篩抗原表位Segl-Seg6表達(dá)菌裂解物進(jìn)行westernblot，ECL顯色。多抗血清與seg2、3、4、5片段有免疫反應(yīng)，表明抗原表位集中在這幾個(gè)片段內(nèi)。C為載體對照，pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，po為誘導(dǎo)后的菌液。圖6.四個(gè)單克隆抗體(3A1(圖C)、10A5(圖A)、10B4(圖B)、14F6(圖D))與粗篩表位序列1-6進(jìn)行westernblot，ECL顯色。四個(gè)單克隆抗體(3A1，10A5，10B4，14F6)分別識別表位肽seg4&5、5、3、4&5。pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，po為誘導(dǎo)后的菌液。pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，po為誘導(dǎo)后的菌液，Control為載體對照。圖7.單克隆抗體10A5識別精細(xì)8肽表位的WesternBlot結(jié)果及8肽表位序列比對表明單克隆抗體10A5識別多肽表位DPWNRCC和SDPWNRCC，pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，po為誘導(dǎo)后的菌液，C為空白載體對照。圖8.單克隆抗體3A1識別精細(xì)8肽表位的WesternBlot結(jié)果及8肽表位序列比對，結(jié)果3A1可識別SDPWNRCC和DPWNRCCV。pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，po為誘導(dǎo)后的菌液。圖9.單克抗體10B4識別精細(xì)8肽表位的WesternBlot結(jié)果及8肽表位序列比對，表明單克隆抗體10B4識別表位序列RSGERKGD;pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，post為誘導(dǎo)后的菌液。圖10.哺乳動(dòng)物的spagll基因編碼的多肽成熟肽的序列比對?？驁D表示單抗識別的共有多肽序列。左列為各哺乳類動(dòng)物的縮寫。Hum為人類、Mou為小鼠、Rat為大鼠、Dog為狗、Cat為貓、Bul1為牛、Pig為豬、Bat為蝙蝠、Mac為猴、Shr為樹駒、Equ為馬、Ele為大象、Sqr為松鼠、GuiP為豚鼠、Arm為犰狳。單抗10A5和單抗3A1識別的表位序列SDPWNRCC在哺乳動(dòng)物的spagll基因編碼的多肽(包括人類)中保守地存在。單抗10B4識別的表位序列只在大鼠和小鼠spagll基因編碼的多肽中保守地存在。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛地研究，首次定位到了Binlb蛋白序列上一特定的抗原性表位，所述的抗原性表位在哺乳動(dòng)物Binlb蛋白中保守地存在。因此，利用含有該表位的多肽(本發(fā)明中還稱為短肽)，可以制備出特異性抗Binlb蛋白的抗體，該抗體可識別多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)的Binlb蛋白。并且，本發(fā)明人還篩選到了特異性結(jié)合該特定的抗原表位的單克隆抗體，所述的抗體結(jié)合特異性好，與其它蛋白沒有交叉反應(yīng)，可非常顯著地抑制哺乳動(dòng)物的精子活動(dòng)，是一種哺乳動(dòng)物通用型的抗Binlb蛋白抗體。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"SPAGll"蛋白、"Binlb"蛋白可互換使用，均是指存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的、具有抗菌功能的一種蛋白，所述的蛋白與中國專利ZL01105283.X中所述的Binlb蛋白序列具有60%以上的同源性，較佳地具有70%以上的同源性，更佳地具有80%以上(如85%或90%或95%)的同源性。根據(jù)所提供的蛋白，可以方便地得知蛋白對于的基因序列。如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，抗體的"特異性"是指抗體能結(jié)合于哺乳動(dòng)物Binlb蛋白或片段。特別指那些能與哺乳動(dòng)物Binlb蛋白結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中，所述的"哺乳動(dòng)物"是任何具有Binlb蛋白(或稱為SPAG11蛋白)，且其Binlb蛋白中具有SEQIDN0:1或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的哺乳動(dòng)物。例如，所述的哺乳動(dòng)物選自(但不限于)人、鼠、狗、貓、牛、豬、蝙蝠、猴、樹駒、馬、大象、松鼠、豚鼠、犰狳?？乖砦灰阎狟inlb蛋白能與附睪頭部的精子結(jié)合，通過L-型鈣通道啟動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)，用抗體或RNAi等手段抑制Binlb表達(dá)可以使精子失去起始運(yùn)動(dòng)的能力(Zhou，C.X.等，An印ididymis—specificbeta—defensinisimportantfortheinitiationofspermmaturation.NatCellBiol，2004.6(5):p.458-64.)，因而Binlb可以作為抗生殖道感染和男性避孕的靶標(biāo)。Binlb的表達(dá)是附睪特異的，有別于其它P-防御素?；谝陨险撌觯梢岳煤线m的抗Binlb抗體來與Binlb蛋白結(jié)合，抑制其與精子的結(jié)合，從而達(dá)到抑制精子運(yùn)動(dòng)的目的?！N抗原通常含有多個(gè)抗原表位(抗原決定簇)，因此，針對同一個(gè)抗原可以獲得不止一個(gè)抗體，這些抗體對抗原的結(jié)合特性(如特異性等)均可能是不同的。針對同一個(gè)抗原，本領(lǐng)域人員需要進(jìn)行大量的反復(fù)比較、篩選和鑒定，才能找到適合于特異性結(jié)合的單抗。而找到抗原上合適的抗原表位，針對性地制備抗體，則可大大簡化該過程。此外，在基于一些抗原蛋白制備抗體的過程中，由于全長蛋白一般序列較長，制備特異性抗體的效率并不高，獲得的抗體經(jīng)常存在結(jié)合能力差、結(jié)合位點(diǎn)不確定等問題。因此需要針對一些抗原蛋白找到其特異性的抗原表位(抗原決定簇)，以含有該抗原表位的短肽來制備特異性抗體，以獲得結(jié)合能力良好，且結(jié)合位點(diǎn)確定的抗體。本發(fā)明通過制備特異性抗Binlb蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，并利用抗原表位掃描方法，進(jìn)行抗原表位掃描分析，確認(rèn)了各個(gè)單抗識別的抗原表位。從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抗原表位序列是哺乳動(dòng)物SPAGll(Binlb)的共有多肽序列，可以作為哺乳動(dòng)通用的免疫避孕靶標(biāo)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，所述的多肽具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2所示的氨基酸序列；并且，所述的多肽來源于Binlb蛋白，且由7-30個(gè)氨基酸組成；較佳地由7-20個(gè)氨基酸組成；更佳地由7-15個(gè)(如10個(gè))氨基酸組成?！┇@得了所述多肽的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該多肽。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，對比本發(fā)明的短肽而言，優(yōu)選的是采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關(guān)序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的多肽。本發(fā)明還提供了所述的多肽的用途，其作為Binlb蛋白的一種有效的抗原性的片段，用于制備特異性結(jié)合Binlb蛋白的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。所述的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的本發(fā)明的多肽可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Ha騰rling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用本發(fā)明的多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。抗體基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合Binlb蛋白的抗體，所述的抗體特異性識別Binlb蛋白上具有SEQIDNO:1(即DPWNRCC)，或SEQIDN0:2(即SDPWNRCC)所示的氨基酸序列的位點(diǎn)。所述的抗體是一種哺乳動(dòng)物通用型的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段，抗體重鏈，抗體輕鏈，遺傳工程改造的單鏈Fv分子，或嵌合抗體(如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體)。7本發(fā)明中的抗體可用于通過與Binlb蛋白相結(jié)合而抑制Binlb蛋白與哺乳動(dòng)物精子的相互作用，抑制精子運(yùn)動(dòng)，從而可達(dá)到哺乳動(dòng)物避孕的效果。本發(fā)明的抗體還可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的Binlb蛋白存在情況或存在的量。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的抗體是一種單克隆抗體，其是由保藏號為CCTCC-C200847的雜交瘤細(xì)胞株rBinlblOA5(也可稱為10A5)產(chǎn)生的。該單克隆抗體結(jié)合能力強(qiáng)，與其它蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)，對于精子活動(dòng)的抑制效果非常好?！N雜交瘤細(xì)胞株，所述的雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC-C200847，所述的雜交瘤細(xì)胞株可用于生長本發(fā)明的單克隆抗體。在獲得了所述的雜交瘤細(xì)胞后，可以利用該雜交瘤細(xì)胞大量地生產(chǎn)單克隆抗體，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制備，所述方法包括步驟[oose](1)提供佐劑預(yù)處理的動(dòng)物(如小鼠)；(2)在動(dòng)物腹腔內(nèi)接種所述的雜交瘤細(xì)胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。從腹水中分離單克隆抗體也是已知的。作為一種方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是收集腹水，用經(jīng)硫酸銨、辛酸沉淀，接著用ProteinG預(yù)裝層析柱純化，獲得高純度的單克隆抗體。此外，也可按照常規(guī)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)擴(kuò)增所述的雜交瘤細(xì)胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了所述的抗體的用途，用于制備檢測樣品中是否存在Binlb蛋白。在獲得了本發(fā)明的抗體后，本領(lǐng)域人員可通過多種途徑來靈敏地檢測樣品中Binlb蛋白的存在與否以及存在濃度，采用的技術(shù)可以是免疫學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)。組合物本發(fā)明還提供了一種抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的組合物，它含有有效量(如0.0001wt%-50wt%;更佳的0.001wt%-30wt%)的上述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。"有效量"或"有效劑量"是指可對人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如泰性、剌激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中或凝膠介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)局部給藥、靜脈內(nèi)、或腹膜內(nèi)。優(yōu)選的，所述的單克隆抗體被用于局部給藥，如附睪內(nèi)給藥，或局部用于雄性哺乳動(dòng)物生殖器部位，或用于雌性哺乳動(dòng)物生殖道部位，以及其它精子儲藏或精子活動(dòng)的部位。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成液體劑型，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備；考慮外用的目的，優(yōu)選的劑型是凝膠劑、搽劑、膏劑、栓劑等。藥物組合物如溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約l微克-約5毫克。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明還提供了一種抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的本發(fā)明所述的抗體，優(yōu)選的是給予由保藏號為CCTCC-C200847的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。所述的方法盡管是直接用于哺乳動(dòng)物的，但其使用目的是抑制精子的運(yùn)動(dòng)以達(dá)到避孕的效果，屬于非治療性的目的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明人首次定位了Binlb蛋白序列上特定的抗原性表位，所述的抗原性表位在哺乳動(dòng)物Binlb蛋白中保守地存在，從而可基于此抗原性表位來制備特異性結(jié)合Binlb蛋白的哺乳動(dòng)物通用型抗體。(2)本發(fā)明人還篩選到了特異性結(jié)合本發(fā)明所述的抗原表位的單克隆抗體，所述的抗體結(jié)合特異性好，與其它蛋白沒有交叉反應(yīng)。(3)本發(fā)明以Binlb蛋白作為避孕的靶標(biāo)，該蛋白在附睪中特異性表達(dá)，而附睪作為精子成熟和貯藏的器官，僅影響精子的活動(dòng)能力，不影響精子的生成，因此把附睪作為研究避孕和不育的靶器官具有明顯的優(yōu)勢。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1.單克隆抗體的制備材料克隆載體pGEM-TEasy載體購自Promega公司，原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)購自Novagen公司。DH5a和宿主菌E.coliBL21codonplus(RP)菌為常規(guī)菌株。Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM購自GibcoBRL公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶和T4DNA連接酶購自MBI公司。小量質(zhì)粒制備試劑盒、匪V逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制劑、X-gal均購自Promega公司。Nde1、BglII、BamHI和Sail等限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。PCR產(chǎn)物切膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。HisTr即kitNi親和柱購自美國安瑪西亞公司。IPTG購自MERCK公司。His-tagmAb購自北京天為時(shí)代公司。HRP和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自上海普飛公司。Westernblot的ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Amersham公司。PVDF膜購自MILLIP0RE公司。福氏完全、不完全佐劑、PEG4000、小鼠Ig亞型鑒定試劑盒均購自Sigma公司。HAT、HT、EMEM等培液購自Invitrogen。BALB/c近交系小鼠(6周齡，雌性)，購自中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。方法1、大鼠Binlb雙拷貝串連蛋白的表達(dá)及純化以大鼠Binlb全長cDNA克隆質(zhì)粒(rBinlb-pGEM-T，pGEM-T購自Promega公司，制備方法見文獻(xiàn)LiP，C.H.，HeB，SoSC，ChungYW，ShangQ，ZhangYD，ZhangYL.，Anantimicrobialpeptidegenefoundinthemaler印roductivesystemofrats.Science,2001.291(5509):p.1783-5)為模板，分別用4個(gè)大鼠Binlb基因特異性引物擴(kuò)增出兩個(gè)rBinlb的片段。片段l由以下引物擴(kuò)增PI:5，-CATATG(NdeI)GGAATCAGAAACACC-3'(SEQIDNO:61);P2:5，—AGATCT(BglII)TCTGTTTTTAATGGA-3，(SEQIDNO:62)。片段2由以下引物擴(kuò)增P3:5，-AGATCT(BamHI)GGAATCAGAAACACC—3'(SEQIDNO:63);P4:5，-GTCGAC(salI)CTATCTGTTTTTAATGGA-3，(SEQIDNO:64)。將片段1和2分別連入pGEM-TEasy載體的相關(guān)酶切位點(diǎn)，利用BglII，BamHI為同尾酶的特點(diǎn)，將兩個(gè)片段串聯(lián)起來。用Ndel和Sail將串聯(lián)片段切割回收，連入pET28a(參考Xiao，L.Q.等，ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)，2004.36(8):p.571-6)。將pET28a-串聯(lián)rbinlb轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21codonplus(RP)。從平板挑單克隆于3mlLB37。C培養(yǎng)過夜，接種500毫升LB，培養(yǎng)至0D600nm為0.6左右，加入IPTG至lmM，37。C誘導(dǎo)6小時(shí)，收菌。包涵體純化以lml/mg菌體的比例加入裂解緩沖液(50mMTris-HC1PH8.0，25%蔗糖w/v，lmMEDTA)，超聲破菌，加入脫氧膽酸鈉至終濃度2%(w/v)，室溫?cái)嚢?小時(shí)?；旌衔?5000g離心15分鐘，取沉淀。洗滌液(1%TritonX-lOO(V/V)，lmMEDTA，1M尿素)洗滌4次，每次均充分混勻10000g離心10分鐘。經(jīng)洗滌的包涵體用2X上樣緩沖液(4%SDS，125iiMTris-HCl，PH6.8)溶解。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，切下目的條帶，電洗脫(Bio-Radelectro-eluterModel422)。回收的rBinlb蛋白通過和標(biāo)準(zhǔn)BSA比較進(jìn)行定量。2、雜交瘤細(xì)胞的建立用0.5mL前述純化的rBinlb蛋白(0.8mg/ml)與等量福氏完全佐劑混合并完全乳化后，經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.2mL/只)。加強(qiáng)免疫時(shí)，用福氏不完全佐劑充分乳化抗原，注射劑量和部位同前，共免疫4次，每次間隔2周。最后1次直接用抗原溶液進(jìn)行免疫。末次免疫后3天，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用間接ELISA法篩選mcAb分泌陽性的雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)34次有限稀釋法克隆化后，選擇mcAb分泌持續(xù)陽性的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并按常規(guī)制備腹水。3、mcAb的特性鑒定(1)效價(jià)測定采用間接ELISA法。用rBinlb(lmg/L)包酶標(biāo)板。一抗為適當(dāng)稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水樣本，二抗為1:3000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，經(jīng)TMB底物顯色后，于波長450nm測定0D值。(2)Ig亞類(型)的鑒定間接ELISA法。用純化的rBinlb包被酶標(biāo)板，4。C過夜。其余操作詳見Sigma公司單抗亞類鑒定試劑盒操作手冊。參照試劑盒中的說明書進(jìn)行。(3)特異性鑒定采用Westernblot檢測，對rBinlb誘導(dǎo)表達(dá)全菌的裂解產(chǎn)物經(jīng)15%濃度的膠SDS-PAGE電泳分離，進(jìn)行Westernblot檢測。轉(zhuǎn)印后將PVDF膜置5%的脫脂奶粉4t:封閉過夜，然后置于按1:10000封閉液稀釋的mcAb室溫輕輕搖晃作用lh，用PBST搖晃洗滌，10HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG工作濃度為1:1000，ECL顯色。4、mcAb的初步應(yīng)用(l)Westernblot檢測應(yīng)用Westernblot檢測大鼠睪丸、附睪、輸精管與精子中rBinlb蛋白的表達(dá)分別提取成年大鼠睪丸、附睪頭部、附睪體部、附睪尾部、輸精管蛋白，以及附睪頭部精子、附睪體部精子和附睪尾部精子蛋白。蛋白定量后，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot分析。重組表達(dá)的雙拷貝串聯(lián)蛋白(抗原)rBD14、rBD15、rBD42、rBDl、mBD15、mBD30的GenBank登錄號分別為AY621346、AY621347、AY621369、NM_031810、NM_139222、DQ012040;雙拷貝串聯(lián)蛋白的制備方法參見文獻(xiàn)XiaoLQ，LiuAH，ZhangYL.Aneffectivemethodforraisingantiseraagainstbeta—defensins:double_copyproteinexpressionofmBinlbinE.coli.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2004;36(8):571—576.的方f去)。rBD14單和rBD15單(抗原)分別為rBD14、rBD15的單體活性重組多肽，制備方法參見DiaoH，GuoC，LinD，ZhangY.Intein-mediatedexpressionisaneffectiveapproachinthestudyofbeta_defensins.BiochemBiophysResComm皿2007;357(4):840-846。rCapSperm，rCorSperm，rCauSperm分別為等量的附睪頭部、體部和尾部精子蛋白(分別將附睪頭部、體部和尾部精子與2XSDSPAGE電泳上樣緩沖液混勻，共同沸水浴5-10分鐘，冷卻至室溫即可)。(2)免疫組化染色法解剖大鼠取附睪，依次經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片及脫蠟后，3%11202孵育10min，再于微波爐中煮沸10min。加10%羊血清PBS封閉60min，用PBS洗3次。滴加1:1000的抗rBinlb抗體(以免疫前小鼠的血清為陰性對照)，于4t:孵育過夜，PBS洗3次，再滴加l:200的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(37t:孵育lh，漂洗3次)，滴加DAB顯色10min后，再以蘇木素復(fù)染lmin。經(jīng)脫水、透明及封片后，鏡下觀察結(jié)果并照像。結(jié)果1、雜交瘤細(xì)胞株的建立按上述方法免疫BALB/c小鼠后，用間接ELISA法進(jìn)行滴度檢測，只有一只動(dòng)物達(dá)到〉160000滴度水平，見圖1。挑選滴度最高的第9號鼠進(jìn)行雜交瘤制備。細(xì)胞融合后，從挑選的387個(gè)單克隆雜交瘤細(xì)胞株中，第一輪初篩選出可能的32個(gè)陽性克隆細(xì)胞株，從中選出10株抗體效價(jià)高的陽性細(xì)胞單克隆，用有限稀釋法再進(jìn)行第2次和第3次克隆，最終得到4株抗體效價(jià)高、能穩(wěn)定分泌抗rBinlb單抗(rBinlbmcAb)的雜交瘤細(xì)胞株(3A1，10A5，10B4和14F6)，將其放入液氮中凍存6個(gè)月，復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌rBinlbmcAb。2、mcAb的特性鑒定(1)效價(jià)測定雜交瘤細(xì)胞3Al，10A5，10B4和14F6培養(yǎng)上清中mcAb的ELISA效價(jià)分別為l:32，1:64，1:64，1:128;腹水mcAb的效價(jià)分別為l:1X105，2X105，2X105，5X105。(2)Ig亞類(型)鑒定11采用Sigma公司單抗亞類鑒定試劑盒對3A1，10A5，10B4和14F6細(xì)胞株分泌的抗體的Ig亞類(型)進(jìn)行鑒定的結(jié)果表明，它們的亞型分別為IgGl，IgGl，IgGl，IgG2a。(3)特異性鑒定經(jīng)Westernblot檢測，4株細(xì)胞分泌抗體只與重組表達(dá)的rBinlb起反應(yīng)，與大腸桿菌中的其它蛋白無交叉反應(yīng)，與P-防御素家族的其它成員也無交叉反應(yīng)，見圖2;與精子上其它蛋白和附睪其它部位的精子蛋白無交叉反應(yīng)，見圖3。[Cm5]3、mcAb的初步應(yīng)用Westernblot檢測結(jié)果在成年大鼠的睪丸、附睪頭部、附睪體部、附睪尾部、輸精管以及附睪頭部精子、附睪體部精子和附睪尾部精子蛋白中，僅在附睪頭部組織抽提蛋白和附睪頭部精子抽提蛋白中檢測到rBinlb的表達(dá)，其他部位均檢測不到陽性信號。免疫組化結(jié)果rBinlb在成年大鼠附睪中表達(dá)與定位在成年大鼠附睪中僅在附睪頭部靠近附睪體部的部位有rBinlb蛋白的表達(dá)，并且大部分陽性信號集中在該部位的附睪管腔內(nèi)。在Westernblot和精子免疫熒光化學(xué)水平，抗rBinlb單抗特異識別附睪頭部精子上的rBinlb而不識別其它蛋白，見圖4。實(shí)施例2.單抗的抗原表位掃描實(shí)驗(yàn)材料載體pSY621-GST(徐萬祥等，截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒及其制備方法，專利申請?zhí)?00710173305.2)。宿主菌E.coliBL21。DNA片段合成上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。方法1、抗原片段合成粗掃描將rbinlb多肽拆分成有79個(gè)氨基酸重疊的16肽(seglseg6)，如下seglDIPPGIRNTVCFMQRGseg2NTVCFMQRGHCRLFMCRSeg3HCRLFMCRSGERKGDIseg4SGERKGDICSDPWNRCseg5CSDPWNRCCVSSSIKNVSSSIKNRseg6基于將上述肽段合成相應(yīng)的編碼DNA片段，并在5'和3'端分別加上BamHI和Sail酶切位點(diǎn)序列，如表1所示。其中，rBinlb蛋白的16肽抗原表位Seg16正負(fù)鏈及其合成的DNA編碼序列，用于16肽表位粗篩；s表示正義鏈，r表示反義鏈。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>精細(xì)表位掃描將16肽按1個(gè)氨基酸的位移拆分成不同的8肽片段，合成相應(yīng)的DNA片段，在5'和3'端分別加上BamHI和Sail酶切位點(diǎn)序列，見表2，其中s表示正義鏈，r表示反義鏈。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序列SEQIDNO:Seg3-3r5'-tcg3cttectcccc3g朋cggc3C3tg朋g3gg-3'20Seg3-4s5'-gatccttcatgtgccgttctggggagcgctaag-3'21Seg3-4r5'-tcgacttagcgctccccagaacggcacatgaag-3'22Seg3-5s5'-gatccatgtgccgttctggggagcgcaagtaag-3'23Seg3-5r5'-tcgacttacttgcgctccccagaacggcacatg-3'24Seg3-6s5，-gatcctgccgttctggggagcgcaaggggtaag-3，25Seg3-6r5'_tcgacttaccccttgcgctccccagaacggcag_3'26Seg3-7s5，-gatcccgttctggggagcgcaagggggattaag-3，27Seg3-7r5'_tcgacttaatcccccttgcgctccccagaacgg_3'28Seg4-ls5，-gatccggggagcgcaagggggatatttgctaag-3，29Seg4-lr5'_tcgacttagcaaatatcccccttgcgctccccg_3，30Seg4-2s5'-gatccgagcgcaagggggatatttgctcttaag-3'31Seg4-2r5'-tcgacttaagagcaaatatcccccttgcgctcg-3'32Seg4-3s5'-g3tcccgc朋ggggg3tetttgctctg3ct朋g-3'33Seg4-3r5'-tcgacttagtcagagcaaatatcccccttgcgg-3'34Seg4-4s5'-g3tcc朋ggggg3tetttgctctg3cccgt朋g-3'35Seg4-4r5'-tcgacttacgggtcagagcaaatatcccccttg-3'36Seg4-5s5'-gatccggggatatttgctctgacecgtggtaag-3'37Seg4-5r5'_tcgacttaccacgggtcagagcaaatatccccg_3'3814<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和重組蛋白表達(dá)DNA退火合成的DNA單鏈用無菌水溶解到100yM，正義鏈和反義鏈各取5yL，加入到90iiL無菌水，94t:水浴變性5分鐘，自然降溫退火。將pSY621-GST用BamHI和Sail酶切并割膠回收，與退火后的DNA片段連接(TAKARADNA連接試劑盒)。連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)菌，加入500iiLLB培養(yǎng)基37。C振搖1小時(shí)200轉(zhuǎn)/分。12000g離心2分鐘，涂含100iig/ml的氨芐西林鈉的LB平板，37。C培養(yǎng)過夜。挑選轉(zhuǎn)化子接入3ml含100iig/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)液，3(TC培養(yǎng)過夜。取100yL過夜菌接入lml含100iig/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)液，42。C培養(yǎng)5小時(shí)，收菌。取100yL菌液加入20iiL6X上樣緩沖液混勻，IO(TC沸水浴5分鐘，冷卻后取1yL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。3、WesternBlot蛋白電泳完后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，1XNET封閉37。Cl-2小時(shí)，抗體稀釋到1XNET4°C雜交過夜。PBST洗膜三次，15分鐘/次。膜與HRP-標(biāo)記的二抗37t:雜交1小時(shí)，PBST洗膜三次，ECL顯色。結(jié)果1、抗體的識別特性制備抗Binlb多抗血清，用O.5mL純化的rBinlb蛋白(0.8mg/mL)與等量福氏完全佐劑混合并完全乳化后，經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.2mL/只)。加強(qiáng)免疫時(shí)，用福氏不完全佐劑充分乳化抗原，注射劑量和部位同前，共免疫4次，每次間隔2周。最后1次直接用抗原溶液進(jìn)行免疫，常規(guī)方法從小鼠獲取抗血清。粗篩抗原表位融合蛋白的重組表達(dá)和抗Binlb多抗血清的Westernblot鑒定如圖5所示，多抗血清與seg2、3、4、5片段有免疫反應(yīng)，表明抗原表位集中在這幾個(gè)片段內(nèi)。因此，16肽表位融合蛋白與多抗血清的westernblot結(jié)果表明，其表位序列分布在seg2-seg5內(nèi)部。四個(gè)單克隆抗體(3A1、10A5、10B4、14F6)與粗篩表位序列seg1-6的Westernblot結(jié)果如圖6。由結(jié)果可見，四個(gè)單克隆抗體(3A1，10A5，10B4，14F6)分別識別表位肽seg4&5、5、3、4&5。pre為誘導(dǎo)表達(dá)前的菌液，po為誘導(dǎo)后的菌液。用seg2-seg5的相應(yīng)8肽表位融合蛋白進(jìn)行Westernblot，表明單克隆抗體10A5特異性識別多肽表位序列DPWNRCC(SEQIDNO:1)，SDPWNRCC(SEQIDNO:2)或DPWNRCCV，見圖7。單克隆抗體3A1特異性識別表位序列SDPWNRC、SDPWNRCC、DPWNRCCV、PWNRCCVS，見圖8。單克隆抗體10B4特異性識別表位序列RSGERKGD等，見圖9。用多抗血清也可以得到同樣的表位識別序列。2、表位序列的物種間分析對包括人類、小鼠大鼠在內(nèi)的哺乳動(dòng)物spagll基因的成熟肽序列比對表明，單抗10A5和單抗3A1識別的表位序列SDPWNRCC在哺乳動(dòng)物的spagll基因編碼的多肽(包括人類)中保守地存在，如圖10所示。這意味著該抗體和表位序列可以應(yīng)用到包括人類的其它哺乳動(dòng)物的spagll的鑒別和免疫避孕等方面。實(shí)施例3.單克隆抗體抑制精子運(yùn)動(dòng)起始3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠購自中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠斷頸處死后立即解剖，剝離附睪。剪取附睪組織，用(WONG，P.Y.D.(1988a).Mechanismofadrenergicstimulationofanionsecretioninculturedrat印ididymalepithelium.AmericanJournalofPhysiology254，F(xiàn)121133)的方法酶解分散細(xì)胞，接種到半透膜(HAWP，045um;Millipore，Bedford,MA，USA)，于32°C和5%二氧化碳及保濕的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基為Eagle，sminimumessentialmedium(EMEM)(購自INVITR0GEN)加5%月臺牛血清(Gibco)，lOOmM非必需氨基酸，4mM谷胺酰胺，1mm丙酮酸鈉，100i.u.ml—1青霉素，100ug.m"鏈霉素。培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿平皿底部。3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠購自中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其它化學(xué)試劑購自Sigma公司。大鼠斷頸處死后立即解剖，剝離附睪。剪取附睪起始部(initialsegment)組織，輕輕剪碎，放入0.4ml預(yù)熱到37。C的精子培養(yǎng)液(123mMNaCl，4mMKCl，2mMCaCl2，0.4mMMgS04，0.3mMNa2HP04，25mMNaHC03，5mM葡萄糖，12.5mM乳酸鈉和0.5mM丙酮酸鈉，8iig酚紅，4mgm"牛血清白蛋白;pH7.4，滲量(osmolarity)310m0smkg—"，培養(yǎng)5分鐘，游離出未成熟精子。調(diào)節(jié)精子濃度至6.0X107ml。取上述長滿附睪細(xì)胞的培養(yǎng)皿，于精子和附睪上皮細(xì)胞的共孵育前2小時(shí)，棄去上清，加入150iiL新鮮培養(yǎng)基。作為對照，在培養(yǎng)皿中加入10iiL無關(guān)抗體如抗6XHistag單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)組加入lOiiL抗rBinlb的單克隆抗體10A5。精子和附睪上皮細(xì)胞的共孵育時(shí)，加入3iiL6.0X107/mL的上述精子。于37°C，5%C02和飽和濕度條件下共孵育4小時(shí)，倒置相差顯微鏡(Olympus)40倍物鏡，10倍目鏡觀察。在顯微鏡視野下可見對照組精子獲得運(yùn)動(dòng)能力，精子運(yùn)動(dòng)明顯；而實(shí)驗(yàn)組精子不運(yùn)動(dòng)。生物材料保藏本發(fā)明制備的雜交瘤細(xì)胞rBinlblOA5保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢)，保藏號為CCTCCNO:C200847;保藏日為2008年9月17日。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表〈110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所〈120〉一種哺乳動(dòng)物通用的免疫避孕靶標(biāo)及其特異性抗體〈130>086123〈160>64〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>7〈212>PRT〈213〉多肽〈400〉1AspProTrpAsnArgCysCys15〈210>2〈211>8〈212>PRT〈213〉多肽〈400>2SerAspProTrpAsnArgCysCys15〈210>3〈211>57〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400>3gatccgacattccacctggaatccgcaacaccgtgtgcttcatgcagcggggctaag57〈210>4〈211>57〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400〉4tcgacttagccccgctgcatgaagcacacggtgttgcggattccaggtggaatgtcg57〈210>5〈211>60〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>5gatccaacaccgtgtgcttcatgcagcggggccactgtcgcctcttcatgtgccgttaag60<210>6〈211>60〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>6tcgacttaacggcacatgaagaggcgacagtggccccgctgcatgaagcacacggtgttg6018〈210>7〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>7gatcccactgtcgcctcttcatgtgccgtt〈210>8〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>8tcgacttaaatatcccccttgcgctcccca〈210>9〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>9gatcctctggggagcgcaagggggatattt〈210>10〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>10tcgacttagcagcggttccacgggtc卿g〈210>11〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>11gatcctgctctgacccgtggaaccgctgct〈210>12〈211>57〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>12tcgacttagtttttaatggaactggatecg〈210>13〈211>33〈212>DNActggggagcgc^gggggatattteag5了g^cggcacatg33g3ggcgacagtgg57gctctgacccgtggaaccgctgctaag57caaatatcccccttgcgctccccagag57gcgtatccagttccattaaaaactaag57cagcagcggttccacgggtc3gagcag5719〈213〉寡核苷酸〈400>13gatccgtatccagttccattaaaaaccgctaag〈210>14〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉14tcgacttagcggtttttaatggaactggatacg33〈210>15〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>15gatcctgtcgcctcttcatgtgccgttcttaag33〈210>16〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>16tcgactt朋g朋cggc3catg朋gaggcg3cag33〈210>17〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>17gatcccgcctcttcatgtgccgttctgggtaag33〈210>18〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>18tcgacttacccagaacggcacatgaagaggegg33〈210>19〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉19gatccctcttcatgtgccgttctggggagtaag33<210>20〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>20tcgacttactccccag朋cggcac3tg朋gagg33〈210>21〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>21gatccttcatgtgccgttctggggagcgctaag33〈210>22<211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>22tcgacttegcgctccccagaacggcacatgaag33〈210>23〈211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>23gatccatgtgccgttctggggagcgcaagtaag33〈210>24〈211>33<212>廳〈213>寡核苷酸〈400>24tcgacttacttgcgctccccagaacggcacatg33〈210>25〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>25gatcctgccgttctggggagcgcaaggggtaag33〈210>26〈211>33〈212>DNA21〈213〉寡核苷酸〈400>26tcgacttaccccttgcgctccccagaacggcag〈210>27〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>27gatcccgttctggggagcgcaagggggattaag33〈210>28〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>28tcgactteatcccccttgcgctccccagaaegg33〈210>29〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>29gatceggggagcgcaagggggatatttgetaag33〈210>30〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>30tcgacttagcaaatatcccccttgcgctccccg33〈210>31〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>31gatccgagcgcaagggggatatttgetettaag33〈210>32〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>32tcgacttaagagcaaatatcccccttgcgctcg33〈210>33〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸〈400>33gatcccgcaagggggatatttgctctgact〈210>34〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400〉34tcgacttagtC3g3gca朋tatcccccttg〈210>35〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>35gatccaagggggatatttgctctgacccgt〈210>36〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>36tcgacttacgggtcagagcaaatatccccc〈210>37〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>37gatccggggatatttgctctgacccgtggt<210>38<211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>38tcgacttaccacgggtcagagcaaatatcc〈210>39〈211>33〈212>DNAaag33egg33aag33ttg33肌g33ccg33〈213〉寡核苷酸〈400>39gatccgatatttgctctgacccgtggaact朋g33〈210>40<211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>40tcgacttagttccacgggtcagagc^atetcg33〈210>41<211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>41gatccatttgctctgacccgtggaaccgct33〈210>42〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉42tcgacttagcggttccacgggtcagagc^Eltg33〈210>43〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400〉43gatcctgctctgacccgtggaaccgctgct33〈210>44〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>44tcgacttagcagcggttccacgggtc卿gCElg33〈210>45〈210>46〈211>33〈212〉DNA〈213〉寡核苷酸〈400>46tcgacttagcagcagcggttccacgggtca〈210>47〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸<400>47gatccgacccgtggaaccgctgctgcgtat〈210>48〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸<400>48tcgacttatacgcagcagcggttccacggg〈210>49〈211〉33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>49gatccccgtggaaccgctgctgcgtatcct〈210>50〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>50tcgacttaggatecgcagcagcggttccac〈210>51〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400>51gatcctggaaccgctgctgcgtatccagtt〈210〉52〈211>33〈212>DNAgag33aag33tcg33朋g33ggg313朋g33〈213>寡核苷酸〈400>52tcgacttaactggatacgcagcagcggttc〈210>53〈211>33<212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>53gatccaaccgctgctgcgtatccagttcct〈210>54〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸<400>54tcgacttaggaactggatecgcagcagcgg〈210>55〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>55gatcccgctgctgcgtatccagttccattt〈210>56〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>56tcg3ctte肪tggaactggat3CgC3gC3g〈210>57〈211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>57gatcctgctgcgtatccagttccattaaat〈210>58<211>33〈212>DNA〈213〉寡核苷酸〈400>58tcgacttatttaatggaactggatacgcag26cag33aag33ttg33aag33egg'3'3肌g33cag33〈210>59〈211>33〈212>DNA〈213>寡核苷酸<400>59gatcctgcgtatccagttcc〈210>60〈211>33〈212>DNA<213>寡核苷酸〈400〉60tcgacttagtttttaatggatictggatecgcag〈210>61〈211>21〈212>DNA〈213〉引物〈400>61catetggg朋tcag朋3C3cc〈210>62〈211>21〈212>DNA〈213〉引物〈400>62agatcttctgtttttaatgg〈210>63<211>21〈212〉DNA〈213〉引物〈400>63agatctggaatcag朋3C3cc<210>64〈211〉24〈212>DNA〈213〉引物〈400>64gtcgacctatctgtttttaatgga25/25頁33332121212權(quán)利要求一種分離的多肽，其特征在于，所述的多肽具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列；并且，所述的多肽來源于哺乳動(dòng)物Bin1b蛋白，且由7-30個(gè)氨基酸組成。2.如權(quán)利要求l所述的多肽，其特征在于，所述的多肽具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備特異性結(jié)合Binlb蛋白的抗體。4.一種特異性結(jié)合Binlb蛋白的抗體，其特征在于，所述的抗體特異性識別Binlb蛋白上具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的位點(diǎn)。5.如權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，所述的抗體由保藏號為CCTCC-C200847的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。6.權(quán)利要求4-5任一所述的抗體的用途，其特征在于，用于制備抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的組合物；或用于制備定性或定量檢測樣品中Binlb蛋白存在情況的試劑。7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物選自人、鼠、狗、貓、牛、豬、蝙蝠、猴、樹駒、馬、大象、松鼠、豚鼠或犰狳。8.—種用于抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的組合物，其特征在于，所述的組合物包括(1)有效量的權(quán)利要求4-5任一所述的抗體；禾口(2)藥學(xué)上可接受的載體。9.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC-C200847。10.—種抑制哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的方法，其特征在于，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求4-5任一所述的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物通用的免疫避孕靶標(biāo)。本發(fā)明公開了一種來源于哺乳動(dòng)物Bin1b蛋白的保守性抗原表位，本發(fā)明還公開了特異性與該抗原表位結(jié)合的抗Bin1b蛋白的抗體，特別是單克隆抗體，所述的抗體是一種哺乳動(dòng)物通用型的抗體。文檔編號G01N33/68GK101724020SQ20081020170公開日2010年6月9日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者于合國,刁華,張永蓮,徐萬祥申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所