茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其中茜草多糖可以為市售產(chǎn)品或者 申請(qǐng)人:制備的產(chǎn)品，茜草多糖更優(yōu)選的可以為茜草酸性多糖，本發(fā)明還公開(kāi)了該茜草酸性多糖的制備方法，該方法制備獲得的茜草酸性多糖具有多糖含量高、雜質(zhì)少和均一性良好特點(diǎn)，且該制備方法簡(jiǎn)單高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明中的茜草多糖經(jīng)體外聚集模型、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和秀麗線(xiàn)蟲(chóng)疾病模型試驗(yàn)證實(shí)，能夠有效抑制多聚谷氨酰胺和β-淀粉樣蛋白的異常聚集及其神經(jīng)毒性，還能顯著降低疾病模型的活性氧自由基水平，表明其對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有良好的防治作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于健康食品/保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]神經(jīng)退行性疾病是一類(lèi)以特定神經(jīng)細(xì)胞和組織逐漸衰退乃至死亡為主要特征的進(jìn)行性疾病，包括阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈病和帕金森氏綜合癥等。隨著全球人口老齡化趨勢(shì)的加劇，神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康和生活質(zhì)量的重大疾病，并引起了世界各國(guó)的高度重視，盡管已有減輕患者癥狀的藥物上市，但這些藥物缺乏對(duì)疾病前期發(fā)生和發(fā)展的關(guān)注。因此，積極開(kāi)發(fā)健康食品/保健食品以針對(duì)神經(jīng)退行性疾病進(jìn)行預(yù)防和治療無(wú)疑具有重大的民生意義。
[0003]目前已知的多種神經(jīng)退行性疾病都涉及到蛋白質(zhì)的異常聚集，例如，阿爾茨海默癥的主要病理特征表現(xiàn)為細(xì)胞外的β -淀粉樣蛋白(amyloidP protein;A0 )沉淀和神經(jīng)元內(nèi)過(guò)度磷酸化tau蛋白形成的聚集體，亨廷頓舞蹈病的主要病理特征表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)由多聚谷氨酰胺(polyglutamine;polyQ)異常延伸引起的亨廷頓蛋白包涵體。這些蛋白質(zhì)異常聚集形成的產(chǎn)物將誘發(fā)氧化、炎癥等多種脅迫反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷并產(chǎn)生神經(jīng)退行性病變。因此，通過(guò)抑制疾病蛋白質(zhì)異常聚集以及緩解由異聚蛋白引起的毒性脅迫損傷是防治神經(jīng)退行性病癥的重要研究策略。
[0004]傳統(tǒng)中醫(yī)在神經(jīng)相關(guān)疾病的防治方面已有大量研究和實(shí)踐，而且豐富的中藥材種類(lèi)為之提供了龐大的藥用和保健資源庫(kù)。其中茜草是我國(guó)傳統(tǒng)用于止血涼血和活血化瘀的中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，應(yīng)用歷史悠久，具有涼血止血、活血化瘀、止咳祛痰等功效，可用于治療血熱咯血、經(jīng)閉瘀阻、跌打損傷和風(fēng)濕痹痛等病癥，具有顯著的藥用保健價(jià)值?，F(xiàn)代研究表明，中草藥來(lái)源多糖不僅資源豐富、作用安全，而且具有多種生物活性，在保健領(lǐng)域具有巨大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用 潛力。然而，目前中藥多糖的制備工藝較為粗放，存在多糖含量低、小分子和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)多、負(fù)電性和分子量分布不均一等問(wèn)題，而且對(duì)其活性功能的開(kāi)發(fā)大多集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗氧化方面，神經(jīng)保護(hù)有關(guān)研究尚未深入，相應(yīng)開(kāi)發(fā)利用極少。比如有研究表明茜草多糖具有抗氧化、抗輻射等多種作用，但是其在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道，而且其制備工藝仍有待改進(jìn)。因此，加強(qiáng)開(kāi)發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)功效的中藥多糖將為神經(jīng)相關(guān)疾病的防治提供新的方向，并能推動(dòng)多糖在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的深入應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品(健康食品或功能食品，保健食品在歐美國(guó)豕被稱(chēng)為健康食品，在日本被稱(chēng)為功能食品)中的應(yīng)用。[0006]其中所述神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈病和帕金森氏綜合癥在內(nèi)的以蛋白質(zhì)異常聚集、特定神經(jīng)細(xì)胞和組織逐漸衰退死亡為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0007]本發(fā)明中所述的茜草多糖可以為市售產(chǎn)品，也可以是采用常規(guī)方法制備獲得的茜草多糖。
[0008]本發(fā)明中所述的茜草多糖優(yōu)選為茜草酸性多糖。
[0009]本發(fā)明中所述的茜草酸性多糖優(yōu)選通過(guò)以下方法制備獲得:以茜草為原料，經(jīng)含脫脂、水提、酶解、醇沉、離子交換和透析工序制備獲得茜草酸性多糖，所述茜草酸性多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用，能制備具有防治神經(jīng)退行性疾病的保健食品。
[0010]在茜草酸性多糖的制備過(guò)程中，各工序的具體參數(shù)如下:
[0011]脫脂時(shí)，采用乙醇為脫脂溶劑，茜草和乙醇的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，脫脂溫度為50?90°C，時(shí)間為I?IOh ;水提時(shí)，茜草和水的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，提取溫度為50?100°C，水提取時(shí)間為I?10h。
[0012]酶解時(shí)，采用的酶為木瓜蛋白酶、胰酶、果膠酶或中性蛋白酶，酶解的作用是除去茜草的藥用部位根或根莖中的蛋白質(zhì)，酶解時(shí)酶的質(zhì)量體積百分含量為0.5?5.0%，pH為
2.0?8.0，溫度為30?60°C，時(shí)間為0.5?5h ;醇沉?xí)r，采用乙醇沉淀酶解液獲得茜草酸性粗多糖，乙醇和酶解液的體積比為3:1?5:1。
[0013]離子交換包括陽(yáng)離子交換和陰離子交換，首先進(jìn)行陽(yáng)離子交換，將醇沉獲得的茜草酸性粗多糖，進(jìn)行陽(yáng)離子交換，水洗脫后，洗脫液經(jīng)透析袋透析獲得透析液，將透析液進(jìn)行陰離子交換，依次采用水和洗脫液洗脫后，過(guò)透析袋透析，透析液經(jīng)濃縮和干燥處理，獲得茜草酸性多糖。
[0014]所述陽(yáng)離子交換和陰離子交換的材料為纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠或樹(shù)脂；透析袋的截留分子量為1.0?5.0kD。
[0015]陰離子交換時(shí)，洗脫液為醋酸鹽、磷酸鹽、巴比妥酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或甘氨酸，其濃度為0.1?2.0moI/LO
[0016]本發(fā)明中所述茜草優(yōu)選是指茜草的藥用部位根或根莖。
[0017]采用本發(fā)明上述方法制備獲得的茜草酸性多糖，多糖含量高，雜質(zhì)含量低，負(fù)電性和分子量分布均一，具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0018]采用本發(fā)明上述方法制備的茜草酸性多糖的多糖得率在1.0%?5.0%，單糖組分分析顯示該多糖含有糖醛酸，表明其為電負(fù)性的酸性多糖，苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量大于70%，淀粉碘試驗(yàn)表明不含淀粉成分，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量小于5%，Sepharose6凝膠層析顯示僅有一個(gè)酸性多糖組分峰，表明分子量較為均一。
[0019]本發(fā)明提供的茜草酸性多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用是指其能夠在體外、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上抑制多聚谷氨酰胺和β-淀粉樣蛋白的聚集及聚集毒性并能降低氧化脅迫損傷，從而可用于防治包括阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈病和帕金森氏綜合癥等在內(nèi)的以蛋白質(zhì)異常聚集、特定神經(jīng)細(xì)胞和組織逐漸衰退死亡為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0020]本發(fā)明提供的茜草酸性多糖用途還包括在制備具有神經(jīng)保護(hù)功效的健康食品或保健食品中的應(yīng)用。將上述茜草酸性多糖添加其它原料如乳清蛋白、輔料如麥芽糊精，可制備成為具有神經(jīng)保護(hù)功效的健康食品或保健食品。[0021]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本發(fā)明制備的茜草酸性多糖具有多糖含量高、雜質(zhì)少、均一性良好優(yōu)點(diǎn)，制備工藝簡(jiǎn)單完善，穩(wěn)定高效，解決了茜草多糖提取工藝粗放、質(zhì)量較差的問(wèn)題，適合工業(yè)化生產(chǎn)；
[0023](2)本發(fā)明制備的茜草酸性多糖在體外、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平上對(duì)神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異常聚集及由此誘發(fā)的神經(jīng)毒性均有抑制作用，表明其可應(yīng)用于具有神經(jīng)保護(hù)功效的固液制劑健康食品或保健食品中，為中藥現(xiàn)代化和多糖產(chǎn)品深入應(yīng)用提供了新方向，也可為延緩衰老和防治神經(jīng)退行性疾病做出貢獻(xiàn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】及藥效學(xué)研究結(jié)果對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0025]圖1為實(shí)施例6中茜草多糖抑制神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)體外聚集的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖1A表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖抑制Αβ42的體外聚集，圖1B表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖抑制polyQ40的體外聚集；
[0026]圖2為實(shí)施例7中茜草多糖分別抑制Αβ42、3_硝基丙酸和百草枯細(xì)胞毒性的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖2Α表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖緩解A β 42對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的細(xì)胞毒性，圖2Β表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖緩解3-硝基丙酸對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性，圖2C表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖緩解百草枯對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性，其中*表示p〈0.05 ；
[0027]圖3為實(shí)施例8中茜草多糖抑制多聚谷氨酰胺在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)聚集及聚集毒性的數(shù)據(jù)表征圖；其中圖3A表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL菌草多糖和菌草酸性多糖抑制多聚谷氨酰胺聚集對(duì)HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)ASH神經(jīng)元的神經(jīng)毒性，圖3B表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖抑制多聚谷氨酰胺聚集在AM141秀麗線(xiàn)蟲(chóng)體壁肌肉細(xì)胞中的聚集，圖3C表征2mg/mL茜草多糖和茜草酸性多糖降低HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的活性氧自由基水平，其中*表示 ρ〈0.05。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面列舉一部分具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，有必要在此指出的是以下具體實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029]實(shí)施例1
[0030]本實(shí)施例提供的一種茜草酸性多糖，其通過(guò)如下方法制備獲得:將500g茜草根莖粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C下加熱攪拌回流3h，減壓過(guò)濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:20 (g/mL)加水，在90°C下加熱攪拌提取3h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照2.0g/mL濃度加入木瓜蛋白酶，在40°C、pH6.0條件下加熱攪拌2h。酶解結(jié)束后將4倍(酶解液體積)體積乙醇加入酶解液中，混勻后于4°C下過(guò)夜靜置沉淀，離心收集多糖，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥獲得粗多糖。將粗多糖溶于水后過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以水洗脫，洗脫液采用1.0kD透析袋進(jìn)行透析。透析截流液經(jīng)減壓濃縮后再過(guò)DEAE-sepharose陰離子交換葡聚糖凝膠柱，依次采用水和1.0mol/L氯化鈉溶液洗脫，收集1.0mol/L氯化鈉溶液的洗脫液，采用1.0kD透析袋進(jìn)行透析，透析截流液經(jīng)過(guò)減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得茜草酸性多糖，稱(chēng)重為13.0g,以茜草重量相比可計(jì)算得率為2.6%。
[0031]利用甲醇和三甲基硅醚將茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用氣相色譜分析并對(duì)照9種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的衍生物氣相色譜圖，可以得出茜草酸性多糖組分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸組分表明其是電負(fù)性的酸性多糖。
[0032]通過(guò)苯酚-硫酸反應(yīng)后在490nm下測(cè)吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得多糖含量為76.2%。
[0033]通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法在570nm下測(cè)吸光值，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得蛋白質(zhì)含量為4.0%。這些含量測(cè)定結(jié)果表明所制備茜草酸性多糖雜質(zhì)少，多糖含量高。
[0034]以碘化鉀為試劑檢測(cè)茜草酸性多糖未呈現(xiàn)藍(lán)色，表明其不含淀粉類(lèi)成分。
[0035]將菌草酸性多糖過(guò)Sepharose6凝膠柱，以水洗脫,按ImL/管收集洗脫峰,采用苯酚-硫酸法檢測(cè)每管多糖含量，將每管吸收峰按洗脫時(shí)間繪制吸光值圖譜，發(fā)現(xiàn)僅存在一個(gè)連續(xù)的吸收峰，表明該酸性多糖分子量分布較為均一。
[0036]實(shí)施例2
[0037]本實(shí)施例提供的一種茜草酸性多糖，其通過(guò)如下方法制備獲得:將500g茜草根莖粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加入乙醇，80°C下加熱攪拌回流3h，減壓過(guò)濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在100°C下加熱攪拌提取3h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照1.0g/mL濃度加入木瓜蛋白酶，在50°C、pH6.0條件下加熱攪拌3h。酶解結(jié)束后將4倍體積乙醇加入酶解液中，混勻后于4°C下過(guò)夜靜置沉淀，離心收集多糖，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥獲得粗多糖。將粗多糖溶于水后過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以水洗脫，洗脫多糖溶液采用3.5kD透析袋進(jìn)行透析。透析截流液經(jīng)減壓濃縮后再過(guò)DEAE-sephadex A_25陰離子交換纖維素柱，依次采用水和1.0mol/L氯化銨溶液洗脫，收集1.0mol/L氯化銨溶液的洗脫液，采用3.5kD透析袋進(jìn)行透析，透析截流液經(jīng)過(guò)減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得茜草酸性多糖，稱(chēng)重為11.6g，以茜草重量相比可計(jì)算得率為2.3%。
[0038]利用甲醇和三甲基硅醚將茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用氣相色譜分析并對(duì)照9種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的衍生物氣相色譜圖，可以得出茜草酸性多糖組分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸組分表明其是電負(fù)性的酸性多糖。
[0039]通過(guò)苯酚-硫酸反應(yīng)后在490nm下測(cè)吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得多糖含量為80.3%。
[0040]通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法在570nm下測(cè)吸光值，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得蛋白質(zhì)含量為3.5%。這些含量測(cè)定結(jié)果表明所制備茜草酸性多糖雜質(zhì)少，多糖含量高。
[0041]以碘化鉀為試劑檢測(cè)茜草酸性多糖未呈現(xiàn)藍(lán)色，表明其不含淀粉類(lèi)成分。
[0042]將菌草酸性多糖過(guò)Sepharose6凝膠柱，以水洗脫,按ImL/管收集洗脫峰,采用苯酚-硫酸法檢測(cè)每管多糖含量，將每管吸收峰按洗脫時(shí)間繪制吸光值圖譜，發(fā)現(xiàn)僅存在一個(gè)連續(xù)的吸收峰，表明該酸性多糖分子量分布較為均一。[0043]實(shí)施例3
[0044]本實(shí)施例提供的一種茜草酸性多糖，其通過(guò)如下方法制備獲得:將500g茜草根莖粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加入乙醇，70°C下加熱攪拌回流2h，減壓過(guò)濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在100°C下加熱攪拌提取3h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照1.(^/11^濃度加入胃蛋白酶，在371:、？!14.0條件下加熱攪拌311。酶解結(jié)束后將5倍體積乙醇加入酶解液中，混勻后于4°C下過(guò)夜靜置沉淀，離心收集多糖，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥獲得粗多糖。將粗多糖溶于水后過(guò)CM Sephadex C_25陽(yáng)離子交換葡聚糖凝膠，以水洗脫，洗脫多糖溶液采用3.5kD透析袋進(jìn)行透析。透析截流液經(jīng)減壓濃縮后再過(guò)DEAE-sepharose陰離子交換葡聚糖凝膠柱,依次采用水和0.5mol/L氯化鉀溶液洗脫,收集
0.5mol/L氯化鉀溶液的洗脫液，采用3.5kD透析袋進(jìn)行透析，透析截流液經(jīng)過(guò)減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得茜草酸性多糖，稱(chēng)重為9.7g，以茜草重量相比可計(jì)算得率為1.9%。
[0045]利用甲醇和三甲基硅醚將茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用氣相色譜分析并對(duì)照9種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的衍生物氣相色譜圖，可以得出茜草酸性多糖組分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸組分表明其是電負(fù)性的酸性多糖。
[0046]通過(guò)苯酚-硫酸反應(yīng)后在490nm下測(cè)吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得多糖含量為82.7%。
[0047]通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法在570nm下測(cè)吸光值，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得蛋白質(zhì)含量為4.6%。這些含量測(cè)定結(jié)果表明所制備茜草酸性多糖雜質(zhì)少，多糖含量高。
[0048]以碘化鉀為試劑檢測(cè)茜草酸性多糖未呈現(xiàn)藍(lán)色，表明其不含淀粉類(lèi)成分。將茜草酸性多糖過(guò)Sepharose6凝膠柱，以水洗`脫,按Iml/管收集洗脫峰,采用苯酹-硫酸法檢測(cè)每管多糖含量，將每管吸收峰按洗脫時(shí)間繪制吸光值圖譜，發(fā)現(xiàn)僅存在一個(gè)連續(xù)的吸收峰，表明該酸性多糖分子量分布較為均一。
[0049]實(shí)施例4
[0050]本實(shí)施例提供的一種茜草酸性多糖，其通過(guò)如下方法制備獲得:將500g茜草根莖粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C下加熱攪拌回流3h，減壓過(guò)濾除去溶劑，回收藥材。按照料液比1:5 (g/mL)加水，在100°C下加熱攪拌提取5h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，按照2.0g/mL濃度加入胰酶，在40°C、pH7.0條件下加熱攪拌3h。酶解結(jié)束后將5倍體積乙醇加入酶解液中，混勻后于4°C下過(guò)夜靜置沉淀，離心收集多糖，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥獲得粗多糖。將粗多糖溶于水后過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以水洗脫，洗脫多糖溶液采用2.0kD透析袋進(jìn)行透析。透析截流液經(jīng)減壓濃縮后再過(guò)D900型陰離子交換樹(shù)脂，依次采用水和0.5mol/L醋酸鈉溶液洗脫，收集0.5mol/L醋酸鈉溶液的洗脫液，采用2.0kD透析袋進(jìn)行透析，透析截流液經(jīng)過(guò)減壓濃縮和真空冷凍干燥即獲得茜草酸性多糖，稱(chēng)重為9.3g，以茜草重量相比可計(jì)算得率為1.9%。
[0051]利用甲醇和三甲基硅醚將茜草酸性多糖醇解并衍生化后，利用氣相色譜分析并對(duì)照9種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的衍生物氣相色譜圖，可以得出茜草酸性多糖組分包括阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖醛酸組分表明其是電負(fù)性的酸性多糖。[0052]通過(guò)苯酚-硫酸反應(yīng)后在490nm下測(cè)吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得多糖含量為78.4%。
[0053]通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法在570nm下測(cè)吸光值，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得蛋白質(zhì)含量為3.6%。這些含量測(cè)定結(jié)果表明所制備茜草酸性多糖雜質(zhì)少，多糖含量高。
[0054]以碘化鉀為試劑檢測(cè)茜草酸性多糖未呈現(xiàn)藍(lán)色，表明其不含淀粉類(lèi)成分。
[0055]將菌草酸性多糖過(guò)Sepharose6凝膠柱，以水洗脫,按ImL/管收集洗脫峰,采用苯酚-硫酸法檢測(cè)每管多糖含量，將每管吸收峰按洗脫時(shí)間繪制吸光值圖譜，發(fā)現(xiàn)僅存在一個(gè)連續(xù)的吸收峰，表明該酸性多糖分子量分布較為均一。
[0056]實(shí)施例5
[0057]本實(shí)施例提供的一種茜草多糖，其常規(guī)制備通過(guò)如下方法獲得:將500g茜草根莖粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加水，在10(TC下加熱攪拌提取3h。減壓濃縮后離心獲得澄清提取液，將4倍體積乙醇加入提取液中，混勻后于4°C下過(guò)夜靜置沉淀，離心收集多糖，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥獲得茜草多糖，稱(chēng)重為27.9g，以茜草重量相比可計(jì)算得率為5.6%。
[0058]通過(guò)苯酚-硫酸反應(yīng)后在490nm下測(cè)吸光值，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得多糖含量為18.3%。
[0059]通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法在570nm下測(cè)吸光值，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將多糖吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算可得蛋白質(zhì)含量為29.2%。這些含量測(cè)定結(jié)果表明所制備茜草多糖雜質(zhì)較多，多糖含量較低。
[0060]將菌草多糖過(guò)Sepharose6凝膠柱，以水洗脫，按ImL/管收集洗脫峰，采用苯酚-硫酸法檢測(cè)每管多糖含量，將每管吸收峰按洗脫時(shí)間繪制吸光值圖譜，發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)連續(xù)的吸收峰，表明該多糖分子量分布不均一。
[0061]實(shí)施例6
[0062]A β 42 ( β -淀粉樣蛋白 42 片段，β-amyloid peptide42, A β 42)和 polyQ40 (多聚谷氨酰胺40片段,polyglutamine with40repeats,polyQ40)分別是阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病中的關(guān)鍵致病蛋白，其聚集能夠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)毒性，而抑制其聚集能夠有效緩解神經(jīng)毒性。將實(shí)施例1制得的茜草酸性多糖和實(shí)施例5制得的茜草多糖，以2mg/mL濃度分別加入50 μ MA β 42和polyQ40單體溶液中，混勻后置于37°C下孵育。對(duì)照組同上處理,但用等體積的水代替多糖溶液。每隔一定時(shí)間取出混合液，加入硫磺素T溶液和Glycine-NaOH溶液，振蕩均勻后利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為450nm和485nm。相對(duì)熒光強(qiáng)度以mean±SD表示，采用T檢驗(yàn)比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0063]圖1A和圖1B表明，Aβ 42和polyQ40在體外隨著時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生聚集，加入茜草多糖和茜草酸性多糖后均能夠有效抑制其聚集速度和程度，表明茜草多糖具有潛在的神經(jīng)毒性抑制作用。
[0064]實(shí)施例7
[0065]采用A β 42和3-硝基丙酸能夠分別有效地在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病相關(guān)的神經(jīng)毒性，此外氧化損傷也是神經(jīng)退行性疾病中的重要致病因素，采用百草枯作為造模劑可產(chǎn)生氧化脅迫。將實(shí)施例1制備的茜草酸性多糖和實(shí)施例5制得的茜草多糖，按照l(shuí)_4mg/mL濃度分別加入到以50 μ M A β 42、7.5mM3_硝基丙酸、0.8mM百草枯造模的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中。對(duì)照組采用造模處理，但用細(xì)胞培養(yǎng)基代替多糖溶液，空白組未用造模試劑和多糖處理。在37°C下孵育24h后，加入MTT溶液繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后吸棄上清，加入DMSO并振搖，在570nm處測(cè)定吸光值，細(xì)胞存活率為多糖組吸光值與對(duì)照組吸光值的比值。細(xì)胞活力值以mean±SD表示，采用T檢驗(yàn)比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0066]圖2A顯示，A β 42在50 μ M時(shí)能夠顯著降低細(xì)胞活力，而茜草酸性多糖在l_4mg/mL濃度范圍內(nèi)均能夠緩解A β 42的細(xì)胞毒性，茜草多糖在2mg/mL和4mg/mL濃度下能夠緩解Αβ42的神經(jīng)毒性。
[0067]圖2Β顯示,菌草酸性多糖在較高濃度2mg/mL和4mg/mL下能夠抑制3-硝基丙酸的細(xì)胞毒性，而茜草多糖在4mg/mL濃度下可以緩解3-硝基丙酸的神經(jīng)毒性。
[0068]圖2C顯示，茜草酸性多糖和茜草多糖在l_4mg/mL濃度范圍內(nèi)均能夠抑制百草枯的細(xì)胞毒性。
[0069]這些結(jié)果顯示茜草酸性多糖較茜草多糖作用更為顯著，但兩者均能夠在細(xì)胞水平上抑制阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病相關(guān)的神經(jīng)毒性并減少氧化損傷，表明兩者均具有良好的體外神經(jīng)保護(hù)作用。
[0070]實(shí)施例8
[0071]秀麗線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因模型HA759是將polyQ(多聚谷氨酰胺,polyglutamine,polyQ)和GFP在其頭部ASH神經(jīng)元中表達(dá)，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，polyQ聚集將導(dǎo)致ASH神經(jīng)元進(jìn)行性衰亡。因此可以通過(guò)觀察ASH神經(jīng)元的存活率來(lái)檢測(cè)多糖對(duì)polyQ聚集介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的緩解作用。將實(shí)施例1制備獲得的茜草酸性多糖和實(shí)施例5制得的茜草多糖，以l_4mg/mL濃度分別加入LI期HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)中，對(duì)照組加入等體積的S Medium，置于15°C下培養(yǎng)3天。收集HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)·，加入疊氮化鈉溶液使其麻痹，混勻后滴加在瓊脂糖墊上，在熒光顯微鏡下觀察每條秀麗線(xiàn)蟲(chóng)ASH神經(jīng)元的GFP熒光點(diǎn)。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)~100條秀麗線(xiàn)蟲(chóng)，ASH神經(jīng)元存活百分率=ASH神經(jīng)元存活的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目/ (ASH神經(jīng)元存活的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目+ASH神經(jīng)元死亡的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目)X 100。存活率以mean土SEM表示，使用one-wayANOVA分析和Tukey post-hoc test比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0072]結(jié)果如圖3A所示，由于polyQ在ASH神經(jīng)元中進(jìn)行性表達(dá)和聚集，導(dǎo)致對(duì)照組HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)ASH神經(jīng)元在3天后的存活率僅為33.5%，茜草酸性多糖在lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL濃度下均能延緩ASH神經(jīng)元死亡，ASH神經(jīng)元存活率相比于對(duì)照組的分別提高至46.4%,54.2%和55.3%。茜草多糖在2mg/mL和4mg/mL濃度下具有神經(jīng)保護(hù)活性，ASH神經(jīng)元存活率相比于對(duì)照組的分別提高至44.7%和48.3%，該結(jié)果表明茜草酸性多糖作用更為顯著，但茜草酸性多糖和茜草多糖均能夠緩解polyQ聚集介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。
[0073]秀麗線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因模型AM141是在體壁肌肉細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)polyQ40::YFP融合基因，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，polyQ40進(jìn)行性表達(dá)并形成聚集而導(dǎo)致秀麗線(xiàn)蟲(chóng)周身出現(xiàn)彌散的綠色熒光點(diǎn)，而且熒光點(diǎn)數(shù)量將逐漸增加。因此可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)熒光點(diǎn)的數(shù)量來(lái)檢測(cè)多糖對(duì)polyQ聚集的抑制作用。將實(shí)施例1制備的茜草酸性多糖和實(shí)施例5制得的茜草多糖，以l-4mg/mL濃度分別加入LI期AM141秀麗線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)中，對(duì)照組加入等體積的S Medium,置于20°C下培養(yǎng)4天。每24h收集AM141秀麗線(xiàn)蟲(chóng)，將其固定于瓊脂糖墊上，在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每條秀麗線(xiàn)蟲(chóng)周身的熒光點(diǎn)數(shù)，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30~40條，連續(xù)統(tǒng)計(jì)4天。熒光點(diǎn)數(shù)目以mean土 SEM表示，使用one-way ANOVA分析和Tukey post-hoc test比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0074]結(jié)果如圖3B所示，對(duì)照組AM141秀麗線(xiàn)蟲(chóng)在發(fā)育生長(zhǎng)過(guò)程中，其周身肌肉細(xì)胞的polyQ聚集點(diǎn)逐漸增多，第I天到第四天的熒光聚集點(diǎn)數(shù)分別為?2個(gè)、?12個(gè)、?30個(gè)和?52個(gè)。采用2mg/ml茜草酸性多糖處理后，在第I天和第2天時(shí)熒光聚集點(diǎn)數(shù)基本與對(duì)照組的相當(dāng)，在第3天和第4天時(shí)聚集點(diǎn)數(shù)分別為?27個(gè)和?46個(gè)，相比于對(duì)照組的有所下降。而采用2mg/mL茜草多糖處理后，第1、2和4天時(shí)熒光聚集點(diǎn)數(shù)基本與對(duì)照組的相當(dāng)，第3天的聚集點(diǎn)相比于對(duì)照組的下降至?29個(gè)，該結(jié)果表明茜草酸性多糖和茜草多糖均具有抑制polyQ體內(nèi)聚集的作用,但酸性多糖效果較為顯著。
[0075]將實(shí)施例1制備的茜草酸性多糖和實(shí)施例5制得的茜草多糖，以2mg/mL濃度加入LI期HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)中，對(duì)照組加入等體積的S Medium，置于15°C下培養(yǎng)3天。收集HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)，加入含1%吐溫20的PBS，然后轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中在冰上勻漿，收集勻漿再加入DCFH-DA探針溶液，在37°C下避光孵育，然后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530nm。相對(duì)熒光強(qiáng)度以mean 土 SEM表示，采用T檢驗(yàn)比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0076]結(jié)果如圖3C所示，對(duì)照組的DCF相對(duì)熒光值為47.8，采用2mg/mL茜草酸性多糖和茜草多糖處理后，DCF相對(duì)熒光值分別下降至32.6和35.6，表明茜草酸性多糖和茜草多糖均能夠顯著降低HA759秀麗線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基水平，具有良好的體內(nèi)抗氧化活性。
[0077]這些結(jié)果進(jìn)一步表明除了在細(xì)胞水平，茜草多糖還能夠在整體動(dòng)物水平上抑制多聚谷氨酰胺異常聚集及其神經(jīng)毒性，并能減少其氧化水平，充分說(shuō)明該多糖的體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)活性。
[0078]經(jīng)上述體外聚集模型、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和秀麗線(xiàn)蟲(chóng)疾病模型試驗(yàn)證實(shí)，茜草多糖能夠有效抑制多聚谷氨酰胺和β -淀粉樣蛋白的異常聚集(見(jiàn)實(shí)施例6和實(shí)施例8)及其神經(jīng)毒性(見(jiàn)實(shí)施例7和實(shí)施例8)，還能顯著降低疾病模型的活性氧自由基水平(見(jiàn)實(shí)施例8)，表明其對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有良好的防治作用。
[0079]實(shí)施例9
[0080]將實(shí)施例1制得的茜草酸性多糖，根據(jù)需要添加適量乳清蛋白、麥芽糊精制備成為具有神經(jīng)保護(hù)功效的粉末狀態(tài)健康食品或保健食品，還可以添加其它常規(guī)輔料制成常規(guī)劑型。
[0081]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈病和帕金森氏綜合癥在內(nèi)的以蛋白質(zhì)異常聚集、特定神經(jīng)細(xì)胞和組織逐漸衰退死亡為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的茜草多糖為市售產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的茜草多糖為茜草酸性多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的茜草多糖通過(guò)以下方法制備獲得:以茜草為原料，經(jīng)含脫脂、水提、酶解、醇沉、離子交換和透析工序制備獲得，所述茜草酸性多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用，能制備具有防治神經(jīng)退行性疾病的保健食品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:脫脂時(shí)，采用乙醇為脫脂溶劑，茜草和乙醇的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，脫脂溫度為50?90°C，時(shí)間為I?IOh ;水提時(shí)，茜草和水的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，提取溫度為50?100°C，水提取時(shí)間為I?10h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:酶解時(shí)，采用的酶為木瓜蛋白酶、胰酶、果膠酶或中性蛋白酶，酶解的作用是除去茜草的藥用部位根或根莖中的蛋白質(zhì)，酶解時(shí)酶的質(zhì)量體積百分含量為0.5?5.0%，pH為2.0?8.0，溫度為30?60°C，時(shí)間為0.5?5h ;醇沉?xí)r，采用乙醇沉淀酶解液獲得茜草酸性粗多糖，乙醇和酶解液的體積比為3:1?5:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:離子交換包括陽(yáng)離子交換和陰離子交換，首先進(jìn)行陽(yáng)離子交換，將醇沉獲得的茜草酸性粗多糖，進(jìn)行陽(yáng)離子交換，水洗脫后，洗脫液經(jīng)透析袋透析獲得透析液，將透析液進(jìn)行陰離子交換，依次采用水和洗脫液洗脫后，過(guò)透析袋透析，透析液經(jīng)濃縮和干燥處理，獲得茜草酸性多糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述陽(yáng)離子交換和陰離子交換的材料為纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠或樹(shù)脂；透析袋的截留分子量為1.0?5.0kD ;陰離子交換時(shí)，洗脫液為醋酸鹽、磷酸鹽、巴比妥酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽或甘氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的茜草多糖在制備具有防治神經(jīng)退行性疾病功效的保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述茜草是指茜草的藥用部位根或根莖。
【文檔編號(hào)】A23L1/09GK103564288SQ201310476130
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】馬忠華, 馬方勵(lì), 李海峰, 胡明華, 徐曉飛 申請(qǐng)人:無(wú)限極（中國(guó)）有限公司