本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地指一種基于rs8099917位點基因分型雙色熒光PCR快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：丙肝，是一種由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要經(jīng)輸血、針刺、吸毒等傳播。現(xiàn)有研究中表明人類IL-28B基因的rs8099917位點多態(tài)性與抗病毒治療的療效具有相關(guān)性。目前，rs8099917位點基因多態(tài)性的鑒別方法有多種，主要采用基因測序、基因芯片、高分辨率溶解曲線(HRM)和酶切等方法，但多數(shù)操作繁雜、耗時較長、所需儀器設(shè)備昂貴、特異性較差，難以在普通醫(yī)院開展。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種IL28B基因rs8099917位點基因分型雙色熒光PCR快速檢測試劑盒，該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、耗時短等特點，可高效地監(jiān)測rs8099917的T和G等位基因。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計的rs8099917基因分型雙色熒光PCR快速檢測試劑盒，包括DNA提取液和雙色熒光PCR反應(yīng)液；所述雙色熒光PCR反應(yīng)液包含以下組分：(1)基于rs8099917位點的引物探針組正向引物F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；T熒光探針S1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；G熒光探針S2，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(2)PCR擴增體系PCR10×buffer、25mM的MgCl2、dNTPs含dUTP、雙組分熱啟動DNA聚合酶、50×ROXReferenceDye、RNase-FreeddH2O；所述PCR10×buffer內(nèi)含100mMpH8.8的Tris-HCl、500mM的KCl、0.8％v/v的Nonidet；所述PCR10×buffer不含有Mg2+；所述雙組分熱啟動DNA聚合酶為化學(xué)修飾的HotStarTaqDNA聚合酶和抗體修飾的AntiTaqDNA聚合酶。優(yōu)選地，上述試劑盒中各個引物及探針在擴增體系中的濃度如下：優(yōu)選地，上述試劑盒的熒光定量PCR擴增條件為95℃5min預(yù)熱，95℃3s、60℃30s、25個循環(huán)，60℃開始收集熒光信號。優(yōu)選地，上述試劑盒中T熒光探針S1為MGB探針，其5'熒光為FAM；所述G熒光探針S2為MGB探針，其5'熒光為VIC。本發(fā)明的有益效果：通過重新設(shè)計了引物和TaqMan-MGB探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，雙組分熱啟動DNA聚合酶構(gòu)成酶活自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)、ROXReferenceDye可消除信號本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差，從而實現(xiàn)準確、擴增效率高，靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好、操作簡便且檢測用時更短，使該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)臨床上的應(yīng)用與推廣。附圖說明圖1為DNA測序法檢測的IL28B基因rs8099917位點的測序結(jié)果圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供了一種rs8099917位點基因分型雙色熒光PCR快速檢測試劑盒一、試劑盒組成與配制1)引物及探針組基于rs8099917位點的引物探針組正向引物F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；5'TGTTTTCCTTTCTGTGAGCA3'；反向引物R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；5'GTAAGACATAAAAAGCCAGCTA3'；T熒光探針S1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；5'FAM-TGAGCAATTTCACCC-NFQ3'-MGB，F(xiàn)AM探針；G熒光探針S2，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；5'VIC-TGTGAGCAATGTCAC-NFQ3'-MGB，VIC探針上述引物及探針均委托上海生工生物人工合成。2)DNA提取液DNA提取液可以采用市售DNA提取試劑盒，也可以自行配制。本實施例中DNA提取液配方：(1)3％明膠；(2)配制200mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HCl；(3)10％SDS3mg/ml蛋白酶K(臨用前加入)；(4)pH7.8飽和酚；(5)無水乙醇；(6)70％乙醇；(7)RNase-FreeddH2O。3)雙色熒光PCR的反應(yīng)體系如下：試劑終濃度或單位體積中含量PCR10×buffer5μlMgCl24mmol/LdNTP(含dUTP)0.48mmol/LTaqDNA聚合酶0.5U正向引物F1.5μl反向引物R1.5μlT熒光探針S11.0μlG熒光探針S21.0μlDNA模板5μlddH2O加至50μl總反應(yīng)體積50μl使用上述試劑盒時，雙色熒光PCR的反應(yīng)程序為：95℃5min預(yù)熱，95℃3s、60℃30s、25個循環(huán)，60℃開始收集熒光信號。試驗例1DNA測序驗證1、將實施例1中的雙色熒光PCR試劑盒，針對50例丙肝患者的全血樣本DNA進行雙色熒光PCR，結(jié)果見表1。將上述稀釋品利用雙色熒光PCR的反應(yīng)體系擴增，擴增條件為95℃5min預(yù)熱，95℃3s、60℃30s、25個循環(huán)，60℃開始收集熒光信號。表1rs8099917位點SNP類型測試結(jié)果比較2、設(shè)計測序引物對50份樣本DNA的rs8099917位點的3種基因型進行測序，與上述試劑盒檢測結(jié)果一致。圖1所示為DNA測序法檢測的rs8099917位點的G/T和T/T型的兩種基因型。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種rs8099917基因分型雙色熒光PCR快速檢測試劑盒<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1tgttttcctttctgtgagca20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gtaagacataaaaagccagcta22<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3tgagcaatttcaccc15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>4tgtgagcaatgtcac15當前第1頁1 2 3