本發(fā)明涉及檢測用試劑盒，具體是通過涉及一種通過平原血漿循microrna-369-3p表達水平預測急性高山病發(fā)病風險，從而用于評定人體急性高山病的易感性。

背景技術(shù)：

急性高山病(acutemountainsickness，ams)，又稱作急性輕癥高原反應，是發(fā)生在長期生活于低海拔地區(qū)的人，在未適應新環(huán)境的情況下快速進入2500m以上高原后1-3天產(chǎn)生，包括失眠、頭痛、眩暈、食欲缺乏、情緒不安及嘔吐等一系列癥狀，其中劇烈的頭疼是ams的典型癥狀。而ams根據(jù)上升速度和具體海拔的不同，其發(fā)病率高達50％至85％(bartschpandswensoner(2013)，clinicalpractice：acutehigh-altitudeillnesses，《nengljmed》，368(24)，2294-302.)，對于進入高原的人群而言，ams會嚴重影響其工作和生活能力。更嚴重的是，如果ams沒有得到有效的控制與治療，很可能發(fā)展成為具有高致死率的高原腦水腫(highaltitudecerebraledema，hace)(booscjetal.(2016)，highaltitudeandacutemountainsicknessandchangesincirculatingendothelin-1，interleukin-6，andinterleukin-17a，《highaltitudemedicine&biology》，17(1)，25-31.)。

ams有明顯的遺傳傾向性及個體易感性，高原低壓低氧的環(huán)境因素和遺傳因素均可以影響ams的發(fā)生。多年以來，ams的遺傳傾向性及個體易感性一直是國內(nèi)外學者關注的熱點，盡管有人已經(jīng)提出使用低氧敏感基因egln1和hif-1an的snp位點對ams易感人群進行預測，但是目前看來這些標記物在準確性和特異性等方面都不盡如人意(zhange，zhangj，jinj，qinj，lih，huangl：variantsofthelowoxygensensorsegln1andhif-1anassociatedwithacutemountainsickness.《(internationaljournalofmolecularsciences》，2014，15(12)：21777-21787.)。我國高原面積遼闊(約占國土面積的1/5)近年以來，青藏高原平均海拔在4000米以上，隨著國內(nèi)外高原旅游業(yè)及高原經(jīng)濟建設的蓬勃發(fā)展，越來越多的平原世居人群進入高原，而ams的發(fā)生已給人們的生活和工作造成十分嚴重的影響，所以亟待尋找到在平原對ams的發(fā)病易感性進行預測的有效方法。

microrna是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性小分子非編碼rna，長度為18～24個核苷酸。microrna通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡等生命活動，在胚胎發(fā)育、機體代謝、疾病發(fā)生發(fā)展等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來，研究人員在血液、唾液、尿液等多種體液中檢測到microrna，提出循環(huán)microrna的概念。并且，microrna的表達水平的高低和其遺傳基因的差異性高度相關，近年來，大量的研究表明，循環(huán)microrna對腫瘤、高血壓、卒中及一系列疾病的提前診斷和發(fā)病預測都有很好的特異性和敏感性。再者血液等體液標本易于獲得，臨床可操作性強且創(chuàng)傷性小，而且循環(huán)microrna穩(wěn)定性好，檢測便利，因此，循環(huán)microrna具有作為ams無創(chuàng)性生物標志物的潛能，適用于ams易感性人群篩查(ghaivandwangk(2016)，recentprogresstowardtheuseofcirculatingmicrornasasclinicalbiomarkers，《archtoxicol》.)。

而關于循環(huán)microrna與ams易感性之間的相關性，尚未見報道。

更未見一種用于檢測血中microrna-369-3p表達水平來預測ams發(fā)病風險的報道。

通過平原世居者平原血漿循環(huán)microrna的芯片譜篩查，結(jié)合其高原缺氧暴露后的ams發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)平原血漿循環(huán)microrna-369-3p在ams易感者和ams耐受者之間存在著差異。再通過sybr(即sybrgreen染料，縮寫sybr)實時熒光定量pcr(聚合酶鏈反應)的方法檢測了平原血漿循環(huán)microrna-369-3p表達水平，證實了平原血漿循環(huán)microrna-369-3p表達水平和ams的易感性之間存在著相關性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于尋找與ams相關的平原血漿新型生物學標志物，而另一個目的在于提供平原血漿microrna-369-3p在制備平原預測ams發(fā)病風險的試劑盒中的運用。該試劑盒能用于平原人在進入高原前對ams易感者的篩選，指導ams的預防，減輕ams的威脅。

發(fā)明人通過對13例ams患者和9例健康對照的血漿microrna表達譜進行對比分析，后對41例ams患者和46例健康對照的血漿microrna-369-3p表達水平進行比較，研究microrna-369-3p與ams的相關性，尋找出了敏感可信的ams易感生物遺傳標記。步驟是使用edta-na抗凝管采集22名擬從平原快速進入高原人群的外周血2ml，3000×g，25攝氏度下分離10分鐘后提取上層血漿-80攝氏度下保存?zhèn)溆茫ㄟ^microrna表達譜芯片(mircurytmlnaarray(v.18.0))對血漿中microrna表達水平進行檢測，待人群進入高原后，根據(jù)ams國際通用診斷標準路易斯湖評分診斷系統(tǒng)區(qū)分ams和健康人群(maggiorinimetal.(1998)assessmentofacutemountainsicknessbydifferentscoreprotocolsintheswissalpsaviatspaceenvironmed，69(12)，1186-92.)，比較ams和健康人群microrna表達譜，篩選ams易感相關microrna，發(fā)現(xiàn)microrna-369-3p在ams易感者和健康人群中表達存在顯著差異。

使用qpcr技術(shù)在另一獨立人群中對microrna-369-3p在ams易感者(41例)和健康對照組(46例)中的表達分布進行檢測。整個過程中血漿rna提取采用德國凱杰技術(shù)有限公司的血漿microrna柱式抽提試劑盒(mirneasyserurn/plasmakit，貨號：217184)提取，然后采用實時熒光定量pcr(hairpin-ittmmirnasrt-pcrquantitationkit，貨號：e01008)的方法進行對microrna-369-3p和外參cel-mir-39進行擴增；在分別計算每例標本的microrna-369-3p相對cel-mir-39的歸一化表達水平，結(jié)果經(jīng)過spss19.0進行檢驗，以p＜0.05為顯著性檢驗標準，發(fā)現(xiàn)ams易感組標本(41例)和正常人群(46例)血漿microrna-369-3p的表達水平存在著顯著差異(表1)

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，找到一種平原血漿microrna標志物可以篩選出ams易感者和耐受者。通過檢測人平原血漿中的microrna-369-3p的含量，通過表達量高低來區(qū)分ams易感者和耐受者，進而預測進入高原后ams的發(fā)病風險。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：檢測平原人血漿microrna-369-3p的含量，以區(qū)分ams易感者和耐受者，microrna-369-3p具體信息見表2。

本發(fā)明的效益是：篩選出的microrna對ams有很好的預測效能，能夠在平原預測到達高原后ams的發(fā)病風險，指導ams的預防和治療，減輕ams的威脅。

本發(fā)明除了上述技術(shù)方案以外，還做了如下的改進。

本發(fā)明還包括，血漿microrna(microrna-369-3p)在制備預測ams發(fā)病風險的試劑盒中的作用。

附圖說明

圖1.ams易感者和耐受者的血漿中microrna-369-3p表達水平(即與cel-mir-39相比microrna-369-3p的歸一化水平)。其中ams是ams發(fā)病者、non-ams為健康對照。*：p＜0.05，即有顯著統(tǒng)計學差異，**：p＜0.01，即有極顯著統(tǒng)計學差異，***：p＜0.001，即有極顯著統(tǒng)計學差異。

圖2為ams易感者血漿microrna-369-3p的工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)，該圖中的很好的顯示了ams易感者的roc曲線、曲線下面積(areaunderthecurve，auc)、靈敏性(sensitivity)、特異性(specificity)，其中auc反映了預測效能(auc＝0.5，沒有預測效能；0.5＜auc＜0.7很小的預測價值；0.7＜auc＜0.9相當準確的預測價值；0.9＜auc＜1，很準確的預測價值)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行描述，所列舉的實施例僅僅是用來解釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1血漿標本microrna-369-3p的表達與ams發(fā)病風險的相關性研究

一、材料與標本收集描述

ams易感者血漿標本收集自急進高原人群中的ams患者進入高原前，合計41例。正常人群的血漿標本收集自急進高原人群中的正常健康人群進入高原前，合計46例。ams的診斷是通過國際通用診斷標準-路易斯湖評分來確認的。所有人群在取血之前沒有服用任何預防性藥物。每個樣本用edta-na抗凝管合計收集2ml血液。

二、樣品處理和rna提取

在靜脈血采集后10min內(nèi)，在3000×g，25攝氏度下離心10分鐘之后，用無rna酶和無細菌的吸頭取上層血漿于無rna酶和無細菌的ep管中-80℃保存?zhèn)溆?。血漿中的rna通過德國凱杰技術(shù)有限公司的血漿microrna柱式抽提試劑盒(mirneasyserum/plasmakit，貨號：217184)按照說明書操作步驟進行提取和純化。

三、實時熒光定量pcr(sybr染料法)

運用中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的microrna實時熒光定量pcr試劑盒(hairpin-ittmmirnasrt-pcrquantitationkit，貨號：e01008)對microrna-369-3p和外參cel-mir-39進行擴增；分別得到ct值(cyclethreshold)，通過公式：表達量＝2ct(cel-mir-39)-ct(microrna-369-3p)在分別計算每例標本的microrna-369-3p的表達水平，具體操作過程見說明書。每個樣本重復三次實驗。microrna-369-3p和cel-mir-39引物序列見表3.

四、統(tǒng)計分析方法。

運用統(tǒng)計學軟件spss19.0進行統(tǒng)計。正態(tài)性檢驗采用shapiro-wilk法，顯著性差異用mann-whitney檢驗(mann-whitneytest)，工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)及線下面積(areaunderthecurve，auc)用于評價microrna-369-3p的預測效能。當p＜0.05時認為有統(tǒng)計學差異。

六、結(jié)果分析

1.ams易感者與ams耐受者，血漿microrna-369-3p的表達量相比，p＜0.001，有極顯著統(tǒng)計學差異。

2.血漿microrna-369-3p對ams易感者與ams耐受者的預測效能通過roc曲線可以知道，microrna-369-3p對ams易感者與ams耐受者的預測效能是很好的，auc為0.859(95％ci，0.783-0.985)。

七、結(jié)論

血中microrna-369-3p對ams易感者與ams耐受者有很好的預測效能，能夠預測ams的發(fā)病風險。

表1ams易感組和ams耐受組血漿microrna-369-3p的表達水平

***ams易感組vs.ams耐受組：p＜0.001，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(25％-75％分位數(shù))表示

表2microrna-369-3p基本信息

表3microrna-369-3p和cel-mir-39引物信息