本發(fā)明涉及一種用分子方法來鑒定沙門菌h抗原的引物。

背景技術(shù)：

沙門菌的血清型別與其致病性、耐藥性、宿主范圍等密切相關(guān)，對分離到的沙門菌進行血清學(xué)分型，是沙門菌監(jiān)測中必不可少的工作。傳統(tǒng)的沙門菌血清學(xué)分型方法是血清凝集試驗，先根據(jù)其菌體抗原（o抗原）分群，再根據(jù)鞭毛抗原（h抗原）分型。因h抗原的特性及血清凝集試驗本身的局限性，在實際工作中存在諸多問題：（1）h抗原與相應(yīng)抗血清呈絮狀反應(yīng)，其反應(yīng)結(jié)果不如o抗原的顆粒狀凝集明顯，結(jié)果判斷受個人經(jīng)驗和主觀影響較大；（2）部分沙門菌的h抗原需經(jīng)1次或數(shù)次位相誘導(dǎo)后才能凝集，操作繁瑣耗時；（3）不同h抗原間常存在交叉凝集反應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于dna分析的沙門菌檢測及血清分型方法相繼出現(xiàn)，如普通pcr法、熒光pcr法、測序分析等，此類方法均以沙門菌相關(guān)特異基因序列為目標(biāo)，為沙門菌的血清型別鑒定提供了新思路，但大多局限于單個或少數(shù)幾個血清型的鑒別，難以實現(xiàn)多株菌、多種血清型別的同時鑒定。

基于luminexxmap（flexiblemulti-analyteprofiling）技術(shù)的液態(tài)懸浮芯片技術(shù)，以其高通量、高效率、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點，近年來受到越來越多的關(guān)注和青睞，其在沙門菌血清型鑒別中的應(yīng)用，也逐漸見諸報道?；诿绹鴆dc的研究成果，luminex公司于近年推出了基于直接雜交法的沙門菌血清分型試劑盒（xmapsalmonellaserotypingassay，ssa），即在上、下游引物擴增范圍內(nèi)，設(shè)計1條特異性探針并將之耦聯(lián)于各熒光編碼的普通微珠(不含反tag序列)上，成為標(biāo)記微珠，樣品經(jīng)不對稱pcr擴增并生物素標(biāo)記后，與耦聯(lián)有特異性探針的各標(biāo)記微珠混合液雜交分型。但該試劑盒所用微珠不帶磁性，僅適用于基于流式細胞原理的luminex100/200流式熒光檢測儀，不能用于基于磁珠捕獲與ccd成像的magpix檢測平臺。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種沙門菌h抗原鑒定用引物，無需另外設(shè)計探針，并避免了直接雜交法中pcr產(chǎn)物因自我復(fù)性而影響雜交的問題，且同時適用于magpix和luminex100/200檢測平臺。

本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

沙門菌h抗原鑒定用引物，其特征在于：包括6條上游引物f1-f6以及31條下游引物r1-r31，其序列如表1所示；其中f1為r1～r20的共同上游引物；f2為r21～r24的共同上游引物；f3為r25～r28的共同上游引物，f4為r29的上游引物，f5為r30的上游引物，f6為r31的上游引物。

f1-f7的序列分別為序列表中的seqno.1-seqno.7，r1-r31的序列分別是序列表中的seqno.8-seqno.37。

進一步地，所述上游引物和下游引物共計37條，被分為2個pcr反應(yīng)體系，其中，f1、r1～r20為反應(yīng)體系1中引物，其余均為反應(yīng)體系2中引物。

進一步地，上述的沙門菌h抗原鑒定用引物采用以下方法進行設(shè)計和合成：

（1）以沙門菌編碼h抗原的flic基因和fljb基因為目標(biāo)基因，從genbank中下載各h抗原的基因序列；

（2）在保守片段上設(shè)計通用的上游引物，在可變片段上設(shè)計特異的下游引物；

（3）為每條特異的下游引物選擇合適的tag序列（與luminex公司提供的特定編號magplex?xtag磁珠上的anti?tag序列互補）；

（4）引物合成：上游引物的5’端用生物素標(biāo)記，特異性下游引物的5’端連接特定的tag序列，tag序列與各特異性引物之間用c12間隔。

進一步地，應(yīng)用上述沙門菌h抗原鑒定用引物的進行檢測，具體包括以下步驟：

（1）根據(jù)權(quán)利要求3的步驟設(shè)計合成37條引物；

（2）提取沙門菌菌株dna；

（3）將37條引物分為2個pcr反應(yīng)體系，在一定條件下進行擴增反應(yīng)；

（4）將magplex?xtag磁珠混合，取磁珠混合液與pcr產(chǎn)物混合，再加入sape報告液75μl，吹吸混勻后，放入pcr儀進行核酸雜交；

（5）采用magpix液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)，檢測各孔中磁珠編碼及其熒光信號強度，當(dāng)平均熒光強度（mfi）的信噪比≥5時判定為陽性。

所述檢測方法還包括血清凝集對照試驗，所述血清凝集對照試驗采用丹麥ssi沙門菌血清型鑒定用診斷血清對沙門菌株進行h抗原分型，并將結(jié)果與權(quán)利要求4的檢測結(jié)果進行比較。

本發(fā)明基于luminexxtag液態(tài)懸浮芯片技術(shù)，利用magplex-xtag磁珠，以編碼沙門菌h抗原的flic和fljb基因為目標(biāo)基因，選取其保守片段設(shè)計上游通用引物，選取可變片段設(shè)計下游特異性引物，建立能高通量鑒別沙門菌h抗原的xtag磁珠懸浮芯片法，用于沙門菌的血清型別鑒定。除上、下游引物外，無需另外設(shè)計探針，并避免了直接雜交法中pcr產(chǎn)物因自我復(fù)性而影響雜交的問題，且同時適用于magpix和luminex100/200檢測平臺。

flic和fljb是沙門菌h抗原的編碼基因，經(jīng)多序列比對，可分成4個聚類，即α聚類、g復(fù)合抗原聚類、z4復(fù)合抗原聚類及z29聚類；各聚類中不同h抗原的編碼序列兩端相對保守，中間則呈現(xiàn)高度的h抗原特異性，這為本發(fā)明中引物的設(shè)計提供了較理想的基因區(qū)。在保守區(qū)域設(shè)計通用的上游或下游引物序列，在可變區(qū)域設(shè)計針對各h抗原的特異性引物序列，這可大大減少多重pcr體系中引物序列的數(shù)量。pcr體系1共可檢測20種h抗原（α聚類），僅用了1條上游引物；pcr體系2共可檢測11種待測物，因g復(fù)合抗原聚類、z4復(fù)合抗原聚類及z29聚類h抗原間的高度變異，無法共用一條通用引物，但4種g復(fù)合抗原、4種z4復(fù)合抗原均分別共用1條上游引物。因腸炎沙門菌h:g,m抗原與其它g復(fù)合抗原高度相似，難以通過flic和fljb基因的序列差異進行區(qū)分，且腸炎血清型在日常分離菌株中占較大比例，因此，本發(fā)明以腸炎血清型特異基因sdfⅰ為目標(biāo)序列，專門設(shè)計1對針對腸炎血清型的特異性引物。h:d抗原雖屬α聚類，但其引物序列與體系1的其它序列產(chǎn)生較嚴(yán)重的二聚體，故將其調(diào)整至體系2。h:5抗原的基因序列呈現(xiàn)高度的多態(tài)性，無法為其設(shè)計一對或兩對特異引物，故采用排除法，通過h:1通用引物和其它2相h抗原特異性引物的配合，來確定h:5抗原。h:g,t和h:g,s,t雖共用1條引物，但結(jié)合菌株o抗原和2相h抗原的構(gòu)成情況，仍可明確判定血清型別。為保證多重pcr反應(yīng)的順利進行，對各引物的二聚體（包括自身與相互間的）、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配情況及gc含量、tm值、特異性等進行評價與驗證是非常必要的。

luminexxtag技術(shù)是在不同熒光編碼的微珠表面預(yù)先連接含24個堿基的序列，每種編碼微珠連接一種序列，該序列不含c堿基，僅含t、a、g三種堿基，故名tag序列（習(xí)慣上稱反tag序列或反標(biāo)簽序列），連接有反tag序列且有磁性的微珠即為xtag磁珠。本發(fā)明利用xtag技術(shù)，根據(jù)xtag磁珠清單及其反tag序列，為設(shè)計的每條特異性下游引物選擇合適的與反tag序列互補的tag序列；引物合成時，在各特異性下游引物的5’端連接tag序列，對應(yīng)的上游引物的5’端標(biāo)記生物素，為避免pcr過程中tag序列被屏敝而影響后續(xù)與磁珠上反tag序列的雜交，合成時tag序列與特異性引物之間用12碳橋間隔。標(biāo)本經(jīng)pcr擴增并生物素標(biāo)記及tag序列標(biāo)記后，與xtag磁珠混合液雜交，擴增子通過其帶有的tag序列與特定編碼磁珠上的反tag序列雜交而連接于磁珠上，并通過1分子生物素與6分子鏈霉親和素藻紅蛋白的結(jié)合，放大雜交信號。用magpix液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)檢測時，通過激發(fā)磁珠基質(zhì)上的紅色分類熒光，對磁珠編碼即h抗原的種類進行識別；通過激發(fā)特異性雜交于磁珠表面的擴增子上所結(jié)合的藻紅蛋白，對各h抗原基因的存在與否及含量高低進行分析。因xtag技術(shù)能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且將交叉反應(yīng)降到最低，與普通微珠相比，xtag磁珠雜交效率高、背景信號弱，易于進行結(jié)果判斷。本發(fā)明實驗結(jié)果也顯示，pcr產(chǎn)物經(jīng)磁珠雜交后，背景信號mfi通常小于100，而陽性結(jié)果的mfi通常大于1000，信噪比大，結(jié)果判斷明確。

附圖說明

圖1是本發(fā)明體系1的沙門菌h抗原xtag法特異性試驗及陰性對照磁珠雜交結(jié)果。

圖2是本發(fā)明體系2的沙門菌h抗原xtag法特異性試驗及陰性對照磁珠雜交結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細說明，其目的是為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，因此不應(yīng)將實施例理解為對本發(fā)明所要求保護的技術(shù)內(nèi)容作進一步的限定。

1．引物設(shè)計與合成。

（1）序列下載與比對：以沙門菌編碼h抗原的flic基因和fljb基因為目標(biāo)基因，從genbank中下載各h抗原的基因序列，并用bioedit軟件進行多序列比對。

（2）引物設(shè)計：用primerpremier6軟件在保守片段上設(shè)計通用的上游引物，在可變片段上設(shè)計特異的下游引物；用oligo7軟件對各引物的二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配情況及gc含量、tm值等進行評價，并經(jīng)blast驗證各引物對的特異性。

（3）tag序列選擇：根據(jù)luminex公司提供的magplex?xtag磁珠清單及其anti?tag序列，為每條特異性引物選擇合適的tag序列；再次用oligo7軟件對各引物的二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配情況及gc含量、tm值等進行評價，并經(jīng)blast驗證各引物對的特異性。

（4）引物確定與合成：共篩選出37條引物，其中f1為r1～r20共20條特異引物的共同上游引物，f2、f3分別為r21～r24、r25～r28特異引物的共同上游引物（詳見表1）。合成時上游引物的5’端用生物素標(biāo)記，各特異性下游引物的5’端連接特定的tag序列（與luminex公司提供的特定編號magplex?xtag磁珠上的anti?tag序列互補），tag序列與各特異性下游引物之間用c12間隔。

表1檢測所用引物及磁珠

注：f1為r1～r20的共同上游引物；f2為r21～r24的共同上游引物；f3為r25～r28的共同上游引物，f4為r29的上游引物，f5為r30的上游引物，f6為r31的上游引物。f1、r1～r20為反應(yīng)體系1中引物，其余均為反應(yīng)體系2中引物。

（1）主要試劑和儀器：hotstartversionextaq聚合酶及緩沖液（takara，大連）；magplex?xtagmicrosphere（luminex，美國）；鏈霉親和素-藻紅蛋白（streptavidin?r?phycoerythrin，sape）（invitrogen，美國）；引物及其標(biāo)記由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；菌液比濁儀（梅里埃，法國）；s1000pcr擴增儀（bio-rad，美國）；luminexmagpix液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)（luminex，美國）。

（2）菌株dna提取：分離的菌株經(jīng)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)18～24小時后，調(diào)節(jié)菌液濃度至10⁶cfu/ml，取1.0ml經(jīng)10000rpm離心4min，棄上清后加200μl滅菌純水混懸，100℃加熱10min，再10000rpm離心4min，取上清液作為pcr模板。

（3）pcr反應(yīng)體系及條件：將37條引物分成2個pcr反應(yīng)體系（見表1），25μl的反應(yīng)體系中加10×buffer2.5μl，dntps(各2.5mmol/l)2.0μl，體系1中上游通用引物1條（10μmol/l）0.75μl，下游特異性tag引物混合液（共20條，各5μmol/l）1.0μl，體系2中上游通用引物(共2條，各10μmol/l)0.75μl，其余引物混合液（共14條，各5μmol/l）1.0μl，hsextaq酶(5u/μl)0.125μl，模板2.0μl，不足部分用雙蒸水補足。pcr擴增條件：94℃預(yù)變性1min，94℃變性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸30sec，35個循環(huán)，最后在72℃延伸5min。

（4）磁珠雜交及信號檢測：臨用前將各種編碼的magplex?xtag磁珠混合，使每種磁珠的濃度為125個/μl；取20μl磁珠混合液與5μl多重pcr產(chǎn)物混合，再加入5μg/mlsape報告液75μl，吹吸混勻后，放入pcr儀進行核酸雜交；40℃雜交25min。啟動magpix液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)，調(diào)節(jié)針高并校準(zhǔn)、驗證儀器后，檢測各孔中磁珠編碼及其熒光信號強度。當(dāng)平均熒光強度（mfi）的信噪比≥5時判定為陽性。

（5）血清凝集試驗：采用丹麥ssi沙門菌血清型鑒定用診斷血清對沙門菌株進行h抗原分型，操作嚴(yán)格按說明書進行，以與經(jīng)xtag分型法結(jié)果進行比較。

3.效果驗證。

（1）xtag分型法的特異性和敏感性：31種沙門菌h抗原經(jīng)多重pcr擴增后產(chǎn)物為94～245bp（詳見表1），與xtag磁珠雜交后可鑒別分型，各h抗原間無交叉反應(yīng)。大腸埃希菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌及志賀菌dna經(jīng)多重pcr擴增及xtag磁珠雜交后，亦無交叉反應(yīng)。見圖1。

（2）xtag分型法的檢出限和重復(fù)性：以10¹～10⁸cfu/ml的沙門菌液作檢出限分析，除h:l,v的檢出限為10⁴cfu/ml外，其它各h抗原的檢出限均可達到10³cfu/ml，且雜交信號強度與pcr模板濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，在10³～10⁷cfu/ml范圍內(nèi)，菌液濃度越高，mfi越強，當(dāng)菌液濃度達到10⁸cfu/ml時，mfi趨于平穩(wěn)，甚至反而降低，這可能是反應(yīng)達到和所致。

方法重復(fù)性良好，10⁴cfu/ml鼠傷寒沙門菌h：i抗原和腸炎沙門菌h：g,m6次重復(fù)測定，mfi變異系數(shù)分別為4.27%和5.93%；同一菌株不同批次實驗分型結(jié)果一致。

（3）沙門菌株h抗原檢測：對145株日常分離的沙門菌進行血清分型，共分為38種血清型，其中鼠傷寒55株，腸炎26株，共占55.9%。1株斯坦利沙門菌（d:1,2）和1株雞沙門菌（h抗原陰性），用xtag法分別鑒定為圣保羅沙門菌（e,h:1,2）和腸炎沙門菌（g,m:-），經(jīng)位相誘導(dǎo)后用血清凝集試驗進一步證實，支持xtag法結(jié)果；5株血清凝集試驗只鑒定到群而未能分型的菌株（分別為1株b群、1株c1群、2株c2群和1株e1群），其中3株經(jīng)xtag法明確分型，并經(jīng)血清凝集試驗證實，分別是1株c1群鑒定為湯卜遜血清型（k:1,5），1株c2群鑒定為哈達爾血清型（z10:e,n,x），1株e1群鑒定為倫敦血清型（l,v:1,6）。上述結(jié)果表明，正如背景中所述，因血清凝集試驗存在交叉凝集、絮狀反應(yīng)不明顯等原因，常給結(jié)果判斷帶來困難，而基于核酸分析的xtag法較好地彌補了這一不足。7株兩法分型結(jié)果確實不一致的菌株，其中4株為鼠傷寒沙門菌，血清凝集試驗h抗原為“i:1,2”，xtag法鑒定為“i:-”，但這并不影響其血清型別的最終判定；2株阿貢納沙門菌h抗原為“f,g,s:-”，xtag法鑒定為“f,g:-”，1株蒙得維的亞沙門菌h抗原為“g,m,s:-”，xtag法鑒定為“g,m:-”，兩者均是因為h:s特異性引物與本發(fā)明中其它引物序列產(chǎn)生較嚴(yán)重的引物二聚體，故暫未將其放入反應(yīng)體系中，現(xiàn)已將其列入隨后建立的沙門菌o抗原反應(yīng)體系中，取得良好結(jié)果。與金標(biāo)準(zhǔn)血清凝集試驗比較，沙門菌h抗原xtag分型法的敏感度為95.1%，特異度為100%，youden指數(shù)為0.951，兩法的符合率為95.2%（見表2）。

表2沙門菌h抗原分型結(jié)果比較

備注：5株初次鑒定結(jié)果不一致、后經(jīng)血清凝集試驗重新證實的菌株，視為兩法結(jié)果一致菌株。

本發(fā)明涵蓋的31種h抗原，為沙門菌常見1相h抗原和2相抗原，涉及沙門菌屬診斷抗原表中近2000個血清型。利用xtag技術(shù)鑒定沙門菌h抗原，特異、準(zhǔn)確、快速，可在4～5個小時內(nèi)完成90多株常見血清型沙門菌的h抗原鑒定，具有傳統(tǒng)血清凝集試驗無法比擬的優(yōu)勢，可極大地改進沙門菌的日常監(jiān)測工作。

<110>鄭,之北

<120>沙門菌h抗原鑒定用引物

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<210>33

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

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<210>34

<211>20

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<213>人工序列

<400>34

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<400>35

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<210>36

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<400>36

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<400>37

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