本發(fā)明屬于植物根系定殖測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)植物根際促生細(xì)菌在根系定殖的方法。
背景技術(shù)：
植物促生根際細(xì)菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria，pgpr）是能夠在植物根際定殖，提高植物營(yíng)養(yǎng)的可給性、抑制病原菌的生長(zhǎng)或產(chǎn)生某些特殊的促生物質(zhì)，促進(jìn)植物種子萌發(fā)和植物生長(zhǎng)、發(fā)育的一類細(xì)菌。大量研究表明，使用pgpr菌肥，能夠減少化肥用量20%-30%，減少農(nóng)藥用量30%以上，農(nóng)作物增產(chǎn)10%-80%，在發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)中的作用越來越受到重視。
檢測(cè)pgpr在根際定殖的方法，常用的是固態(tài)基質(zhì)法。用土壤、草炭或蛭石等固態(tài)基質(zhì)（滅菌或未滅菌）栽培植物，接種待測(cè)菌劑，培養(yǎng)一段時(shí)間后，取植物根系，平板計(jì)數(shù)或顯微觀察細(xì)菌在根際的定殖情況。固態(tài)基質(zhì)法檢測(cè)pgpr在根際定殖的影響因素較多，具體包括不同實(shí)驗(yàn)室所用基質(zhì)差異較大，基質(zhì)和空氣中其他微生物的影響，基質(zhì)含水量難以穩(wěn)定控制，澆水會(huì)造成菌體的淋失，根際土取樣方法不易統(tǒng)一等，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性差，不同實(shí)驗(yàn)室之間獲得的數(shù)據(jù)難以比較。因此，亟待研究新的檢測(cè)植物根際促生細(xì)菌在根系定殖的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種檢測(cè)植物根際促生細(xì)菌在根系定殖的方法，該方法在無菌環(huán)境下液體震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件穩(wěn)定可控，取樣方法標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種檢測(cè)植物根際促生細(xì)菌在根系定殖的方法，其包括如下步驟：
1）小麥轉(zhuǎn)接及液體培養(yǎng)：將在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小麥苗轉(zhuǎn)接于液體ms培養(yǎng)基中，在白天25-28℃、光照16h，夜間15-20℃、黑暗條件下，于水平搖床上20-50rmp培養(yǎng)24-48h，然后添加1-3ml菌懸液，再繼續(xù)培養(yǎng)5-10天；
2）小麥根系定殖細(xì)菌數(shù)量計(jì)數(shù)：取出小麥苗，用無菌濾紙將根部的培養(yǎng)基擦去，稱重；然后置于組織研磨器中，添加2ml1×pbs緩沖液，研磨至漿狀，采用lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋平板計(jì)數(shù)，計(jì)算每克鮮重小麥根的菌落形成單位數(shù)。
具體的，步驟1）中，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小麥苗經(jīng)下述步驟獲得：固體ms培養(yǎng)基分裝于100-500ml的組織培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝20-100ml，110-121℃高壓滅菌10-30min；在超凈工作臺(tái)中，將催芽后的小麥種子播種于固體ms培養(yǎng)基表面，每瓶播種5-10粒種子；然后將播種后的組織培養(yǎng)瓶在白天25-28℃、光照16h，夜間15-20℃、黑暗的條件下培養(yǎng)至小麥株高5-8cm（約需培養(yǎng)5-10天）。
具體的，步驟1）中，菌懸液經(jīng)下述步驟獲得：30ml規(guī)格的試管中裝tsb液體培養(yǎng)基5-10ml，110-121℃滅菌10-30min；接入1環(huán)惡臭假單胞菌uw4菌苔，28-37℃、200-260rmp培養(yǎng)12-24h，離心收集菌體，菌體用液體ms培養(yǎng)基洗滌，然后用液體ms培養(yǎng)基懸浮并調(diào)至od600值為1即得。
和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明方法采用液體震蕩培養(yǎng)植物，在培養(yǎng)液中接種典型的pgpr菌劑，培養(yǎng)結(jié)束采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌在根際的定殖量。與固態(tài)基質(zhì)法相比，液體震蕩培養(yǎng)法能夠在無菌環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件可穩(wěn)定控制，取樣方法標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
實(shí)施例
材料與方法。
植物和菌株
小麥種子是市售小麥矮抗58；
細(xì)菌菌株為惡臭假單胞菌uw4（pseudomonasputidauw4）：美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心保藏（保藏編號(hào)為nrrlb-50193，保藏日為2008年6月9日）。美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心位于伊利諾伊州皮契里亞，由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心支持的政府性質(zhì)的菌種保藏中心，英文全稱agrieultutalresearchserviceculturecolleetion，簡(jiǎn)稱nrrl。uw4能夠產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶，可在以1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸為唯一氮源的培養(yǎng)基如adf培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
培養(yǎng)基
（1）液體ms培養(yǎng)基（l）：kno31900mg，nh4no31650mg，kh2po4170mg，mgso4·7h2o370mg，cacl2·2h2o440mg，ki0.83mg，h3bo36.2mg，mnso4·4h2o22.3mg，znso4·7h2o8.6mg，na2moo4·2h2o0.25mg，cuso4·5h2o0.025mg，cocl2·6h2o0.025mg，na2-edta37.25mg，feso4·7h2o27.85mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.5mg，煙酸0.5mg，蔗糖30g；
（2）固體ms培養(yǎng)基（l）：液體ms培養(yǎng)基中添加瓊脂7g；
（3）tsb液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨3g，胰蛋白胨17g，葡萄糖2.5g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，加蒸餾水1000ml，ph7.1－7.5；
（4）lb固體培養(yǎng)基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，瓊脂20g，去離子水1000ml；
（5）adf培養(yǎng)基：
a液（微量元素）：mnso4·h2o11.19mg，h3bo310mg，cuso4·5h2o78.22mg，znso4·7h2o124.6mg，moo310mg，溶解于100ml超純水（無菌）中，-4℃保存；
b液（feso4）：feso4·7h2o100mg溶于10ml超純水（無菌）中，需現(xiàn)用現(xiàn)配；
a、b溶液各取0.1ml，依次加入na2hpo46.0g，kh2po44.0g，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸2.0g，mgso4·7h2o0.2g，葡糖酸2.0g，葡萄糖2.0g，檸檬酸2.0g，瓊脂20g，超純水定容至1000ml，調(diào)至ph7.2，121℃滅菌20min。
液體震蕩培養(yǎng)。
1.3.1小麥種子預(yù)處理
挑選籽粒飽滿、胚芽完整的小麥種子于干凈的平板中。添加95%的酒精使種子完全浸泡，處理30s后，用無菌水洗滌三次，用高壓滅菌的濾紙吸取表面水分。用過濾除菌的0.1%升汞浸泡5min，然后用無菌水清洗5遍，在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干。在無菌的平板中平鋪一張大小合適的無菌濾紙，將風(fēng)干后的小麥種子平鋪到濾紙上，向平板中添加10ml無菌水。靜置于25℃恒溫培養(yǎng)箱催芽24h。
1.3.2固體培養(yǎng)基育苗
固體ms培養(yǎng)基分裝于300ml的組織培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝50ml。121℃高壓滅菌20min。在超凈工作臺(tái)中，將催芽后的小麥種子播種于固體ms培養(yǎng)基表面，每瓶播種5粒種子。將播種后的組織培養(yǎng)瓶在白天25-28℃、光照16h，夜間15-20℃、黑暗條件下，培養(yǎng)至小麥株高5-8cm，培養(yǎng)時(shí)間8-10天。
1.3.3菌懸液制備
30ml規(guī)格的試管中裝tsb液體培養(yǎng)基5ml，121℃滅菌30min。接入1環(huán)惡臭假單胞菌uw4菌苔，28℃、220rmp培養(yǎng)12h。8000rpm、離心5min收集菌體，菌體用液體ms培養(yǎng)基洗滌3次，用液體ms培養(yǎng)基懸浮并調(diào)至od600值為1。
1.3.4小麥轉(zhuǎn)接及液體培養(yǎng)
300ml組織培養(yǎng)瓶每瓶分裝液體ms培養(yǎng)基50ml，內(nèi)置一個(gè)帶孔漂板，121℃高壓滅菌20min。將在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小麥苗轉(zhuǎn)接于液體ms培養(yǎng)基中，每瓶液體培養(yǎng)基中接3棵苗。組織培養(yǎng)瓶在白天25-28℃、光照16h，夜間15-20℃、黑暗的條件下于水平搖床上40rmp培養(yǎng)24h。在超凈工作臺(tái)中添加1ml菌懸液，再繼續(xù)培養(yǎng)7天。同時(shí)接1ml無菌水用做對(duì)照。
1.3.5小麥根系定殖細(xì)菌數(shù)量計(jì)數(shù)
將小麥苗從液體ms培養(yǎng)基中取出，用無菌濾紙將根部的培養(yǎng)基輕輕擦拭去，置于分析天平中測(cè)定根的重量。每個(gè)組織培養(yǎng)瓶中取3棵小麥的根一起置于組織研磨器中，添加2ml1×pbs緩沖液，研磨至漿狀。采用lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋平板計(jì)數(shù)，計(jì)算每克鮮重小麥根的菌落形成單位數(shù)。
固體培養(yǎng)。
1.4.1種子消毒
挑選籽粒飽滿、胚芽完整的小麥種子于干凈的平板中。添加95%的酒精使種子完全浸泡，處理30s后，用無菌水洗滌三次，用高壓滅菌的濾紙吸取表面水分。用過濾除菌的0.1%升汞浸泡5min，然后用無菌水清洗5遍，在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干。
1.4.2細(xì)菌接種
取1.3.3制備的菌懸液，4℃8000rpm離心5min，離心收集菌體，用無菌水洗滌2次，懸浮于無菌水中，調(diào)節(jié)菌數(shù)為109cfu/ml。將小麥種子于菌懸液中浸泡3-4h，以無菌水為對(duì)照。使種子充分吸脹，而后過濾掉菌懸液，用浸潤(rùn)無菌水的紗布蓋在種子表面，使種子保持潮濕環(huán)境，置于25–28℃恒溫培養(yǎng)箱，直到種子露白。
1.4.3蛭石盆栽
蛭石與草炭土以干重質(zhì)量比1:1混勻，澆足水分后，121℃滅菌3h。分裝于72穴聚乙烯育苗盤中，將處理過的種子播種，每穴1粒,播深1cm。將植株置于白天22-25℃、光照16h，夜間15-20℃。每天澆5ml無菌水。第4d、8d和12d接種菌懸液5ml。
小麥根系定殖細(xì)菌數(shù)量計(jì)數(shù)
盆栽15-21d，小心將植株根系全部挖出。抖落根系上附著的土粒，置于分析天平中測(cè)定根的重量。然后，置于組織研磨器中，添加2ml1×pbs緩沖液，研磨至漿狀。采用lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋平板計(jì)數(shù)，計(jì)算每克鮮重小麥根的菌落形成單位數(shù)（總菌數(shù)）。用adf固體培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋平板計(jì)數(shù)，計(jì)算每克鮮重小麥根的菌落形成單位數(shù)（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶產(chǎn)生菌菌數(shù)）。
結(jié)果
2.1液體震蕩培養(yǎng)小麥根系定殖細(xì)菌數(shù)量
從表1可見，沒接菌的無菌水對(duì)照組，在小麥根際沒有檢測(cè)出定殖的細(xì)菌，表明整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程能夠很好地維持無菌條件。接種惡臭假單胞菌uw4，小麥根際可以檢測(cè)出定殖的細(xì)菌，3個(gè)組織培養(yǎng)瓶中小麥根際定殖的細(xì)菌數(shù)之間的變異系數(shù)小于15%，實(shí)驗(yàn)誤差比較小，表明液體震蕩培養(yǎng)植物檢測(cè)根際定殖的pgpr是可行的。
表1液體震蕩培養(yǎng)小麥根際定殖細(xì)菌數(shù)
2.2固體培養(yǎng)小麥根系定殖細(xì)菌數(shù)量
從表2和表3可以看出，盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)比較小，但由于不能做到在無菌條件下操作，未接菌的對(duì)照植物根系污染有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶產(chǎn)生菌和其他細(xì)菌，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。
表2固體培養(yǎng)小麥根際定殖總細(xì)菌數(shù)
表3固體培養(yǎng)小麥根際定殖1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶產(chǎn)生菌菌數(shù)