本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及玉米根螢葉甲特異性ss-coi引物及檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米根螢葉甲diabroticavirgiferavirgiferaleconte，屬鞘翅目、葉甲科、螢葉甲亞科、根螢葉甲屬，是危害玉米的一種世界性毀滅性檢疫害蟲，2007年農(nóng)業(yè)部將其列入中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄。玉米根螢葉甲的寄主植物主要包括禾本科、菊科、葫蘆科以及豆科等，其中以玉米受害最重，也可以危害南瓜、甜瓜、大豆以及大麥和小麥等，但禾本科的高粱并非其適宜寄主。玉米根螢葉甲以成蟲和幼蟲在寄主植物的整個(gè)生長(zhǎng)期進(jìn)行為害，而幼蟲是最主要的為害蟲態(tài)。其中成蟲主要以玉米植株的雌穗花絲、雄穗花穗、花粉、葉片以及玉米的幼嫩籽粒等為食，亦可取食其他植物的花粉和葉片；為害葉片時(shí)成蟲主要取食葉片的上表皮，形成玻璃窗樣半透明斑；授粉期為害雌穗花絲使花穗呈齊頭剪斷狀，影響玉米的授粉和受精，導(dǎo)致結(jié)實(shí)不良。幼蟲主要以玉米的須根和主根或其它寄主植物如大豆、南瓜等的根部為食；初孵幼蟲取食須根，大齡幼蟲鉆入根部組織內(nèi)蛀食為害，不僅影響水分和養(yǎng)分的輸送，形成癟粒造成減產(chǎn)，甚或使植株干枯死亡；此外，幼蟲鉆蛀所形成的傷口還可誘發(fā)病菌侵染，導(dǎo)致植株根部腐爛，引發(fā)植株倒伏，甚至死亡。如若防治不及時(shí)，可造成玉米10-40％甚至高達(dá)90％的產(chǎn)量損失；在歐洲，玉米根螢葉甲每年造成的損失平均為4.72億歐元；在美國，每年可造成大約8億美元的玉米減產(chǎn)損失和2億美元的防治費(fèi)用，并因此被稱為“10億美元害蟲”。

玉米根螢葉甲原產(chǎn)于北美洲南部和中美洲北部，1955年之前主要發(fā)生在美國的中西部地區(qū)，一直是該地區(qū)最重要的玉米害蟲之一。但此后的50年間卻以每年64-80公里的速度迅速向東擴(kuò)展，1985-2005年擴(kuò)散至大西洋沿岸并在北美地區(qū)廣泛分布，發(fā)生區(qū)域主要有美國、加拿大、哥斯達(dá)黎加、危地馬拉、墨西哥和尼加拉瓜等國家。1992年，玉米根螢葉甲首次在歐洲的塞爾維亞首都貝爾格萊德國際機(jī)場(chǎng)附近的田間被發(fā)現(xiàn)，之后在歐洲快速傳播蔓延，目前已在阿爾巴尼亞、奧地利、白俄羅斯、比利時(shí)、波斯尼亞和黑塞哥維那、保加利亞、克羅地亞、捷克共和國、丹麥、愛沙尼亞、芬蘭、法國、德國、希臘、匈牙利、意大利、黑山共和國、荷蘭、波蘭、羅馬尼亞、俄羅斯、塞爾維亞、斯洛伐克、斯洛文尼亞、西班牙、瑞士、烏克蘭、英國等28個(gè)國家嚴(yán)重發(fā)生，使玉米生產(chǎn)遭受了嚴(yán)重打擊，是世界玉米產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性害蟲。目前，我國尚未有玉米根螢葉甲的發(fā)生，因此加強(qiáng)對(duì)玉米根螢葉甲的檢疫檢驗(yàn)，是保障我國玉米產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的首要前提。

玉米根螢葉甲為小型甲蟲類昆蟲，成蟲體長(zhǎng)約5.0-6.0mm；卵長(zhǎng)0.65mm，寬0.45mm，形同美式橄欖球，初產(chǎn)時(shí)為白色，近孵化時(shí)變?yōu)榈S色，肉眼很難發(fā)現(xiàn)。雌性成蟲主要將卵產(chǎn)于大約20cm深的土層當(dāng)中，幼蟲一經(jīng)孵化即自主尋找寄主植物的根部取食須根，齡期大了以后潛入根部組織內(nèi)進(jìn)行取食為害；幼蟲老熟后在土中挖洞化蛹，蛹為白色。而加強(qiáng)檢疫和監(jiān)測(cè)必需建立一套快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法。目前國際上用于玉米根螢葉甲鑒定的方法主要有：1)形態(tài)特征鑒定；2)pcr技術(shù)等。但目前國內(nèi)針對(duì)玉米根螢葉甲尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法。

coi技術(shù)曾用于區(qū)分玉米根螢葉甲的不同地理種群和遺傳分化。mtdnacoi技術(shù)檢測(cè)是利用通用型的引物，在dna聚合酶的催化下，對(duì)目標(biāo)dna進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后將pcr產(chǎn)物回收、純化、測(cè)序，根據(jù)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建來判斷檢測(cè)結(jié)果。ss-coipcr技術(shù)檢測(cè)是在mtdnacoi技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期dna條帶的有無來判斷檢測(cè)結(jié)果，無需測(cè)序和序列比對(duì)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便且重現(xiàn)性好和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為提供一對(duì)玉米根螢葉甲特異性ss-coi引物。

本發(fā)明的另一目的為提供一種玉米根螢葉甲的特異性快速pcr檢測(cè)方法。

本發(fā)明的再一目的為提供一種玉米根螢葉甲的特異性快速pcr檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明根據(jù)玉米根螢葉甲的線粒體dna序列，設(shè)計(jì)一對(duì)種特異性引物，該引物只對(duì)玉米根螢葉甲具有擴(kuò)增能力。是對(duì)玉米根螢葉甲mtdnacoi技術(shù)檢測(cè)方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同時(shí)，本方法采用ss-coipcr技術(shù)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，在玉米根螢葉甲檢測(cè)/監(jiān)測(cè)方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值，可以試劑盒的形式在我國各口岸推廣。

根據(jù)本發(fā)明的一對(duì)玉米根螢葉甲特異性ss-coi引物為：

引物dvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′；和

引物dvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′。

根據(jù)本發(fā)明的玉米根螢葉甲種特異性檢測(cè)方法包括使用上述ss-coi引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的玉米根螢葉甲種特異性檢測(cè)試劑盒包括上述玉米根螢葉甲特異性ss-coi引物。

本發(fā)明的玉米根螢葉甲種特異性ss-coi引物及快速pcr檢測(cè)方法，用于快速檢測(cè)玉米根螢葉甲。與國際現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1)檢測(cè)準(zhǔn)確性高。本方法根據(jù)玉米根螢葉甲種特異性ss-coi標(biāo)記設(shè)計(jì)的引物dvvzce1和dvvzcf1，在pcr快速檢測(cè)玉米根螢葉甲時(shí)，可擴(kuò)增出462bp的片段，不僅對(duì)玉米根螢葉甲的單頭成蟲可以進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于單粒卵、幼蟲和成蟲殘?bào)w包括觸角、頭部、胸部、腹部、前足、后足等也能準(zhǔn)確檢測(cè)。

2)操作簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明采用pcr技術(shù)，操作過程簡(jiǎn)單、快速、高效。一般整個(gè)過程可在3.5個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。

3)特異性強(qiáng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物可特異性檢測(cè)玉米根螢葉甲，在其同域發(fā)生的其他葉甲類害蟲中無擴(kuò)增產(chǎn)物。

因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及害蟲監(jiān)測(cè)/檢測(cè)的需要。

附圖說明

圖1為引物dvvzce1/dvvzcf1對(duì)玉米根螢葉甲以及其他常見葉甲類害蟲的ss-coipcr擴(kuò)增結(jié)果，

m:分子量標(biāo)準(zhǔn)dgl2000；1:玉米根螢葉甲diabroticavirgiferavirgiferaleconte；2:蓮草直胸跳甲agasicleshygrophilaselmanandvogt；3:油菜蚤跳甲psylliodespunctifronsbaly；4:枸杞負(fù)泥蟲lemadecempunctatagebler；5:雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲monoleptahieroglyphica(motschulsky)；6:榆黃毛螢葉甲pyrrhaltamaculicollis(motsch.)；7:褐足角胸葉甲(藍(lán)綠型)basileptafulvipes(motschulsky)biotypeblue-green；8:褐足角胸葉甲(紅棕型)basileptafulvipes(motschulsky)biotypered-brown；9:水(陰性對(duì)照)。

圖2為引物dvvzce1/dvvzcf1對(duì)玉米根螢葉甲卵、幼蟲以及成蟲殘?bào)w的ss-coipcr擴(kuò)增結(jié)果，

m:分子量標(biāo)準(zhǔn)dgl2000；美國種群：1:雌性成蟲(腹部1/4)，2:2齡幼蟲(腹部1/3)；匈牙利種群：雌性成蟲：3:頭部，4:胸部(1/2)，5:腹部(1/3)；6:卵(單粒)；7:前足(1對(duì))，8:后足(1對(duì))，9:觸角(1對(duì))；10:雄性成蟲(腹部1/3)；11:水(陰性對(duì)照)。

圖3為引物dvvzce1/dvvzcf1對(duì)玉米根螢葉甲最低檢測(cè)閾值的測(cè)定，

m:分子量標(biāo)準(zhǔn)dgl2000；1-15:105.2×10³,52.6×10³,26.3×10³,13.15×10³,6.575×10³,3.288×10³,1.644×10³,821.88,410.94,205.47,102.73,51.37,25.68,12.84和6.42pg/μl，相當(dāng)于1/120,1/240,1/480,1/960,1/1920,1/3840,1/7680,1/15360,1/30720,1/61440,1/122880,1/245760,1/491520,1/983040,1/1966080頭雌性成蟲；16:水(陰性對(duì)照)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施實(shí)例1：引物dvvzce1/dvvzcf1對(duì)玉米根螢葉甲的擴(kuò)增效果

1)葉甲類害蟲模板dna的制備

將單頭葉甲類害蟲成蟲的部分組織置于1.5ml的離心管中，提取其dna，然后后每管加入30μl超純水，充分溶解后于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)檢驗(yàn)玉米根螢葉甲的特異性引物的合成

primerdvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′

primerdvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3)pcr擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)體系為25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl、dntp(10mm)0.5μl、taq聚合酶(5u/μl)0.3μl、上游引物和下游引物(10pm)各0.5μl、模板dna2.0μl、超純水18.7μl。

4)pcr擴(kuò)增程序

95℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)：94℃30sec、53℃30sec、72℃40sec；最后72℃延伸7min。

5)pcr產(chǎn)物的鑒定

取5μlpcr產(chǎn)物用含有g(shù)oldview的1.0％(重量/體積)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，然后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。

實(shí)施結(jié)果

利用引物primerdvvzce1/dvvzcf1以玉米根螢葉甲dna為模板，以蓮草直胸跳甲、油菜蚤跳甲、枸杞負(fù)泥蟲、雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲、榆黃毛螢葉甲、褐足角胸葉甲藍(lán)綠型以及褐足角胸葉甲紅棕型等7種/生物型其他常見葉甲類害蟲為對(duì)照進(jìn)行ss-coipcr擴(kuò)增。在1泳道的玉米根螢葉甲中擴(kuò)增出了462bp的目的條帶(見附圖1的1泳道)，在其他7種/生物型葉甲類害蟲中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明我們所篩選的來自玉米根螢葉甲線粒體dna的特異性ss-coipcr擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。

462bp片段的序列：

實(shí)施實(shí)例2：引物dvvzce1/dvvzcf1對(duì)玉米根螢葉甲卵、幼蟲及成蟲殘?bào)w的擴(kuò)增效果

1)玉米根螢葉甲模板dna的制備

將玉米根螢葉甲單粒卵、2齡幼蟲(腹部1/3，美國種群)和成蟲殘?bào)w(包括觸角(1對(duì))、頭部、胸部(1/2)、腹部(雌性：美國種群1/4，匈牙利種群1/3；雄性：匈牙利種群1/3)、前足(1對(duì))、后足(1對(duì)))分別置于1.5ml的離心管中,加入液氮后以研磨棒充分研磨(其中卵和幼蟲加20μl直接研磨)，然后以150μl緩沖液(50mmtris-hcl、lmmedta、1％sds、20mmnacl,ph8.0)分2次清洗研磨棒，混勻，加入5μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混勻后于60℃水浴1h(中途混勻1次)；然后沸水浴8min，加入220μl氯仿/異戊醇(v:v＝24:1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min；4℃、14000r/min離心10min，取上清液約350μl移入另一離心管，加入800μl預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20℃放置30min；4℃、14000r/min離心10min，小心棄去上清液。加入300μl預(yù)冷的75％乙醇洗滌，4℃、14000r/min離心10min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥30min后以40μl超純水復(fù)溶(其中卵、觸角及前足以30μl超純水復(fù)溶)，充分溶解后于-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)檢驗(yàn)玉米根螢葉甲的特異性引物的合成

primerdvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′

primerdvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3)pcr擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)體系為25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl、dntp(10mm)0.5μl、taq聚合酶(5u/μl)0.3μl、上游引物和下游引物(10pm)各0.5μl、模板dna2.0μl、超純水18.7μl。

4)pcr擴(kuò)增程序

95℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)：94℃30sec、53℃30sec、72℃40sec；最后72℃延伸7min。

5)pcr產(chǎn)物的鑒定

取5μlpcr產(chǎn)物用含有g(shù)oldview的1.0％(重量/體積)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，然后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。

實(shí)施結(jié)果

利用引物dvvzce1/dvvzcf1以玉米根螢葉甲的卵、幼蟲以及成蟲殘?bào)wdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。玉米根螢葉甲的成蟲(雌性和雄性)擴(kuò)增出了462bp的目的條帶(見附圖2的1和10泳道)；同時(shí)玉米根螢葉甲的幼蟲，成蟲頭部、胸部、腹部，卵，以及成蟲的前足、后足、觸角等也擴(kuò)增出了462bp的目的條帶(見附圖2的2、3、4、5、6、7、8、9泳道)，說明本發(fā)明的玉米根螢葉甲的種特異性ss-coipcr擴(kuò)增引物的準(zhǔn)確性高。

實(shí)施實(shí)例3：引物dvvzce1/dvvzcf1對(duì)玉米根螢葉甲最低檢測(cè)閾值的測(cè)定

1)玉米根螢葉甲模板dna的制備

將單頭玉米根螢葉甲雌性成蟲(腹部1/3)置于1.5ml的離心管中,加入液氮后以研磨棒充分研磨，然后以150μl緩沖液(50mmtris-hcl、lmmedta、1％sds、20mmnacl,ph8.0)分2次清洗研磨棒，混勻，加入5μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混勻后于60℃水浴1h(中途混勻1次)；然后沸水浴8min，加入220μl氯仿/異戊醇(v:v＝24:1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置30min；4℃、14000r/min離心10min，取上清液約350μl移入另一離心管，加入800μl預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于-20℃放置30min；4℃、14000r/min離心10min，小心棄去上清液。加入300μl預(yù)冷的75％乙醇洗滌，4℃、14000r/min離心10min，小心棄去上清液；然后將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥30min后以40μl超純水復(fù)溶。然后將原模板溶液以2倍進(jìn)行遞減梯度稀釋至1/1966080頭，取2μl作為pcr擴(kuò)增的模板，直接加到pcr反應(yīng)體系中。

2)檢驗(yàn)玉米根螢葉甲的特異性引物的合成

primerdvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′

primerdvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3)pcr擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)體系為25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl、dntp(10mm)0.5μl、taq聚合酶(5u/μl)0.3μl、上游引物和下游引物(10pm)各0.5μl、模板dna2.0μl、超純水18.7μl。

4)pcr擴(kuò)增程序

95℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)：94℃30sec、53℃30sec、72℃40sec；最后72℃延伸7min。

5)pcr產(chǎn)物的鑒定

取5μlpcr產(chǎn)物用含有g(shù)oldview的1.0％(重量/體積)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，然后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。

實(shí)施結(jié)果

利用引物primerdvvzce1/dvvzcf1做最低檢測(cè)閾值的測(cè)定，以不同稀釋倍數(shù)的玉米根螢葉甲線粒體dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，能檢測(cè)到的最低模板dna濃度為102.73pg/μl，相當(dāng)于1/122880頭雌性成蟲(見附圖3)。