專利名稱：：一種人肝臟細(xì)胞色素p450基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種人肝臟細(xì)胞色素P450基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：有機(jī)磷農(nóng)藥是當(dāng)今農(nóng)藥中的主要類別，由于其毒性高、作用范圍廣的特點(diǎn)，一直在國內(nèi)外大量生產(chǎn)和廣泛使用。目前世界上的有機(jī)磷農(nóng)藥商品已達(dá)上百種，我國使用的有機(jī)磷農(nóng)藥有30余種，占我國農(nóng)藥使用量的70%以上。隨著國家對(duì)高毒有機(jī)磷農(nóng)藥(甲胺磷、甲基對(duì)硫磷等)的全面禁止生產(chǎn)、銷售和使用，毒死蜱等中毒性的有機(jī)磷品種被廣泛推廣和大量使用，現(xiàn)已成為世界生產(chǎn)和銷售最大的有機(jī)磷農(nóng)藥之一。有機(jī)磷農(nóng)藥均具有抑制人體乙酰膽堿酯酶的功能，對(duì)人存在著程度不同的毒性，急性中毒可引起人肌肉痙攣、瞳孔收縮、呼吸困難直至死亡。殘留在蔬菜、水果等食品上的低劑量有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人可產(chǎn)生慢性毒性，長期低劑量接觸，可引起遲發(fā)性神經(jīng)疾病，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)突變和致癌作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前食品中農(nóng)藥檢出率高達(dá)90%以上，農(nóng)藥污染超標(biāo)占總產(chǎn)量的17.7%，每年因此而中毒的人數(shù)已達(dá)10萬余人，病死率近20%。毒死蜱(chlorpyrifos)是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷農(nóng)藥，又名樂斯本、白蟻清，化學(xué)名稱為0，0-二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，作為衛(wèi)生殺蟲劑，可以用來防治白蟻、虱子、跳蚤和蟑螂等多種衛(wèi)生害蟲；作為農(nóng)用殺蟲劑，廣泛用于治多種作物上的粘蟲、介殼蟲、蚜蟲和螨類等害蟲。雖然毒死蜱在衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)中廣泛使用，但是其潛在的危害性不容忽視。毒死蜱對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)和腦發(fā)育存在潛在的影響，直接危害到人畜的健康及生命。隨著人們生活質(zhì)量的提高和環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，毒死蜱等有機(jī)磷農(nóng)藥的毒害問題越來越受到人們的關(guān)注，因此迫切需要研究人體參與降解有機(jī)磷農(nóng)藥的機(jī)制，從而為人們的身體健康提供保證。肝臟是藥物和外源毒物代謝的主要組織，人肝臟中的P450是人體內(nèi)的主要降解酶類之一。細(xì)胞色素P450(簡稱P450)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類具有降解功能的血紅素末端氧化酶系，是生物體內(nèi)參與有毒物質(zhì)代謝的主要解毒酶系，肝臟中的P450含量最豐富，且具有重疊的底物專一性。P450還參與代謝除草劑、殺蟲劑、藥物、環(huán)境污染物等多種有毒物質(zhì)。迄今，P450超家族己有480多個(gè)成員，分屬74個(gè)家族，而且不斷有新家族、新成員被發(fā)現(xiàn)。隨著對(duì)P450蛋白組成及結(jié)構(gòu)等生化特征的日益全面闡明，目前關(guān)于P450的研究更多的集中在它所參與的生物體內(nèi)代謝途徑及催化機(jī)制。細(xì)胞色素P450在哺乳動(dòng)物肝、腎等組織中廣泛存在，它們可以通過氧化作用參與外來藥物的代謝和機(jī)體自身激素類化合物的合成。據(jù)報(bào)道，在人體內(nèi)90%以上的藥物是人肝臟里的11種P450蛋白(CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4)代謝的。同時(shí)，許多資料表明肝臟中的P450在有機(jī)磷農(nóng)藥降解也中發(fā)揮著重要的作用。如人肝臟中P450能通過脫硫反應(yīng)將毒死蜱代謝為chlorpyrifos-oxon(CPO)，也可以通過脫芳基反應(yīng)降解毒死蜱。在人淋巴細(xì)胞中表達(dá)人CYP基因發(fā)現(xiàn)，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C19，CYP3A4對(duì)毒死蜱有降解作用，而且肝臟微粒體中CYP2B6，CYP2C19和CYP3A4的相對(duì)含量直接影響到肝臟對(duì)毒死蜱的代謝方式。目前己知資料都表明，利用肝臟中的P450進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥降解具有良好的前景和獨(dú)特的優(yōu)勢。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題在于提供一種人肝臟細(xì)胞色素P450基因，該基因具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥功能，可用于建立有機(jī)磷農(nóng)藥在肝臟中代謝的體外模型以及制備人用有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種人肝臟細(xì)胞色素P450基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。所述人肝臟細(xì)胞色素P450基因第1781737bp為開放讀碼框，編碼520個(gè)氨基酸，其編碼的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。所述人肝臟細(xì)胞色素P450基因應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑的制備。包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體或者其編碼的氨基酸應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑的制備。所述包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)載體是pET32a-P450-DSP國GZ。所述包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因的轉(zhuǎn)化體，其宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的包含P450基因的表達(dá)載體是pET32a-P450-DSP-GZ。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開了一種具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥功能的新的人肝臟細(xì)胞色素P450基因，構(gòu)建包含該基因的表達(dá)載體pET32a-P450-DSP-GZ，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21后得到具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱功能的轉(zhuǎn)化體；目前主要采用DNA重組技術(shù)，建立cDNA文庫直接從人細(xì)胞瘤或者哺乳動(dòng)物肝臟中直接克隆細(xì)胞色素P450基因，這種方法存在試驗(yàn)周期長、工作量大等缺點(diǎn)；與之相比，本發(fā)明利用體外梯度濃度的毒死蜱誘導(dǎo)人肝臟細(xì)胞，經(jīng)過體外誘導(dǎo)后，具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥功能的細(xì)胞色素P450基因得到特異性的表達(dá)，利用mRNA差異顯示技術(shù)分離克隆到的細(xì)胞色素P450基因更具有針對(duì)性，而且克服了構(gòu)建cDNA文庫過程中的困難，大大減輕了工作量，實(shí)驗(yàn)周期短，所需起始材料少，靈敏度高，操作簡便；鑒于P450表達(dá)的多樣性，為了盡可能多的從被誘導(dǎo)的人肝臟細(xì)胞中獲得P450片段，本發(fā)明聯(lián)合使用mRNA差異顯示方法和RACE技術(shù)獲得一系列的P450靶基因，并根據(jù)P450保守的特征序列設(shè)計(jì)上游特異性引物代替隨機(jī)引物，采用該方法可以篩選到幾乎所有表達(dá)的P450基因，并且有利于擴(kuò)增到新的細(xì)胞色素P450基因；本發(fā)明公開的人肝臟細(xì)胞P450基因應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑的制備:1)構(gòu)建包含人肝臟細(xì)胞P450基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)人肝臟細(xì)胞P450基因，用于體外研究有機(jī)磷農(nóng)藥代謝特性及毒理作用；2)對(duì)轉(zhuǎn)染人肝臟細(xì)胞P450基因的轉(zhuǎn)化體所表達(dá)的P450-DSP-GZ蛋白進(jìn)行純化，并以其為抗原進(jìn)一步制備其特異性抗體，用于該基因的表達(dá)量測定，為制備人用有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑奠定基礎(chǔ)；3)檢測人肝臟細(xì)胞P450基因的mRNA的表達(dá)水平，以評(píng)估其他藥物對(duì)人肝臟P450基因表達(dá)的誘導(dǎo)或抑制作用；4)利用該P(yáng)450基因制備轉(zhuǎn)基因植物，獲得具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥功能的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步用于農(nóng)藥污染地區(qū)的土壤凈化。5)用于建立有機(jī)磷農(nóng)藥在肝臟中代謝的體外模型以及制備人用有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑，為研究人肝臟中有機(jī)磷農(nóng)藥的代謝特性及藥物相互作用提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)平臺(tái)。圖1是經(jīng)毒死蜱誘導(dǎo)后人肝臟細(xì)胞總RNA樣品甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；圖2是P450cDNA基因3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3是P450cDNA基因5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4是P450基因最大讀碼框擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5是P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21SDS-PAGE分析結(jié)果圖；圖6是P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的Western-blot分析結(jié)果圖；圖7是轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ的大腸桿菌對(duì)毒死蜱的降解效率曲線具體實(shí)施方式本發(fā)明利用體外濃度梯度的毒死蜱誘導(dǎo)人肝臟細(xì)胞，經(jīng)過體外誘導(dǎo)后，具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥的細(xì)胞色素P450基因得到特異性的表達(dá)，利用mRNA差異顯示技術(shù)克隆到的細(xì)胞色素P450基因更具有針對(duì)性。mRNA差異顯示方法是近幾年來發(fā)展起來的用于研究基因誘導(dǎo)后表達(dá)變化的有效方法。mRNA差異顯示的基本原理為利用一系列的oligo(dT)引物，逆轉(zhuǎn)錄真核生物細(xì)胞中全部表達(dá)的mRNA，通過PCR擴(kuò)增的方法，轉(zhuǎn)換成雙鏈cDNA,再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因。其技術(shù)一般包括下列步驟1)從目時(shí)組織中提取總RNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染；2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以01igoTllMN為引物(M為G、A、C中的任一種，N為A、C、G、T任一種)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；3)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增cDNA的第一條鏈；4)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達(dá)的cDNA片段在6%測序膠上分開；5)找出差異顯示的條帶，從膠上切割下來并回收，進(jìn)行第二次擴(kuò)增；6)對(duì)目的片段進(jìn)行測序；7)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫中篩選出相應(yīng)的全長基因。鑒于P450表達(dá)的多樣性，為了盡可能多的從被誘導(dǎo)的人肝臟細(xì)胞中獲得P450片段，本發(fā)明使用RACE技術(shù)結(jié)合mRNA差異顯示方法獲得一系列的P450耙基因，并根據(jù)P450保守的特征序列設(shè)計(jì)特異性引物代替隨機(jī)引物。RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息。RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3，端和5，端的方法。一7般分5，和3，RACE兩種。3，RACE是首先將mRNA或總RNA用PolyT引物反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)一般基因具有polyA尾巴的特點(diǎn)，選用特異引物(根據(jù)已知序列設(shè)計(jì))和PolyT引物PCR即可。目前有幾種5'RACE，其一為加接頭，根據(jù)接頭引物和設(shè)計(jì)特異引物PCR，可以設(shè)計(jì)巢式PCR二次擴(kuò)增。另外，有利用反向PCR技術(shù)，連接成環(huán)再PCR。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定1、有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱誘導(dǎo)培養(yǎng)人肝臟細(xì)胞人肝臟細(xì)胞培養(yǎng)按照Liddle法[LiddleC,ModeA,LegravendC,efa/.ConstitutiveexpressionandhormonalregulationofmalesexuallydifferentiatedcytochromeP450inprimaryculturerathepatocytes[J].1992,198(2):159-166]，每孔lxl0"2xl(^個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于新鮮的6孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)基中分別加入lml含有毒死蜱(2、4、6、8、10pmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，置二氧化碳培養(yǎng)箱中37"C培養(yǎng)，定時(shí)觀察細(xì)胞的存活率；取10pmol/L毒死蜱誘導(dǎo)36h，且生長旺盛的肝臟細(xì)胞用于RNA提取。2、毒死蜱誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞總RNA提取使用Trizol試劑盒從10pmol/L毒死蜱誘導(dǎo)的人肝臟細(xì)胞中提取總RNA，利用RNA樣品甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳確定所獲得RNA的濃度和完整性，結(jié)果如圖l所示，從電泳結(jié)果可以看出，總RNA的28S和18S條帶均很清晰、完整。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，總RNA的純度(A260/A280)約為1.95，其質(zhì)量能夠保證進(jìn)行下面的mRNA差異顯示和cDNA全長的獲得。3、從毒死蜱誘導(dǎo)培養(yǎng)人肝臟細(xì)胞中克隆P450基因1)人肝臟細(xì)胞P450基因的3'cDNA基因的克?、賑DNA第一鏈的合成取1lpL經(jīng)DNaseI處理過的總RNA，力BlpiLlOpmol/LRACE試劑盒中的接頭引物(AdapterPrime,AP)，70'C溫育10min，冰上冷卻至少lmin。輕微離心后依次加入2pL10XPCRBuffer、2pL25mmol/LMgCl2、ljiL10mmol/LdNTPs和2jiLO.lmol/LDTT混勻，稍離心。于42。C溫育5min后，加入1jliLSuperscriptIIRT混勻，于42。C溫育50min。于70。C溫育15min終止反應(yīng)，置于冰上。稍離心收集反應(yīng)液，力nipLRNaseH，37。C溫育20min，4"C貯存?zhèn)溆谩＂趍RNA差異RT-PCR顯示分析設(shè)計(jì)引物在P450基因的結(jié)構(gòu)中，最保守的部分是跨膜信號(hào)序列和血紅素結(jié)合區(qū)，也是判斷P450的標(biāo)志。根據(jù)GenBank中P450氨基酸保守序列[PFG]設(shè)計(jì)引物上游引物為針對(duì)P450血紅素結(jié)合區(qū)保守的堿基序列設(shè)計(jì)合成特異性引物P:CgCCtttCgg10;下游引物T1為ClonTech試劑盒中的錨定引物，Tl為cattatgctgagtgatatctttttttttgc30;以總RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA第一鏈為模板，以特異性引物P和錨定引物Tl為引物對(duì)毒死蜱誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞中P450基因表達(dá)情況進(jìn)行分析；PCR參數(shù)94。C變性5min,前5個(gè)循環(huán)94°C，30s;40°C，2min;75°C，30s;后35個(gè)循環(huán)94°C，30s;48°C，2min;75°C，30s，72°C5min。PCR擴(kuò)增后，經(jīng)變性凝膠電泳和銀染。由于PFG位于終止密碼子上游100-200bp處，3'-非翻譯區(qū)核苷酸長度一般在100-300bp間，因此PCR產(chǎn)物長度在200-500bp范圍內(nèi)。選取200-500bp之間的條帶，用干凈的刀片將目標(biāo)條帶放入0.5mLEP管中，用吸頭搗碎，加入40pL無菌蒸餾水，12000g離心2min，取2pL上清液進(jìn)行50pLPCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，用干凈的刀片將目標(biāo)條帶切下，利用膠回收試劑盒回收片段。如圖2所示的3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1:為DL20009Marker,從上到下依次為2000，1000,750,500，250,謂bp;泳道2-6:為不同的目的片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，膠回收的電泳結(jié)果。③P450基因片段的篩選參照pGEM-TEasy載體說明書，將回收片段克隆入pGEM-TEasy載體中，轉(zhuǎn)化五."http://感受態(tài)細(xì)胞丁010,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，從平板上挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系同上。對(duì)陽性克隆測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件翻譯成氨基酸。氨基酸序列中含有P450保守序列[PFG]的基因即為P450基因的3'RACE，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，該片段長298bp,編碼區(qū)長163bp，非編碼區(qū)135bp。在poly(A)上有加尾信號(hào)，說明該P(yáng)450cDNA的3'非編碼區(qū)是完整的。2)人肝臟細(xì)胞P450基因5'cDNA基因的克?、俜崔D(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA模板并給cDNA加接頭引物以毒死蜱誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞中總RNA為模板，以AP為引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA,純化反轉(zhuǎn)錄的cDNA。參照5，RACE試劑盒中的加尾反應(yīng)建立體系，給cDNA加接頭引物。具體操作如下DEPC處理過的雙蒸水6.5pL，5x加尾緩沖液5pL，2mMdCTP2.5pL，純化的cDNA10piL。94。C溫育3min，冰上放置lmin，收集產(chǎn)物置于冰上。加入lpLTdT，輕輕混合，37。C溫育10min。65。C溫育10min，離心收集產(chǎn)物，置于4t貯存。②P450基因的5'cDNA基因的克隆及序列測定根據(jù)P450基因的3'RACE的測序結(jié)果，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增P450基因的5，RACE的特異性引物(GeneSpecificPrime,GSP)，其核苷酸序列為-tccaatgcaattcctaggtcca肪cccgaaagg33，同時(shí)結(jié)合RACE劑盒中的通用引物(AbridgedUniversialAmplificationPrime,AUAP)對(duì)加接頭引物的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，10AUAP的核苷酸序列為ggccacgcgtcgactagtac20。PCR擴(kuò)增體系組成為5pL10xPCRBuffer、lpL1Ommol/LdNTPs、3pL25mmol/LMgCl2、引物10jimol/L的GSP和AUAP分別為lpL、5pL，加接頭引物的cDNA模板、2.5UTaq酶，雙蒸水補(bǔ)足50pL。PCR擴(kuò)增程序如下94。C變性5min后，94°Clmin，50°Clmin，72°C15min，完成35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后于72。C延伸5min,冷卻至4'C保存?zhèn)溆谩０凑?'RACE克隆方法，將PCR擴(kuò)增后的片段進(jìn)行回收。如圖3所示的，RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道l:為DL2000Marker,從上到下依次為2000，1000，750，500，250，100bp;泳道2-3:為不同的目的片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，膠回收的電泳結(jié)果。同樣參照pGEM-TEasy載體說明書，將回收片段克隆入pGEM-TEasy載體中，轉(zhuǎn)化￡.^//感受態(tài)細(xì)胞丁010，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，從平板上挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)鑒定確認(rèn)后，對(duì)此陽性克隆進(jìn)行序列測定，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，該P(yáng)4505'RACE片段長1609bp，5'非編碼區(qū)長177bp。測序結(jié)果用DNAMAN軟件翻譯成氨基酸，其序列中包含P450的特征序列[PFG]與3'RACE序列中的[PFG]完全相同，說明SEQIDNO，4就是3，RACE片段的5'端序列。3)P450全序列cDNA的拼接最后根據(jù)3'RACE和5'RACE片段的序列就可拼接出完整的全序列的P450cDNA,其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。4)從cDNA中直接克隆P450基因進(jìn)行驗(yàn)證基于拼接的P450cDNA全序列信息,采用DNAMAN軟件查找分析SEQIDNO.l的最大開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)1781737bp為其最大開放閱讀框，編碼細(xì)胞色素P450的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。重新設(shè)計(jì)代表該cDNA讀碼框的5'末端的上游引物和3'末端的下游引物，RT-PCR直接從反轉(zhuǎn)錄的cDNA的模板中體外擴(kuò)增SEQIDNO.l的編碼區(qū)cDNA。利用來自cDNA全長的序列信息，結(jié)合DNAMAN軟件設(shè)計(jì)合成代表cDNA編碼區(qū)5'最末端的上游引物GSP-5(斜線為XholI酶切位點(diǎn))和3'末端的下游引物GSP-3(斜線為EcoRl酶切位點(diǎn))，其中，GSP-5:ctcgagatgatcaattcaagcgaacaa27;GSP國3:gaattctcagtctaaatctgcaagtcttc29;取反轉(zhuǎn)錄的cDNA的模板2pL，加入5juL10XPCRBuffer、lpL1Ommo/LdNTPs、3pL25mmol/LMgC12、引物1Ojamol/LGSP-5和GSP-3各lpL以及2.5UTaq酶，最后用雙蒸水補(bǔ)足至50pL。擴(kuò)增程序94。C變性5min后，94°Clmin，40。Clmin，75。Clmin，完成30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后于75。C延伸5min,冷卻至4'C保存?zhèn)溆?。膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳結(jié)果如圖4，泳道l:為DL2000Marker,從上到下依次為2000,1000，750，500，250，100bp;泳道2:為PCR擴(kuò)增的SEQIDNO.l的編碼區(qū)cDNA片段。將膠回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并與pGEMT-easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞TOPIO，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，從平板上挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，初步確認(rèn)為陽性克隆后將其測序，測序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行翻譯，并將其與全長拼接序列的編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果所得到的序列與SEQIDNO.l序列的1781737bp完全相同。說明前面獲得的3，RACE和5，RACE片段都來源于SEQIDNO.l序列，并且確認(rèn)獲得了SEQIDNO.l序列編碼區(qū)的cDNA信息。4、P450基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達(dá)1)P450-DSP-GZ原核表達(dá)載體的構(gòu)建用EcoRI、XholI雙酶切測序正確的pGEMT-P450載體，將目的片段連12接到同樣EcoRI、XholI雙酶切的pET32a載體上，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后酶切鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名為pET32a-P450-DSP-GZ。2)P450-DSP-GZ蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pET32a-P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化五.co//BL21，并以pET32a空載體為對(duì)照同時(shí)轉(zhuǎn)化。從被轉(zhuǎn)化的BL21板上挑取單菌落于5mlLB中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜，次日以l:100接種新鮮的LB，培養(yǎng)至OD6QQ約0.4-0.6時(shí)，以終濃度lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h后取樣，離心收集菌體，超聲裂解菌體后，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)情況；電泳結(jié)果如圖5所示，其中泳道1為IPTG誘導(dǎo)的pET32a-P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化菌經(jīng)超聲離心后沉淀；泳道2為IPTG誘導(dǎo)的pET32a-P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化菌經(jīng)超聲離心后上清；泳道3為IPTG誘導(dǎo)的pET32a-P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化菌；泳道4為IPTG誘導(dǎo)的不包含P450-DSP-GZ的空載體轉(zhuǎn)化菌；泳道5為蛋白Marker;泳道1、3與泳道4對(duì)比，在約70kDa處有一特異的條帶，和P450基因編碼區(qū)翻譯的蛋白大小一致。而且在轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ的BL21中，P450基因編碼的目的蛋白P450-DSP-GZ以非可溶的形式得以表達(dá)。3)Western-blot檢測目的蛋白的表達(dá)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上之后，用5°/。的脫脂奶室溫封閉lh，用鼠源性抗His標(biāo)簽單抗作為一抗(表達(dá)載體pET32a是一種融合表達(dá)質(zhì)粒，能在外源蛋白的N端編碼6XHis標(biāo)簽)，4C孵育過夜。次日，再以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育lh，充分漂洗后，DAB顯色；Western-blot結(jié)果如圖6所示，泳道1:IPTG誘導(dǎo)的不包含P450-DSP-GZ的空載體轉(zhuǎn)化菌；泳道2:IPTG誘導(dǎo)的pET32a-P450-DSP-GZ轉(zhuǎn)化菌；泳道3:IPTG誘導(dǎo)的pET32a-DSP-P450-GZ轉(zhuǎn)化菌經(jīng)超聲離心后沉淀；泳道4:IPTG誘導(dǎo)的pET32a-DSP-P450-GZ轉(zhuǎn)化菌經(jīng)超聲離心后上清；泳道5:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；DAB顯色后，可見泳道2、3在P450-DSP-GZ蛋白大小處有一單一條帶，其分子量約70kDa，證實(shí)目的蛋白以非可溶的形式表達(dá)。5、轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ的大腸桿菌對(duì)毒死蜱的降解效率將轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ的大腸桿菌陽性克隆，接種于10mLLB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)過夜；次日以l:IOO的比例接種于ILLB中，37。C培養(yǎng)至菌液OD6oo約0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度lmM，37。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后將100^ig/L的毒死蜱加入到培養(yǎng)液中，37°C160r/min搖床振蕩培養(yǎng)，定時(shí)(6h，12h，24h)取樣，氣相色譜檢測毒死蜱殘留量。包含P450基因的轉(zhuǎn)化體對(duì)毒死蜱的生物降解率計(jì)算公式X=(Cck-Cx)/CckxlOO%;其中，X為毒死蜱的生物降解率；Cck為接種空載體轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)液中毒死蜱的濃度Oig/L);Cx為接種轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)液中毒死蜱的濃度Oig/L)。培養(yǎng)基中毒死蜱的提取2ml培養(yǎng)液至相應(yīng)的刻度試管中，加入4ml氯仿，振蕩器劇烈振蕩2min，吸出上層水相，將氯仿用氮?dú)獯蹈珊?，用正己烷定容，加入無水硫酸鈉，吸凈殘水后檢測。毒死蜱的氣相色譜檢測方法島津GC214B氣相色譜儀，ECD檢測器，色譜柱SPB25石英毛細(xì)管柱(30mx0.53mmx0.1pm)，溫度條件檢測器溫度28(TC，進(jìn)樣口溫度26(TC，采取程序升溫，起始溫度100'C，保持lmin，20。C/min升至210。C，保持2min;載氣為氮?dú)?純度99.99%)，恒壓160kPa，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.4pL。轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ大腸桿菌對(duì)毒死蜱的降解曲線如圖7所示，具體降解率如表1所示空載體轉(zhuǎn)化菌株對(duì)毒死蜱的生物降解率在24h之內(nèi)從2.1%到3.9%之間，基本上對(duì)毒死蜱沒有降解作用，轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ的大腸桿菌對(duì)毒死蜱的降解率在6h時(shí)為27.9%，12h為74.3%，24h的降解效率最高，達(dá)到85.5%，降解效率在一定范圍內(nèi)隨著時(shí)14間延長而增加；與作為對(duì)照的空載體轉(zhuǎn)化菌株相比，轉(zhuǎn)化pET32a-P450-DSP-GZ的大腸桿菌對(duì)毒死蜱的降解能力具有顯著的提高，說明P450-DSP-GZ蛋白的表達(dá)具有明顯的生物活性，證明本發(fā)明提供的人肝臟細(xì)胞色素P450因具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的功能。表1包含P450基因的轉(zhuǎn)化體降解毒死蜱的降解效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>核苷酸序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)<120>—種人肝臟細(xì)胞色素P450基因及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>1872<212>DNA<213>humanhepatiticcell<400>1ggccacgcgtcgactagtacggggggggggg鵬gg犯tcagaaaeggettaaccgcgtt60cgaattcaagccagagaatgacaaat*tcattttcagtgtctcacagctaatgtacagcag120accaaaatttgaaactccgcttattcaaacactgatgettg8ga犯tttatcagcacatg180已tc犯ttcaagcg犯caatccaacetcaaaaactaacatc240agatggctctggtgtgggtggcggtgc也tcgccgtggcggtgctgtacctccgccagg300tctggag犯cagtccataca360gtttggccaggatcctcctcacttcgttaacgatscactgggatattata420acagctctacgttcagttccagtgactctttcttttctag6L犯cttattctctttgg犯g■gtcgcgacattgagctggtgg卿卿tcgctttgaacactttctcgatc540acccattacaatcaatcccaaagatcctcagagaccatcagtacgcttgc600ggca,atgg犯agacatgcgttcgactttcagcccagctttcacaagttccaagatgc660gtaccaacgacgttcaagcctcctgcgcctteggtegtaaggtggactct720ctgcc犯cgacgtatgagcctcctgcgccttcggttcgaaggtggeictct780ctgtgttcttctttattgca3atgcaccta>cagttgeteagstccttc犯ctggatttcc840tttaca3cgagttctacacc3tgggC卿Ctgtcttccaccttcaacttccgtcagatgc900tatgg犯ccaCCtg3t3tC3ttcatttgettatgg犯gctC犯3朋ggtC960aaccggaagcggcgaag犯gtttttcaggaacttcgtccttgataccatcaag肪ccgtg1020agcccgccgtgggacagaaggaaa/ttactagagtgtggactatggaagacctcatcgctc108016aggtcactcatg3gg犯a^tacgtctatatggagaactgctggctttgcgacagttgaag1140aatacgagctggctgtcgaacctgacgtccaggagcgcctggcgcaggagatcaaggaga1200acgcagtattattcttcatcgctggtttcgagaccgtgtcttctggcatgtcgttcctgc1260tgttggttgtgtctgaactgctgcgcctgtggcctcctggggcagcactggacaggatct1320gcaatgcc朋ga^cggcggc3agttcg3cttcaactccatccagaatttgcagtacatgg1380at犯aggcacsggtatcagcataccagcttttgccttccaccgagacccccagttcttcc1440cgactaaggactacaatttgggaaaacctaacgacaaggccaaacatgattttattgtcc1500gcaacccagaaaagttgtaccctgaacggttctccgaggaaaacaagcacaacatccaga1560gctgttgcctacatgcctttcgggtttggacctaggaattgcattggattcctgctcaac1620ttgctactgac肌cagt犯ctgtagatcaaagggaggacactggcttaagggtattacgt1680accagatcctacggcatatggaactgtctccctgtgagaagacttgcagatttagactga1740ggatgt卿ttaag3tgtg3aaatataacttgatgagttggattatttagatttgtataa1800ttttgtaatcaaataaaaatt肪朋ga^tagcttctttc21t3gca犯aagiaaagstatca1860ctcagcataatg1872<210>2<211>520<212>PRT<213>humanhepatiticcell<400〉2MetlieAsnSerSerGluGinSerAsnLeuLysTyrSerArgArgLysGlulieThrAsn15101520lieArgTrpLeuTrpCysGlyTrpArgCysLeuSerProTrpArgCysCysThrSerAla2125303540ArgSerGlyGluLeuAsnLyslieArgProLysSerProTyrLysArgSerlieLysPro4145505560ArgValTrpProGlySerSerSerAsnLyslieThrSerLeuThrlieHisTrpAsplie616570758017lieThrAlaLeuArgSerValProValThrLeuSerPheLeuGluThrTyrSerLeuTrp81859095100LysValAlaThrLeuSerTrpTrpArgArgSerProSerLysThrLeuAsnThrPheSer101105110115120lieThrHisTyrAsnGinSerHislieCysGinLyslieLeuArgAspHisGinTyrAla121125130135140CysGlyLysAsnGlyLysThrCysValArgLeuSerAlaGinLeuSerGinValProArg141145150155160CysValProThrThrPheLysProProAlaProSerValValArgTrpThrLeuThrThr161165170175180LysLeuProThrThrTyrGluProProAlaProSerValArgArgTrpThrLeuThrThr181185190195200LysLeuCysSerSerLeuLeuGinMetHisLeuGinLeuLeuArgSerPheAsnTrplie201205210215220SerPheThrThrSerSerThrProTrpAlaSerCysLeuProProSerThrSerValArg221225230235240CysTyrGlyThrlieSerLeuAspLeulieSerPhelieCysLeuTrpLysLeuLysLys241245250255260ValAsnArgLysArgArgArgSerPheSerGlyThrSerSerLeulieProSerArgThr261265270275280ValSerProProTrpAspArgArgLysLeuLeuGluCysGlyLeuTrpLysThrSerSer281285290295300LeuArgSerLeuMetArgLysLeuArgLeuTyrGlyGluLeuLeuAlaLeuArgGinLeu301305310315320LysAsnThrSerTrpLeuSerAsnLeuThrSerArgSerAlaTrpArgArgArgSerArg321325330335340ArgThrGinTyrTyrSerSerSerLeuValSerArgProCysLeuLeuAlaCysArgSer34134535035536018CysCysTrpLeuCysLeuAsnCysCysAlaCysGlyLeuLeuGlyGinHisTrpThrGly361365370375380SerAlaMetProArgThrAlaAlaSerSerThrSerThrProSerArglieCysSerThr381385390395400TrplieLysAlaGinValSerAlaTyrGinLeuLeuProSerThrGluThrProSerSer401405410415420SerArgLeuArgThrThrlieTrpGluAsnLeuThrThrArgProAsnMetlieLeuLeu421425430435440SerAlaThrGinLysSerCysThrLeuAsnGlySerProArgLysThrSerThrThrSer441445450455柳ArgAlaValAlaTyrMetProPheGlyPheGlyProArgAsnCyslieGlyPheLeuLeu461465470475480AsnLeuLeuLeuThrThrValThrValAspGinArgGluAspThrGlyLeuArgValLeu481485490495500ArgThrArgSerTyrGlylieTrpAsnCysLeuProValArgArgLeuAlaAspLeuAsp501505510515520<210>3<211>298<212>DNA<213>humanhepatiticcell<400>3gcctttcgggtttggacctaggaattgcattggattcctgctcaacttgctactgacaac60agtaactgtagatcaaagggaggacactggcttaagggtattacgtaccagatcctacgg120catatggaactgtctccctgtgagaagacttgcagatttagactgaggatgtagattaag180atgtgaaaatataacttgatgagttggattatttagatttgteitaattttgtaatcaaat240aaaaattaaaagaatagcttctttcatagcaaaaaaaaagatatcsctcagcat3atg298<210>4<211>1609<212>DNA<213>humanhepatiticcell<400>4ggccacgcgtcgactagtacggggggggggggggggaatcag犯acggcttaaccgcgtt60cg^ttc^gacaaatteattttc已gtgtctcacagctastgtacsgc3g120accaaaat11gaaactccgcttattcaaacactgatgcttgaga犯tttatcagcacatg180atcaattcaagcgaacaatccaacctcaaat3tagca^ag^aag犯3taactaacatc240agatggctctggtgtgggtggcggtgcttatcgccgtggcggtgctgtacctccgccagg300tCtggag33Cagtccataca360gtttggccaggatcctcctcacttcgttaacgatacactgggatattata420acagctctacgttcagttccagtgactctttcttttctag犯actt3ttctctttggaag480gtcgcgacattgagctggtgg卿卿tcgccgtc犯agactttgaacactttctcgatc540acccattaca3tC犯tCCC3cataa^gcaaaagatcctcag3g3CC3tC3gtacgcttgc600ggca卿atggaaagacatgcgttcgactttcagcccagctttcac犯gttecaagatge660cgttcaagcctcctgcgcctteggtegtaaggtggactctC8c肪cgaaa720ctgccaacgacgtatgagcctcctgcgccttcggttcgaaggtggactctc3caacgaB3780ctgtgttcttctttattgcacagttgeteagatccttc犯ctggatttcc840tttac犯cgagttctacaccatgggc鄉(xiāng)ctgtcttccaccttcaacttccgtcagatgc900teitgg^cc3t3tca^t3gacctgatatcattcatttgettatggaagctcaaaaaggtc960aaccggaagcggcga卿3gtttttcaggaacttcgtccttgataccatcaagaaccgtg1020agcccgccgtggg3C卿3ggaaattactagsgtgtggacctcatcgctc1080aggtcactcatgaggaaattacgtctatatgg卿actgctggctttgcgacagttgaag1140aatacgagctggctgtcg犯cctgacgtccaggagegectggcgcaggagatcaaggaga1200acgcagtattattcttcatcgctggtttcgagaccgtgtcttctggcatgtcgttcctgc1260tgttggttgtgtctgaactgctgcgcctgtggcctcctggggcagcactggacaggatct132020gcaatgccaagaacggcggcaagttcgacttcaactccatccagaatttgcagtacatgg1380ataaaggcacaggtatcagcataccagcttttgccttccaccgagacccccagttcttcc1440cgactaaggactac犯tttggga犯acctaacgacaaggcc犯acatgattttattgtcc1500gcaacccagaaaagttgtaccctgaacggttctccgaggaaaacaagcacaacatccaga1560gctgttgcctacatgcctttcgggtttggacctaggaattgcattggat16092權(quán)利要求1、一種人肝臟細(xì)胞色素P450基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、如權(quán)利要求1所述的人肝臟細(xì)胞色素P450基因，其特征在于，人肝臟細(xì)胞色素P450基因第1781737bp為開放讀碼框，編碼520個(gè)氨基酸，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3、權(quán)利要求1所述的人肝臟細(xì)胞色素P450基因應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥解毒劑的制備。4、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，用于制備包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)載體或者轉(zhuǎn)化體。5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)載體是pET32a-P450-DSP-GZ。6、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因的轉(zhuǎn)化體，其宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的包含P450基因的表達(dá)載體是pET32a-P450-DSP-GZ。7、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，用于制備包含人肝臟細(xì)胞色素P450基因編碼的氨基酸的有機(jī)磷農(nóng)藥解毒劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種人肝臟細(xì)胞色素P450基因，該基因具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥功能，可用于建立有機(jī)磷農(nóng)藥在肝臟中代謝的體外模型以及制備人用有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑；該基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明還構(gòu)建了包含該基因的表達(dá)載體pET32a-P450-DSP-GZ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后得到具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的轉(zhuǎn)化體，該基因用于建立有機(jī)磷農(nóng)藥在肝臟中代謝的體外模型以及制備人用有機(jī)磷農(nóng)藥解毒制劑，為研究人肝臟中有機(jī)磷農(nóng)藥的代謝特性及藥物相互作用提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)平臺(tái)。文檔編號(hào)C12N15/53GK101659955SQ20091002410公開日2010年3月3日申請(qǐng)日期2009年9月28日優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日發(fā)明者欣呂,敏姚,文尹,健康,敬楊,雷迎峰申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)