專利名稱：腫瘤特異嵌合啟動子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因治療及病毒治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤特異性嵌合啟動子的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴重危及人類的生命健康。目前對惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種 常規(guī)治療對極大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對與極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)依然很 低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療手段通常伴有明顯的毒性作用。因此，研究 選擇性殺滅腫瘤細胞的方法主要依賴于腫瘤細胞的特異性標記，目前腫瘤的靶向性治療已經(jīng)成為 研究的熱點。近年來，隨著生物技術(shù)的腿發(fā)展，腫瘤的基因治療已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。 腫瘤的基因治療包括靶向癌基因及抑癌基因；自殺基因治療；免疫學(xué)基因治療；,性腺病毒 治療。在基因治療中對目的基因的靶向調(diào)節(jié)及溶瘤性腺病毒在腫瘤組織中的復(fù)審糊控對基因治療 的效率和安全性有著重要的意義，也是目前基因治療的挑戰(zhàn)之一。
腫瘤特異性啟動子是一種能在一種或一對中瘤細胞中特異性啟動表達的DNA序列,它已經(jīng)成 為腫瘤基因治療中一種重要的工具。目前，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系歹啲腫瘤特異性啟動子，其中比較理 想的有人端豐鵬轉(zhuǎn)錄酶啟動子(hTERT)、 a-胎蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、CXCR-4啟動子等。 但是這些啟動子大都只針對一種腫瘤細胞，而且在腫瘤細胞中活性都不太高，在實際應(yīng)用中受到 了一定的限制。目前仍需要開發(fā)更加理想的腫瘤特異性啟動子。Survivin啟動子是最近發(fā)現(xiàn)的 一種具有相對廣譜的適用細胞的腫瘤特異性啟動子，已有研究表明，Survivin啟動子在多種腫
瘤細胞中具有較高的活性和很好的特異性，但其活性仍然有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于克服上述腫瘤特異性啟動子的缺點，提供一種提高 Survivin啟動子活性、保留啟動子在腫瘤的特異性、用途廣的腫瘤特異嵌合啟動子。 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于提供一種腫瘤特異嵌合啟動子的構(gòu)建方法。 本發(fā)明所要解決的還有一個技術(shù)問題在于,一種腫瘤特異嵌合啟動子的用途。 解決上述技術(shù)問皿用的技術(shù)方案是由具有核苷酸序列表中N01所示的自序列中1-233 位的任何堿基的W^^啟^Survivin iWlJ與具有核苷酸序列表中N02所示的 序列中1-62位的任IS]^的miniCMV序列鄉(xiāng)鵬，其M^f寺異啟軒Survivin序歹i旌5'端，miniCMV序歹i旌3' 端，其序列具有核苷酸序列表中N03所示的MS序列中卜313位的任何堿基為
GCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATMGCAGAGCTCGTTTAGTGMCCGTCAGATCTCATCGAT。
本發(fā)明的核苷酸序列表中N01所示的堿基序列中1-233位的任何堿基的腫瘤特異啟動子 Survivin序歹!j為
GCCGCGGGGGGTGGACCGCCTMGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTMCCG。
本發(fā)明的核苷酸序列表中N02所示的MS序列中1-62位的任何MS的miniCMV序列為
GTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTC。 上述的腫瘤特異嵌合啟動子的構(gòu)建方法，由下述步驟組成
1、 克隆Survivin序歹!j
采取人外周血，采用微量基因組DNA極速抽提試劑盒并采用試劑盒相應(yīng)方法提取人基因 組DNA，并設(shè)計針對Survivin序列的引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)進行擴增，獲得Survivin序列， 通過質(zhì)量濃度為1. W。瓊脂糖電泳回收、連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定獲得Survivin序列的陽性克隆，菌 種-8(TC保存，并將相應(yīng)的載體中量提取DNA保存在-2(TC 。
2、 構(gòu)建腫瘤特異性嵌合啟動子
將Survivin序列的陽性克隆經(jīng)酶切、質(zhì)量濃度為1. 0%瓊脂糖電泳回收、連接到一個含有多 克隆位點及SV40polyA的載體中，命名為pEML-Survivin。通過設(shè)計合成得到的含有miniCMV 序列的linker,室溫退火4小時，合成含有miniCMV序列的linker片段，并連接到經(jīng)Xbal與 Clal酶切后的pEML-Survivin載體中，再通過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取以及鑒定，獲得腫瘤特異性嵌合 啟動子。
腫瘤特異嵌合啟動子在表達小干擾RNA中的用途。
腫瘤特異嵌合啟動子在構(gòu)建條件復(fù)制型腺病毒載體中的用途。
腫瘤特異嵌合啟動子在表達腫瘤治療基因中的用途。
本發(fā)明提供一種適用該腫瘤特異嵌合啟動子的腫瘤細胞模型，所述嵌合啟動子包括腫瘤特異性Survivin啟動子部分序列和miniCMV序列，腫瘤細胞模型為惡性膠質(zhì)母細胞瘤，該嵌合啟動子在U87細胞系有很好的特異性和非常強的啟動子活性。在惡性^M母細胞瘤基因治療中具有重要的意義。本發(fā)明通過比較發(fā)現(xiàn)該新型啟動子具有腫瘤特異性，且比親本Survivin啟動子活性強，可用于斜牛復(fù)制型腺病毒載體的制備、腦腫瘤的基因治療、表達小干擾RNA、腫瘤基因治療。


圖1是Survivin核心序列的質(zhì)粒鑒別圖。
圖2是腫瘤特異性啟動子的質(zhì)粒鑒別圖。
圖3是腫瘤特異性啟動子表達綠色熒光蛋白的載體圖譜。
圖4是腫瘤特異性啟動子在腫瘤細胞中的活性檢測圖。
圖5是腫瘤特異性啟動子在腫瘤細胞中的特異性檢測圖。
圖6是腫瘤特異性嵌合啟動子表達擴增腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體的載體圖譜。圖7是表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動子的條件復(fù)制型腺病毒載體的載體圖譜。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1
以腫瘤特異嵌合啟動子為例其構(gòu)建方法步驟如下1 、 克隆Survivin序歹廿
釆取人外周血，采用飛捷生物試劑公司的微量基因組DNA tM抽提試劑盒并采用試劑盒相應(yīng)方法提取人基因組DNA。并設(shè)計針對Survivin的特異啟動子部分序列的弓l物如下
Survivin PI: Xhol ACTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCP2: Xbal ATCTAGACGGTTMTGGCGCGCCGC
ffi31聚合,式反^a行擴增，聚合酶鏈式反應(yīng)體積為lOXPCRbuffer、 1WP1、P2、 0. LA Taq、 Genomic DNA、 10mM dNTPs、 40. 5l4三蒸水。聚合酶鏈式反應(yīng)擴增條件94 。C、 5倂中,94 。C、 l分鐘，55 。C、 l射中，72 。C、 1射中，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為30次。獲得Survivin的特異啟動子部分序列，其DNA序列為
CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCT
CAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTMGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTMCCGTCTAGA。聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)濃度為1%瓊脂糖電泳純化回收。并與pGEMT-easy載體經(jīng)T4連接酶14.5 。C連接過夜，連接^#是2W酶切純化片段，1P110XT4連接酶緩沖液，M酶切載體，T4連接酶，三蒸水。然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a并涂布于含有100 Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板中。16 24小時后，挑取菌落，接種到100Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，225rpm振蕩培養(yǎng)過夜，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)EcoRI酶切及測序鑒定。如圖1所示，M代表DNA分子量，1-10代表質(zhì)粒DNA，其中除8號其余均為陽性克隆。獲得陽性克隆命名為pGEm-Survivin。將菌種-8(TC保存，并將相應(yīng)的載體中量提取DNA保存在-20。C。
2.構(gòu)建腫瘤特異嵌合啟動子
將pGEMT-Survivin在37。C條件下，經(jīng)XhoI與XbaI雙酶切后，經(jīng)質(zhì)量濃度為1. 0%瓊脂糖電泳回收純化后連接到到一個含有多克隆位點及SV40 poly A的載體中，命名為pEAAL-Survivin。通過設(shè)計得到的含有CMV啟動子的核心區(qū)域miniCMV的linker的序列并送公司(上海生工)合成，合成產(chǎn)物濃度配第喊2歸，將相對應(yīng)的引物各取15W，混合后，在室溫退火4小時從而合成含有miniCMV的linker片段。其DNA序列為TCTAGAGTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATMGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTCATCGAT
將合成的含有miniCMV的linker,通^接酶14. 5 。C過夜連接到并連接到經(jīng)Xbal與Clal酶切后的Survivin啟動子核心序列的3'端，連接割牛是2ri酶切純化片段，10X T4連接酶緩沖液，酶切載體，T4連接酶，三蒸水。經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a后，并涂布于含有IOO Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板中。挑取菌落，接種到100Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，225rpm振蕩培養(yǎng)過夜，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，由此獲得腫瘤特異嵌合啟動子。其DNA序列為
CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCT
GCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGMCCGTCAGATCTCATCGATo
Survivin啟動子核心部分在5，端，CMV啟動子的核心區(qū)域miniCMV在3，端。經(jīng)XhoI和Clal雙酶切及測序鑒定后，如圖2所示，M代表DNA分子量，11-15代表質(zhì)粒DNA，鑒定均為陽性克隆，命名為pSurvivin-miniCMV。
3.構(gòu)劍中瘤特異嵌合啟動子表達鄉(xiāng)絶熒光蛋白的載體
M;聚合酶鏈式反應(yīng)擴增綠色熒光蛋白基因，聚合酶鏈式反應(yīng)擴增剝牛:94X:、5射中，94'C、
7l分鐘，55°C、 l分鐘，72°C、 l倂中。4柳伯樂聚合酶鏈式反應(yīng)擴增儀，30個循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)質(zhì)量濃度為W瓊脂糖電泳純化回收后與pGE肌-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 a后，并涂布于含有IOO Mg/ml的氨卡青霉素的LB平板中。挑取菌落，接種到100Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，225rpm振蕩培養(yǎng)過夜，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆經(jīng)過ClaI和SpeI雙酶切與同樣的酶切處理的pSurvivin-miniCMV載體連接，獲得的載體稱之為pSurvivin-miniCMV-eGFP，載體圖譜見圖3。
4、 腫瘤特異嵌合啟動子在腫瘤細胞中的活性檢測
轉(zhuǎn)染前1天，將U87細胞、Hela細胞以及A549細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24孑L板中，每孑lifflM5[為別是1X1()5個。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM進行轉(zhuǎn)染，即在一個1.5ml的Eppendorf管中加入50W0PTI-MEM,再加入質(zhì)粒DNA，混勻后作用5射中；在另一個1.5ml的Eppendorf管中加入的脂質(zhì)體，混合后作用5分鐘，將DNA管中的溶液加入脂質(zhì)體管中，混勻后作用20射中,將混合物加入到含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24 L板中，4小時后換液，加入含有1TO胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基，24小時后，檢測纟tfe熒光蛋白表達量。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒分別為pSurvivin-miniCMV-eGFP和pCMV-eGFP，質(zhì)粒DNA用量均為0. 26Mg，每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個復(fù)孔，其中pCMV-eGFP作為陽性對照。在圖4中，16為CMV啟動子在3種腫瘤細胞中表:!i^色熒光蛋白，17為腫瘤特異嵌合啟動子在3種腫瘤細胞中表達綠色熒光蛋白，結(jié)果顯示，腫瘤特異嵌合啟動子在多種腫瘤細胞中均具有活性，尤其在U87細胞中，活性較高。
5. 腫瘤特異嵌合啟動子在腫瘤細胞中的特異性檢測
轉(zhuǎn)染前1天，將239細胞、EVC304細胞、A549細胞、Hela細胞、Shsy5y細胞以及U87細胞接種矜有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24 L板中，每孔細胞數(shù)為別是1X 105個。采用脂質(zhì)體Lipof ectamine 2000TM進行轉(zhuǎn)染，即在一個1. 5ml的Eppendorf管中加入5(M OPTI-MEM,再加入質(zhì)粒DNA，混勻后作用5射中；在另一個1. 5ml的Eppendorf管中加入的脂質(zhì)體，混合后作用5辦中，將DNA管中的溶液加入脂質(zhì)體管中，混勻后作用20射中，最后將混合物加入到含有1TO胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24 L板中，4小時后換液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基，24小時后，檢測綠色熒光蛋白表達量。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒是pSurvivin-miniCMV-eGFP，質(zhì)粒用量均為0.26Mg，每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個復(fù)孔。如圖5所示，腫瘤特異嵌合啟動子在6種腫瘤細胞中表達綠色熒光蛋白，結(jié)果顯示，293細胞，EVC304細胞中，綠色熒光蛋白的表達量很低。而A549細胞、Hela細胞、Shsy5y細胞、U87細胞，綠色熒光蛋白的表達量較高，說明腫瘤特異嵌合啟動子在腫瘤細胞中具有特異性。
8實施例2
以腫瘤特異性嵌合啟動子表達擴增腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Trail)載體為例，其
構(gòu)建方法步驟如下
1、 克隆Survivin序列
克隆Survivin的特異啟動子部分序列的步驟與實施例1相同，獲得Survivin的特異啟動子部分序列。
2、 構(gòu)建腫瘤特異嵌合啟動子
構(gòu)建新型腫瘤特異性嵌合啟動子Survivin-miniCMV與實施例1相同，獲得腫瘤特異嵌合啟動子。
3、 構(gòu)劍巾瘤特異性嵌合啟動子表達腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體的載體利用聚合酶鏈式反應(yīng)的方法擴增腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體基因。聚合酶鏈式反應(yīng)擴
增^j牛94 。C、 5射中，94 。C、 30秒，55 。C、 30秒，72 。C、 1射中。4頓伯樂聚合酶鏈式反應(yīng)擴增儀，30個循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a后，并涂布于含有100 Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板中。挑取菌落，接種到100Mg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，225 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆經(jīng)過ClaI和SpeI雙酶切后與同樣的酶切處理后pSurvivin-miniCMV載體連接，獲得的載體稱之為pSurvivin-miniCMV-Trail,載體圖譜見圖6。實施伊J3
構(gòu)劍中瘤特異性嵌合啟動子表達E1A基因，并且E4-fiber區(qū)同時表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA (siHecl )的^j牛復(fù)制型腺病毒載體。
1、 克隆Survivin序列
克隆Survivin的特異啟動子部分序列的步驟與實施例1相同，獲得Survivin的特異啟動子部分序列。
2、 構(gòu)^中瘤特異性嵌合啟動子
構(gòu)建腫瘤特異性嵌合啟動子與實施例1相同，獲得腫瘤特異性嵌合啟動子。
3、 構(gòu)建腫瘤特異性嵌合啟動子表達E1A的穿梭載體
將腫瘤特異性嵌合啟動子從pSurvivin-miniCMV上經(jīng)Kpnl和Xhol雙酶切下來，經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用Kpnl和Xhol雙酶切處理的含有腺病毒El片段的穿梭載體進行連接。連接^K牛是2W酶切純化片段，1W10X T4連接酶緩沖液，酶切載體，連接酶，5.5W三蒸7K。連接產(chǎn)物釆用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5-Survivin-miniCMV-ElA。此載體為獲得的腫瘤特異性嵌合啟動子表達E1A的穿穿梭載體。
4、 構(gòu)建Ad5 E1A區(qū)插入月中瘤特異性嵌合啟動子的腺病毒載體骨架
將Seal與Spel線性化的pAd5-Survivin-miniCMV-ElA穿梭載體與Clal線性化腺病毒骨架載體pTG3602/Swal按照摩爾比3:1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BJ5183，將菌液涂布在含有100 u g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，16 24小時后，挑取菌落，接種到100ug/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為腫瘤特異性嵌合啟動子表達E1A的腺病毒載體骨架，命名為pAd5-Survivin-miniCMV-ElA/Swal載體。
5、 構(gòu)建表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腺病毒E4-fiber穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨節(jié)抗性基因的開放讀碼讀框(ORF)的兩端通過基因突變的方式
產(chǎn)生兩個單一的酶切位點(Xbal及SfuI)，將卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位點中，所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-HindIII linker (EcoRI Pad Swal Spel HindIII)連接，所獲得的載體命名為pUCKanEHL。聚合酶鏈式反應(yīng)擴增位于Ad5 E4區(qū)3'端上游約2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有Pacl與Swal位點，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點中，由此得到的載體稱為pshuUle Ad5E4-3'。采用聚合酶鏈式反應(yīng)方法擴增Ad5纖維蛋白3'端上游約2. Okb的片段謹因片段兩端分別含有Swal與Spel位點)。將此片段克隆到pshuttle Ad5-E4-3'載體相應(yīng)的酶切位點中，所獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber。
艦聚合酶鏈式反應(yīng)方法擴增U6-siHecl表達元件，聚合,式反應(yīng)擴增^K牛是94 °C、 2分鐘，94 。C、 50秋55 。C、 30秋72 。C、 40秒,30個循環(huán)。聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊S識電泳后回收聚合,式反應(yīng)片段，將聚合H^式反應(yīng)片段與PGEM-T easy載體連接。連接^f牛是2ri酶切純化片段，1W10X T4連接酶緩沖液，M酶切載體，T4連接酶，5.514三蒸水，16。C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5a細胞，并涂布于含有100 Mg/ml的氨芐青霉素的LB平板中，挑取菌落接種到含有100 Mg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/ U6- siHecl。將U6- siHecl片段從pGEMT/ U6- siHecl上經(jīng)Clal和Notl雙酶切后經(jīng)末端補平后與用Swal酶切處理的腺病毒E4 fiber區(qū)穿梭載體進fi^接。連接^K牛是:2W酶切純化片段，10XT4連接酶緩沖液，1W酶切載體，T4連接酶，5. 三蒸水。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為 pshut 11 eAd5-E4-f i ber- s i Hec 1 <>
6、 構(gòu)建表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動子的^j牛復(fù)制型腺病 毒載體
用Pacl線性化的表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腺病毒E4-f iber穿梭載體與Swal 線性化的腫瘤特異性嵌合啟動子表達E1A的腺病毒載體骨架按摩爾比3: l共轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183， 然后通過酶切及測序獲得陽性克隆，所得到的載體稱為pAd5-Survivin-miniCMV-ElA-siHecl。 表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動子的條件復(fù)制型腺病毒載體見 圖7。
7、 獲得表達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動子的斜牛復(fù)制型腺病 毒載體
采用磷酸鈣法將PacI線性化的達針對癌癥高表達蛋白的小干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動 子的條件復(fù)制型腺病毒載體pAd5-Survivin-miniCMV-E1A-siHecl轉(zhuǎn)染HEK 293 Val細胞系。經(jīng) 過7~10天后，可見明顯的細胞病變，然后經(jīng)過離心收獲病毒原液，經(jīng)過2 3輪的病毒擴增后， 進一步將所獲得的病毒原液感染10個150cm的細胞培養(yǎng)平皿，從而擴增獲得足夠量的病毒原液 用于后續(xù)的進一步純化。感染的病毒的細胞經(jīng)過反復(fù)凍融3次(37'C/酒精干冰)后經(jīng)3500轉(zhuǎn)/ 分鐘離心15分鐘，ffl3l兩次氯化銫密度梯度超速離心，獲得純化的達針對癌癥高表達蛋白的小 干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動子的條件復(fù)制型腺病毒載體。將所獲得表達針對癌癥高表達蛋白 的小干擾RNA的腫瘤特異性嵌合啟動子的剝牛復(fù)制型腺病毒載條-8(TC的冰箱內(nèi)保存。核苷酸序列表 〈110>陜西師范大學(xué)
〈120〉腫瘤特異嵌合啟動子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用 <160> 3
<210> 1 〈211〉 233 <212> DNA <213〉人 <220>
〈221> misc一recomb <400〉 1
CCCGGCCTGC ACGCGTTCTT TGAAAGCAGT CGAGGGGGCG CTAGGTGTGG 50 GCAGGGACGA GCTGGCGCGG CGTCGCTGGG TGCACCGCGA CCACGGGCAG 100 AGCCACGCGG CGGGAGGACT ACAACTCCCG GCACACCCCG CGCCGCCCCG 150 CCTCTACTCC CAGAAGGCCG CGGGGGGTGG ACCGCCTMG AGGGCGTGCG 200 CTCCCGACAT GCCCCGCGGC GCGCCATTAA CCG 233
〈210〉 2 〈211〉 62 〈212〉醒 〈213〉人工合成 〈220〉
〈221> misc一recomb <400〉 2
GTAGGCCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA 50 CCGTCAGATC TC 62<210〉 3 <211〉 313 <212> DNA <213>人工合成 〈220〉
<221〉 misc一recomb 〈400〉 3
CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGMAGCAGTCGAGGGGGCGCTAG50
GTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCTGGGTGCACCGCGACCAC100
GGGCAGAGCCACGCGGCGGGAGGACTACMCTCCCGGCACACCCCGCGCC150
GCCCCGCCTCTACTCCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTMGAGGG200
CGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGTCTAGAGTAGG250
CCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATMGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTC300
AGATCTCATCGAT31權(quán)利要求
1、一種腫瘤特異嵌合啟動子，其特征在于由具有核苷酸序列表中NO1所示的堿基序列中1-233位的任何堿基的腫瘤特異啟動子Survivin序列與具有核苷酸序列表中NO2所示的堿基序列中1-62位的任何堿基的miniCMV序列組成，其腫廇特異啟動子Survivin序列在5’端，miniCMV序列在3’端，其序列具有核苷酸序列表中NO3所示的堿基序列中1-313位的任何堿基為CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCTGGGTGCACCGCGACCACGGGCAGAGCCACGCGGCGGGAGGACTACAACTCCCGGCACACCCCGCGCCGCCCCGCCTCTACTCCCAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGTCTAGAGTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTCATCGAT。
2、 按照權(quán)利要求1所述的腫瘤特異嵌合啟動子，其特征在于所說的核苷酸序列表中N01所示的 序列中1-233位的樹可堿基的腫瘤特異啟動子Survivin序列為CCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAMGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCTGGGTGCGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTMCCG。
3、 按照權(quán)利要求l所述的腫瘤特異嵌合啟動子，其特征在于所說的核苷,列表中N02所示的 序列中1-62位的ftM堿基的miniCMV序列為GTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATMGCAGAGCTCGTTTAGTGMCCGTCAGATCTC。
4、 一種腫瘤特異嵌合啟動子的構(gòu)建方法，其特征在于它是由下述步驟組成(1) 克隆Survivin序列采取A^卜周血，采用微量基因組DNA極速抽提試劑盒并采用試劑盒相應(yīng)方法提取人基因組DNA，并設(shè)計針對Survivin序列的弓嫩，通過聚合酶鏈式反，行擴增，獲得Survivin序列，通過質(zhì)量濃度為l.(m瓊脂糖電泳回收、連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定獲得Survivin序列的陽性克隆，菌種-80。C保存，并將相應(yīng)的載體中量提取DNA保存在-2(TC;(2) 構(gòu)劍中瘤特異性嵌合啟動子將Survivin序列的陽性克隆經(jīng)酶切、質(zhì)量濃度為1.0%瓊脂糖電泳回收、連接到一M有多克隆位點及SV40polyA的載體中，命名為pEAAL-Survivin。通過設(shè)計合成得到的含有miniCMV序列的linker,室溫退火4小時，合成含有miniCMV序列的linker片段，并連接到經(jīng)Xbal與Clal酶切后的pEML-Survivin載體中，再通過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取以及鑒定，獲得腫瘤特異性嵌合啟動子。
5、 權(quán)利要求1腫瘤特異嵌合啟動子在表達小干擾RNA中的用途。
6、 權(quán)利要求1腫瘤特異嵌合啟動子在構(gòu)建^f牛復(fù)制型腺病毒載體中的用途。
7、 權(quán)利要求1腫瘤特異嵌合啟動子在表達腫瘤治療基因中的用途。
全文摘要
一種腫瘤特異嵌合啟動子，由具有核苷酸序列表中NO1所示的堿基序列中1-233位的任何堿基的腫瘤特異啟動子Survivin序列與具有核苷酸序列表中NO2所示的堿基序列中1-62位的任何堿基的miniCMV序列組成，其腫瘤特異啟動子Survivin序列在5’端，miniCMV序列在3’端，其序列具有核苷酸序列表中NO3所示的堿基序列中1-313位的任何堿基。其構(gòu)建方法由克隆Survivin序列及構(gòu)建腫瘤特異性嵌合啟動子兩個步驟組成。腫瘤特異嵌合啟動子在表達小干擾RNA或構(gòu)建條件復(fù)制型腺病毒載體或表達腫瘤治療基因中的用途。
文檔編號C12N15/11GK101649319SQ20091002384
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者夏海濱, 張偉鋒, 王東陽, 趙俊麗, 鄭曉晶 申請人:陜西師范大學(xué)