專利名稱：：啟動子afb4及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及啟動子AFB4及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：啟動子按其作用方式和功能可以分為三類組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動子在所有組織中都能啟動表達(dá)，有表達(dá)的持續(xù)性，沒有時空特異性，如CaMV35S啟動子等。該類啟動子得到了大量研究和應(yīng)用，在基因工程中發(fā)揮重要作用。但由于其表達(dá)不分時空，會導(dǎo)致外緣基因表達(dá)的過量積累，會影響植物正常的生長發(fā)育。因此，尋找誘導(dǎo)型或組織特異性的啟動子，對于基因功能研究和轉(zhuǎn)基因育種都具有重要作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種具有特異表達(dá)啟動子功能的DNA片段。本發(fā)明所提供的DNA片段，為如下1)、2)或3)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。擴(kuò)增上述任一所述DNA片段全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列2所示，另一條引物序列如序列表中序列3所示。含有上述任一所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述DNA片段在使目的基因在植物的側(cè)根產(chǎn)生處和/或植物的葉鋸齒邊緣處表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述側(cè)根產(chǎn)生處為主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處。上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物。上述應(yīng)用中，所述雙子葉植物為擬南芥。上述任一所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥。實(shí)驗證明，本發(fā)明的AFB4DNA片段是一啟動子，且該啟動子有很強(qiáng)的特異表達(dá)活性，特異的在植物的側(cè)根產(chǎn)生處(主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處)和葉的鋸齒邊緣處表達(dá)。本發(fā)明啟動子為特異表達(dá)的基因功能研究和植物的轉(zhuǎn)基因育種提供了有利工具，具有重要意義。圖1為PCR擴(kuò)增得到AFB4的啟動子。圖2為表達(dá)載體的酶切鑒定。圖3為P-AFB4-1391-⑶S載體示意圖。圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定。圖5為AFB4啟動子的GUS活性。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、啟動子的制備及特異表達(dá)驗證一、啟動子的制備及確認(rèn)1、擬南芥基因組DNA的提取(1)取擬南芥葉片，加入液氮，充分研磨后，將粉末倒入1.5ml離心管中；(2)待離心管中液氮揮發(fā)完全后，立即加入500ulDNA提取緩沖液(0.Imol/LTris‘HCl(pH8.0),0.5mol/LNaCl,0.05mol/LEDTA,0.5%SDS)，充分混勻后，65°C保溫30分鐘，期間不斷溫和上下顛倒離心管，使樣品與緩沖液充分混合；(3)以12，OOOrpm室溫離心15分鐘；(4)將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管；(5)加入等體積tris-酚，抽提一遍；(6)再用等體積的氯仿抽提一遍；(7)取上清，加入等體積異丙醇，輕柔晃動離心管，使異丙醇與上清液充分混勻，-20靜置10分鐘，以12，OOOrpm離心10分鐘；(8)用70%的乙醇洗劑，DNA沉淀在超凈工作臺吹干后，用滅菌雙蒸水溶解備用。2、PCR擴(kuò)增以擬南芥基因組DNA為模板，用引物對Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下Pl:ACTGCAGCTGACTCACTAAGTCGTCCAT(序列2)，P2TGGATCCCTCTGACTTTGATCTTATCCA(序列3)，反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>PCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示(M=Marker；-:PCR空白對照；P:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)?；厥漳康臈l帶。將目的產(chǎn)物與載體EZ-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選培養(yǎng)，挑取單克?。粚慰寺〗臃N于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行測序。測得的序列如SEQUENCEID:1所示，將得到的陽性重組質(zhì)粒記作P-AFB4-EZ-T，將SEQUENCEID:1所示的DNA片段記作AFB4。載體EZ-T購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為T168-10。二、啟動子的組織特異性驗證pCAMBIA1391Z購自CAMBIA(澳大利亞)。農(nóng)桿菌菌株AGLlATCCNo.BAA-101購自ATCC。(一)轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶消化P-AFB4-EZ-T，回收約2000bp的目的片斷，同時用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶消化表達(dá)載體pCAMBIA1391Z，回收載體片斷，然后將目的片斷和載體片斷進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選培養(yǎng)，挑取單克??；將單克隆接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序驗證。酶切結(jié)果如圖2所示(M=Marker；1酶切產(chǎn)物)，測得pCAMBIA1391Z的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQUENCEID1所示，表明構(gòu)建的載體正確，將得到的陽性重組表達(dá)載體記作P-AFB4-1391Z。該載體中⑶S只受AFB4—個DNA片段調(diào)控，不受任何其它啟動子調(diào)控(圖3)。用電轉(zhuǎn)化方法將重組表達(dá)載體P-AFB4-1391Z導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株AGLl中，抗性篩選，得到陽性重組農(nóng)桿菌，記作AGL1/P-AFB4-1391Z。通過農(nóng)桿菌侵染花序的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化得到的種子鋪在含有潮霉素抗性的培養(yǎng)基上篩選，得到的陽性苗子為TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥。同時將空載體pCAMBIA1391Z轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株AGLl，得到陽性重組農(nóng)桿菌，記作AGLl/pCAMBIA1391Z。用重組農(nóng)桿菌AGLl/pCAMBIA1391Z轉(zhuǎn)化擬南芥，得到TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。(二)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定PCR鑒定以TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA為模板，用引物P1/P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。以重組表達(dá)載體P-AFB4-1391Z為PCR陽性對照。Pl:ACTGCAGCTGACTCACTAAGTCGTCCAT(序列2)，為AFB4的特異引物；P4GGGTCCTAACCAAGAAAATGA,為GUS的特異引物；結(jié)果如圖4所示。圖中，1、2、3表示轉(zhuǎn)基因擬南芥，+表示PCR陽性對照，-表示轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1391Z擬南芥。結(jié)果，獲得20株轉(zhuǎn)基因擬南芥苗子。(三)轉(zhuǎn)基因擬南芥中啟動子的特異表達(dá)取TO代轉(zhuǎn)基因擬南芥生長15天的幼苗進(jìn)行⑶S染色。結(jié)果⑶S活性主要存在兩個位置，一是側(cè)根產(chǎn)生處(進(jìn)一步觀察是在主根與側(cè)根結(jié)合處的維管柱處)，二是葉片的鋸齒邊緣。同時以轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1391Z擬南芥作為陰性對照。具體方法是將整個擬南芥幼苗加入染色液(50mM磷酸緩沖液；5mM鐵氰化鉀；5mM亞鐵氰化鉀；IOmMEDTA；ImMX-gluc)中，37°C保溫過夜，用70%乙醇脫色2-3次，至陰性對照材料呈白色，顯微鏡觀察，白色背景下的藍(lán)色即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。20株陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥均進(jìn)行⑶S染色。結(jié)果如圖5所示。白色箭頭所指為⑶S染色位置。結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，GUS活性均集中在側(cè)根產(chǎn)生處(主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處)和葉的鋸齒邊緣；而轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1391Z擬南芥中均未見著色。該結(jié)果說明，本發(fā)明的AFB4DNA片段是一啟動子，啟動了GUS的表達(dá)，且該啟動子有很強(qiáng)的特異表達(dá)活性，特異在主根與側(cè)根結(jié)合的微管柱處和葉片鋸齒邊緣中高表達(dá)，對于將來的轉(zhuǎn)基因育種具有重要意義。權(quán)利要求一種DNA片段，為如下1)、2)或3)所示1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述DNA片段全長或其任意片段的引物對。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對，其特征在于所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列2所示，另一條引物序列如序列表中序列3所示。4.含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。5.權(quán)利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物的側(cè)根產(chǎn)生處和/或植物的葉鋸齒邊緣處表達(dá)中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用，其特征在于所述側(cè)根產(chǎn)生處為主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。9.權(quán)利要求1中所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥。全文摘要本發(fā)明公開了啟動子AFB4及其應(yīng)用。該啟動子是如下1)、2)、3)或4)所示DNA片段1)序列表中序列1所示的DNA片段；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；3)與1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。實(shí)驗證明，本發(fā)明的AFB4DNA片段是一啟動子，且該啟動子有很強(qiáng)的特異表達(dá)活性，特異的在植物的主根與側(cè)根結(jié)合的維管柱處和葉的鋸齒邊緣處表達(dá)。本發(fā)明啟動子為特異表達(dá)的基因功能研究和植物的轉(zhuǎn)基因育種提供了有利工具，具有重要意義。文檔編號C12N15/11GK101831431SQ20101018322公開日2010年9月15日申請日期2010年5月19日優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日發(fā)明者儲成才,曹守云,王猛,王秀杰申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所