專(zhuān)利名稱(chēng)：從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從石油污染土樣中
分離組合菌液來(lái)降解原油的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)每年石油消耗量將達(dá)到2.5億噸，其中需進(jìn)口約l億噸。石油資源匱乏、 石油價(jià)格猛漲，給我國(guó)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)很大壓力。當(dāng)前特別是要切實(shí)抓好石油天然氣的節(jié)約和 合理使用。我國(guó)人口多，資源少，生態(tài)環(huán)境脆弱，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展還面臨著環(huán)境與資源 的壓力，環(huán)境污染和生態(tài)惡化的問(wèn)題還比較突出。大力發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)，實(shí)現(xiàn)資源的高效 利用和循環(huán)使用，是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，也是從中國(guó)國(guó)情出發(fā)的必然選擇，也 是企業(yè)順應(yīng)形勢(shì)要求的重大決策。生物修復(fù)技術(shù)就是在這種背景下被開(kāi)發(fā)，并在20世紀(jì) 90年代得到迅速發(fā)展的一項(xiàng)污染治理工程技術(shù)。 石油是由上千種化學(xué)性質(zhì)不同的物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，主要包括飽和烴、芳 香烴類(lèi)化合物、瀝青質(zhì)、樹(shù)脂類(lèi)等。石油的開(kāi)采、冶煉、使用和運(yùn)輸過(guò)程的污染和遺漏 事故，以及含油廢水的排放、污水灌溉，各種石油制品的揮發(fā)、不完全燃燒物飄落等引 起一系列土壤石油污染問(wèn)題。特別是石油開(kāi)采過(guò)程產(chǎn)生的落地原油，已成為土壤礦物油 污染的重要來(lái)源。 許多研究表明， 一些石油烴類(lèi)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物及人類(lèi)有致癌、 致畸、致突變的作用。土壤的嚴(yán)重污染會(huì)導(dǎo)致石油烴的某些成分在糧食中積累，影響糧 食的品質(zhì)，并通過(guò)食物鏈，危害人類(lèi)健康。進(jìn)行石油污染土壤的生物修復(fù)，首先需要了 解石油污染土壤中微生物的特性，大多數(shù)研究表明土壤中存在的微生物種類(lèi)多樣，未被 污染土壤中的復(fù)雜微生物群落都包含著天然的石油降解菌群。土壤被石油污染后，烴類(lèi) 污染物能引導(dǎo)具備降解能力的微生物產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，正是通過(guò)這種自然選擇以及基因突變 作用，能夠適應(yīng)新的微生物生態(tài)環(huán)境的微生物種群，逐漸被馴化成為石油降解菌，這樣 就可以通過(guò)這些降解菌來(lái)還原受石油污染的土壤，降解原油。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油的方法，能 夠降解石油、還原土壤。 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是， 一種從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油
的方法，具體按照以下步驟實(shí)施 步驟l，從油井中采集污染土樣； 從油井取出石油污染土樣，其中油井深度為800 1000m;溫度為26t: 30°C， 土樣經(jīng)碎散、除雜、過(guò)篩至1.25mm、混均；
步驟2，原油降解菌的富集和分離、純化培養(yǎng)； 取上步的污染土樣10g添加到裝有200mL無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的三角瓶中，在3(TC、200r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7d，培養(yǎng)7d后取其中的培養(yǎng)物到新鮮的同樣的無(wú)機(jī) 培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7d、 3(TC重復(fù)培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)基；移取10ml的富集培養(yǎng)基接入新鮮含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度3(TC下培養(yǎng)7d， 7d后取其中的培養(yǎng)物到新鮮的同樣的含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7d、 3(TC重復(fù)培養(yǎng)、共 重復(fù)3次，7天為一周期，經(jīng)過(guò)3個(gè)周期的馴化后，得到馴化培養(yǎng)液；
在無(wú)菌的條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的平板上劃 線后，平板倒置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到典型菌落，然后將典型菌落在分離 培養(yǎng)基的平板上反復(fù)劃線純化后得到單一菌落，分別將純化的單一菌落的菌株接種至斜 面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存于4t:冰箱中；
步驟3，組合菌液配置 分別將上步得到的純化的單一菌落的菌株接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3(TC，培 養(yǎng)24h后得到菌懸液，分別吸取5mL菌懸液接入50mL降解液體培養(yǎng)基中，于30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)7d，并分別測(cè)定單一菌落菌株的原油降解率；利用16SrRNA鑒定原油降解率超過(guò)70X的細(xì)菌，將其中的假單胞菌、黃桿菌、 棒桿菌分別接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3(TC，培養(yǎng)24h后，分別吸取濃度 為108 109CFU/ml的lmL假單胞菌的菌懸液、濃度為108 109CFU/ml的20mL黃桿 菌的菌懸液和濃度為108 109CFU/ml的lmL棒桿菌的菌懸液，充分混合配成組合菌菌 液制劑； 步驟4，組合菌液降解原油 將占土壤質(zhì)量3%的組合菌液制劑用噴霧器均勻地接入土壤，根據(jù)培養(yǎng)基成分比 例加入2g的MgS04， 0.5g的CuS04， 0.5g的MnS04， 0.5g的FeSO4.7H2O0.5g的CaCl2，
用當(dāng)?shù)氐叵滤{(diào)節(jié)土層水分至20%左右，最后進(jìn)行充分翻耕以便各種材料混合均勻。
本發(fā)明的特征還在于， 無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的組成為l.Og的K2HP04 3H20、 l.Og的KH2P04、 0.5g的 MgS04 7H20、 1.0gWNH4NO3、 0.02g的CaCl2、 0.03g的FeCl3、 IL去離子水，pH7.5。
含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為l.Og的K2HP04 3H20、 l.Og的KH2P04、 0.5g的 MgS04 7H20、 1.0g的NH4NO3、 0.02g的CaCl2、 0.03g的FeCl3、 2g的原油、20g的瓊 脂、1L去離子水，pH: 7.0 7.5。 種子培養(yǎng)基的組成為20g的葡萄糖、5g的蛋白胨、3g的酵母提取物、5g的 NaCl， 1L的蒸餾水，pH7.5。 降解液體培養(yǎng)基的組成為1.0g的K2HPO4 3H20、 l.Og的KH2P04、 0.5g的 MgS04 7H20、 l.Og的NH4N03、 0.02g的CaCl2、 0.03g的FeCl3、 lg的原油、1L去離子 水，pH : 7.0 7.5。
本發(fā)明的有益效果是， (1)高效石油降解菌株可產(chǎn)生雙加氧酶，對(duì)石油中含碳量在C13 C31的組分降 解率均在90%以上； (2)降解正十八烷的最適溫度為30°C、 pH值7.0和Nacl濃度為2%，在低溫和 高鹽堿條件下仍具有良好的降解能力； (3)降解烷烴的同時(shí)能迅速產(chǎn)生脂肽類(lèi)生物表面活性劑，使表面張力
558.11mN m-l下降到36.6mN m_l。


圖1為本發(fā)明中組合菌液對(duì)四種不同試驗(yàn)區(qū)土樣處理后含油量隨降解時(shí)間的變 化圖； 圖2為本發(fā)明中組合菌液對(duì)新鮮土除油率隨生物修復(fù)時(shí)間的變化曲線； 圖3為本發(fā)明中添加、未添加組合菌液和新鮮土、滅菌土不同組合后對(duì)石油烴
隨時(shí)間降解曲線； 圖4為本發(fā)明中組合菌液對(duì)對(duì)四種不同試驗(yàn)區(qū)土樣石油烴降解過(guò)程中的菌群數(shù) 量隨時(shí)間變化曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。 本發(fā)明提供的一種從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油的方法，試驗(yàn)用 選擇性培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基，對(duì)試驗(yàn)場(chǎng)石油污染土壤的樣品進(jìn)行菌種、菌群的培養(yǎng)分 離，選擇優(yōu)化出試驗(yàn)用降解土壤石油的菌種、菌群。具體按以下步驟進(jìn)行
步驟l，從油井中采集污染土樣； 從油井取出石油污染土樣，其中油井深度為800 1000m;溫度為26t: 30°C， 土樣經(jīng)碎散、除雜、過(guò)篩至1.25mm、混均；
步驟2，原油降解菌的富集和分離、純化培養(yǎng) 取上步的污染土樣10g添加到裝有200mL無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的三角瓶中，在3(TC、 200r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7d，培養(yǎng)7d后取其中的培養(yǎng)物到新鮮的同樣的無(wú)機(jī) 培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7d、 3(TC重復(fù)培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)基； 移取10ml的富集培養(yǎng)基接入新鮮含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度3(TC下培養(yǎng)7d， 7d后取其中的培養(yǎng)物到新鮮的同樣的含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7d、 3(TC重復(fù)培養(yǎng)、共 重復(fù)3次，7天為一周期，經(jīng)過(guò)3個(gè)周期的馴化后，得到馴化培養(yǎng)液；
在無(wú)菌的條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的平板上劃 線后，平板倒置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到典型菌落，然后將典型菌落在分離 培養(yǎng)基的平板上反復(fù)劃線純化后得到單一菌落，分別將純化的單一菌落的菌株接種至斜 面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存于冰箱中，溫度4t:; 其中， 無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的組成為l.Og的K2HP04 3H20、 l.Og的KH2P04、 0.5g的 MgS04 7H20、 1.0gWNH4NO3、 0.02g的CaCl2、 0.03g的FeCl3、 IL去離子水，pH7.5。
富集培養(yǎng)基的組成為無(wú)機(jī)培養(yǎng)基、2g的原油，pH7 7.5。
含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為無(wú)機(jī)培養(yǎng)基、2g的原油、20g的瓊脂。
步驟3，組合菌液配置 分別將上步得到的純化的單一菌落的菌株接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3(TC，培 養(yǎng)24h后得到菌懸液，分別吸取5mL菌懸液接入50mL降解液體培養(yǎng)基中，于30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)7d，并分別測(cè)定單一菌落菌株的原油降解率；
利用16SrRNA鑒定原油降解率超過(guò)70X的細(xì)菌，將其中的假單胞菌、黃桿菌、 棒桿菌分別接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3(TC，培養(yǎng)24h后，分別吸取濃度 為108-109CFU/ml的lmL假單胞菌的菌懸液、濃度為108_109CFU/ml的20mL黃桿菌的菌 懸液和濃度為108-109CFU/ml的lmL棒桿菌的菌懸液，充分混合配成組合菌菌液制劑；
其中， 種子培養(yǎng)基的組成為20g的葡萄糖，5g的蛋白胨，3g的酵母提取物，5g的 NaCl， 1L的蒸餾水，pH7.5。 降解液體培養(yǎng)基的組成為無(wú)機(jī)培養(yǎng)基，lg的原油。
步驟4，組合菌液降解原油 將占土壤質(zhì)量3%的組合菌液制劑用噴霧器均勻地接入土壤，根據(jù)培養(yǎng)基成分比 例加入2g的MgS04， 0.5g的CuS04， 0.5g的MnS04， 0.5g的FeS04.7H20， 0.5gWCaCl2， 用當(dāng)?shù)氐叵滤{(diào)節(jié)土層水分至20%左右，最后進(jìn)行充分翻耕以便各種材料混合均勻。
其中步驟3中16SrRNA基因PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定具體步驟為
DNA的提取
第一天 l.菌體收集將鏡檢純化的供試菌株分別接種到5mlLB培養(yǎng)液中，28°C、 130r/ min震蕩培養(yǎng)3-5天，取1.5ml菌液于離心管中，8000r/min離心5min，棄去上清液，然 后，重復(fù)上述操作兩次，收集菌體。 2.DNA提取加入lml lXTE(Tris 10mM， EDTA lmM， pH8)，洗滌菌體2 3次，即加入lml 1XTE溶液后，用手搖動(dòng)后，在渦旋震蕩機(jī)上震蕩，打散菌體，然后 8000rpm離心5min，棄去上清，重復(fù)此步驟2次。然后，加入600 y 1 TE緩沖液(含 20iU， 50mg/ml溶菌酶，即580 y 1TE緩沖液，20 y 1溶菌酶)，并轉(zhuǎn)移到1.5ml滅過(guò)菌的 離心管中，旋渦震蕩，37t:在水浴鍋溫育lh。 3.加入30iU 10% SDS， 10 y 1蛋白酶K(20mg/ml)，并充分混勻，37。C溫浴過(guò) 夜。 第二天 1.加20iU 10% SDS，并翻轉(zhuǎn)混勻(非渦旋震蕩)。加130iU5MNaCl，并用手 劇烈振蕩。在冰上放置30min后，并用手劇烈振蕩。 2.12000rpm離心25min。用剪去槍尖的槍頭吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的離心管 中，收集上清液，然后在收集的上清液中加入約700iU的P:C:I，充分振蕩使其呈乳濁 液。12000rpm離心5min，用剪去槍尖的槍頭吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，收集 上清。重復(fù)用P:C:I抽提2 3次至沒(méi)有蛋白膜出現(xiàn)。 3.加700iU的C:I，非渦旋振蕩，12000rpm離心10min，若有必要，可重復(fù)這一
止 少。4.收集上清液，力B 1/10倍體積(約50 ii 1)的3M， PH5.2 NaAC和1倍體積 (500 ii 1)預(yù)冷的異丙醇(以沉淀核酸)，輕微反轉(zhuǎn)振蕩試管(非渦旋)，使DNA析出。
5.12000rmp離心10min，去除上清液，并加500 y 1的70%乙醇，用手輕微振 蕩，洗滌DNA沉淀中的無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)溶劑。
6.12000rmp離心15min，并棄去上清乙醇，干燥DNA。
7
7加50iU純水，輕敲管壁，使DNA重新懸浮起來(lái)。 8.力B 3 ii 1 10mg/ml RNAase并在37。C溫浴3h。 9.加ddH20 47 ii 1，用1/10 (10 y 1)體積的3M PH5.2 NaAC和1體積的異丙醇(預(yù)
先冷卻)，輕微翻轉(zhuǎn)搖晃使DNA沉淀(非渦旋)，12000rpm 20min，棄去上清。 10.用500iU的70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm離心5min，去上清并干燥
DNA。 ll.干燥后，加(1(11120，輕敲離心管使DNA重新懸浮起來(lái)。 12.放離心管置4t:冰箱過(guò)夜，使DNA能充分溶解。 13.電泳檢查，并-2(TC保存。 PCR擴(kuò)增 16SrRNA引物 選用來(lái)源于E.coli 16SrRNA基因序列保守區(qū)域的序列合成引物Pl和P6，配成 10iiM濃度。 正向引物P1 : 5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT—3' 其序列對(duì)應(yīng)于E.coli第8-37堿基位置。 反向引物P6 : 5' -TAC GGC TAC CTT GTTACGACT TCA CCC C-3'，此序列 對(duì)應(yīng)于E.coli第1479-1506堿基位置。 PCR反應(yīng)體系 16SrRNA PCR反應(yīng)體系體積為50 ii 1，反應(yīng)體系組成如下 Reaction Buffer (10 X) 5.0 ii 1 MgCl2(25mM) 3.0 ii 1 dDNTPs (25mM) 4.0 ii 1 正向引物(150iiM) l.OiU 反向引物(150iiM) l.OiU DNA聚合酶(5U/ P 1) 0.25 ii 1 模板DNA (約20-30ng) 2.0 ii 1 補(bǔ)足超純水至 50.0 ii 1 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)程序如下 1.95°C預(yù)變性 4min 2.94°C變性 lmin 3.54°C退火 lmin 4.72 °C延伸 2min 5.重復(fù)2-4步驟32循環(huán) 6.72°C最終延伸 7min 32個(gè)循環(huán)后，利用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。16S PCR-RFLP分析的基礎(chǔ) 上，選擇各個(gè)基因型的代表的菌株進(jìn)行了全序列測(cè)定。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)， 采用16SrRNA進(jìn)行了分類(lèi)和鑒定，其16SrRNA的核苷酸序列如表所示。 正向引物P1 : 5 ， -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT—3 ，其序列對(duì)應(yīng)于E.coli第8-37堿基位置。 反向引物P6 : 5' -TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C_3'，此序列
對(duì)應(yīng)于E.coli第1479-1506堿基位置。 真菌的分類(lèi)鑒定依據(jù)中國(guó)真菌志進(jìn)行。 菌株鑒定結(jié)果表明，分別為不動(dòng)細(xì)菌屬，奈瑟氏球菌屬，鄰單胞菌屬、黃單胞
菌屬、動(dòng)膠菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬、棒桿菌屬、青霉屬、葡萄孢屬。 本發(fā)明的組合菌液，從原油污染土壤、渣油、落地油、含油污水及原油中經(jīng)過(guò)
富集、篩選、分離和純化出石油降解率為98%的菌株，具有降解原油的性質(zhì)。 通過(guò)菌體細(xì)胞或其發(fā)酵液降解石油中的C13 C31，具體過(guò)程為 在菌體細(xì)胞或其發(fā)酵液作用下，直鏈烷烴首先被通過(guò)氧化烷烴末端的一個(gè)甲基
轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的醇，源于烷烴的醇在醇脫氫酶的作用下被氧化為相應(yīng)的醛，醛則通過(guò)醛脫
氫酶的作用氧化成脂肪酸， 一種情況是直接經(jīng)歷隨后的P-氧化序列，即形成羧基并脫
落兩個(gè)碳單元，另一種情況是經(jīng)歷羥基化形成羥基脂肪酸，然后在非專(zhuān)一羥基酶的參與
下被氧化為二羧基酸，最后再經(jīng)歷P-氧化序列，其途經(jīng)如下式所示R-CH2-CH3+02 — R-CH2-CH2_OH — R-CH2_CHO — R-CH2_COOHH3C_(CH2)n-CH3+02 — H3C_ (CH2) n_CH2OH — H3C_ (CH2) n_CHO — H3C_(C
H2)n_COOH — HOH2C_(CH2)n-COOH — OHO (CH2) n-COOH — HOOO (CH2) nCOOH
其中n的范圍是l 22H3C_ (CH2) U-CH3 — H3C_ (CH2) 1(1-CH (OH) _CH3 — H3C_ (CH2) 1(rCOCH3 — H3C_ ( CH2)9-CH2-0_COCH3 — H3C-(CH2)9_CH2OH+CH3COOH
以下驗(yàn)證本發(fā)明組合菌液降解原油的功效，方法如下 試驗(yàn)小區(qū)設(shè)置為試驗(yàn)區(qū)(1區(qū))、陽(yáng)性對(duì)照區(qū)(2區(qū))、陰性對(duì)照區(qū)(3區(qū))和 空白區(qū)(4區(qū))。小區(qū)規(guī)格為120cmX120cm，各小區(qū)相間20cm，小區(qū)由西向東一字排 列。 用當(dāng)?shù)厝〉玫脑妥魈荚?，即污染物，根?jù)試驗(yàn)用接種量將選擇優(yōu)化出的各菌 種、菌群進(jìn)行放大培養(yǎng)，配成菌液制劑。在試驗(yàn)區(qū)土壤表層15cm深均勻混入一定量的 石油，按試驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)土壤重的2.5%混入小麥麥麩和鋸末，作為添加劑，將占試驗(yàn)土壤質(zhì) 量的3%的菌液制劑用噴霧器均勻地接入試驗(yàn)區(qū)土壤，根據(jù)培養(yǎng)基成分比例加入氮、磷、 鈣、鎂、硫、鐵等調(diào)控營(yíng)養(yǎng)元素，用當(dāng)?shù)氐叵滤{(diào)節(jié)土層水分至20%左右。最后進(jìn)行 充分翻耕以便各種試驗(yàn)材料混合均勻，在試驗(yàn)區(qū)覆蓋多孔塑料薄膜便于保溫、保濕、防 雨。陽(yáng)性對(duì)照區(qū)加入與試驗(yàn)區(qū)相同的石油量，不加其它成分，作為自然降解；陰性對(duì)照 區(qū)加入與試驗(yàn)區(qū)相同的石油量，其它成分與試驗(yàn)區(qū)相同；空白區(qū)不加任何物質(zhì)作為監(jiān)控 樣品。 試驗(yàn)結(jié)果如圖1至圖4。圖1為本發(fā)明組合菌液對(duì)四種不同試驗(yàn)區(qū)土樣處理后 含油量隨降解時(shí)間的變化圖；可以看出四種不同試驗(yàn)區(qū)土樣中的石油經(jīng)過(guò)組合菌液的降 解后隨時(shí)間變化情況，其中l(wèi)區(qū)效果最好，經(jīng)過(guò)120天，降解率達(dá)到90%多。而陽(yáng)性對(duì) 照區(qū)只有40%多。由此看出，高效石油降解菌株可產(chǎn)生雙加氧酶(菌株的搖瓶產(chǎn)物加吲 哚后顯藍(lán)色，這是能否產(chǎn)生雙加氧酶的特征性定性顯色反應(yīng))，對(duì)石油中含碳量在C13 C31的組分降解率均在90%以上。圖2為本發(fā)明添加和未添加組合菌液新鮮土除油率隨生物修復(fù)時(shí)間的變化曲線；此圖表明投加外來(lái)菌在一定的石油含量的土壤中可以提高菌含 量。圖3為本發(fā)明添加、未添加組合菌液和新鮮土、滅菌土不同組合后對(duì)石油烴隨時(shí)間 降解曲線；此圖表明新鮮土和滅菌土在處理中的差別，說(shuō)明新鮮土可以促進(jìn)石油降解。 圖4為本發(fā)明組合菌液對(duì)四種不同試驗(yàn)區(qū)土樣石油烴降解過(guò)程中的菌群數(shù)量隨時(shí)間變化 曲線。此圖表明只有l(wèi)區(qū)的菌數(shù)不斷上升，而其他區(qū)是先升后降的變化規(guī)律。由此可以 看出降解正十八烷的最適溫度為30°C、 pH值7.0和Nacl濃度為2%，在低溫和高鹽堿條 件下仍具有良好的降解能力。 本發(fā)明提供高效降解菌烷烴降解譜的測(cè)定。 烷烴降解譜的測(cè)定在FJ培養(yǎng)液中加入5mL正己烷及用正己烷溶解的 lOOOOmg L—1的菲(內(nèi)標(biāo))25ii L，充分振蕩溶解后離心。用正己烷對(duì)萃取液重復(fù)萃取兩 次，合并萃取液后定容至25mL，用干燥的無(wú)水硫酸鈉脫水，取1 y L上清液進(jìn)行GC-MS 測(cè)定。氣相色譜儀為T(mén)hermotraceGCULTRA，色譜柱為T(mén)RB_5， FID檢測(cè)器。色譜條 件8(TC保持5min，以3°C min—1升至165°C，保持2min，然后以5。C min—1升至 270°C，保持10min。 進(jìn)樣口溫度250。C，檢測(cè)器溫度280。C，無(wú)分流比。
本發(fā)明提供高效降解菌烷烴降解譜的測(cè)定。 在烷烴培養(yǎng)液中加入5mL色譜純正己烷及15 ii L正十五烷(內(nèi)標(biāo))，充分振蕩萃 取后，于4°C lOOOOr min—1離心5min。吸取上清液至20rnL刻度試管中，殘液用5mL 正己烷重復(fù)萃取兩次，合并后定容至15mL。稀釋IO倍后用干燥的無(wú)水硫酸鈉脫水，取 lPL進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。氣相色譜儀為OVIOI，色譜柱為SPB-5， FID檢測(cè)器。色譜 條件13(TC保持5min，以l(TC min—1升至220°C ，保持5min。 進(jìn)樣口 、檢測(cè)器溫度 均為250°C。 本發(fā)明提供的高效降解菌表面張力的測(cè)定。 每間隔8h取培養(yǎng)后的30mL石蠟培養(yǎng)液，采用分光光度計(jì)于600nm處測(cè)細(xì)菌生 長(zhǎng)量，12000r min—1離心10min去除菌體，用JYW-200A自動(dòng)界面張力儀(承德實(shí)驗(yàn)機(jī) 有限責(zé)任公司)測(cè)上清液的表面張力。 本發(fā)明屬于石油污染土壤的原位生物修復(fù)技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)特征是將具有石 油烴降解能力的幾種不同的細(xì)菌分別通過(guò)液體培養(yǎng)后按照一定比例混合制成液體微生物 制劑，采用本發(fā)明提供的微生物制劑具有在土壤中活性高、遷移迅速、能夠與污染物充 分接觸并能夠協(xié)同降解石油烴污染物的優(yōu)點(diǎn)。添加組合菌液體微生物制劑，添加土壤結(jié) 構(gòu)改良劑、有機(jī)肥和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，采用灌溉、翻耕、覆蓋多孔地膜和保水保溫的工程 措施完成石油污染土壤的原位生物修復(fù)過(guò)程。本方法可以保證原位生物修復(fù)過(guò)程中微生 物生長(zhǎng)代謝的最佳條件，強(qiáng)化微生物在土壤中的遷移和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的傳質(zhì)過(guò)程，從而提 高原位生物修復(fù)過(guò)程的效率。對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的高效菌在實(shí)驗(yàn)室條件下翻耕次數(shù)越多，其 降解率越高，翻耕頻率最高的降解率為92.6%，比不翻耕的降解率高出32.35%。在添加 添加土壤結(jié)構(gòu)改良劑的條件下，由于添加添加土壤結(jié)構(gòu)改良劑提高了土壤的通透性，為 微生物降解石油烴提供了足夠氧從而提高了微生物的降解率，其中添加鋸末土樣的降解 率為87.96%。 組合菌液中的三種細(xì)菌的16SrRNA的核苷酸序列表
<110>延安微生物研究所
<120>—種從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油的方法 <160>3 <210>1 <211>933 <212>DNA <213>Pseudoomonas <400>1 gcggctggct ccaaaaaggt taccccaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60 acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120 tagcgattcc agcttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga gaacggtttt 180 atgagattag ctccacctcg cggtcttgca gctctttgta ccgtccattg tagcacgtgt 240 gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300 caccggcagt caccttagag tgcccaactt aatgatggca actaagatca agggttgcgc 360 tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420 gtcactctgc tcccgaagga gaagccctat ctctagggtt ttcagaggat gtcaagacct 480 ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540 cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600 ttaacttcag cactaaaggg cggaaaccct ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660 ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gtgtcagtta 720 c昭a(bǔ)cc昭^敏cgccttc gcractggtg ttcctcc她tctclacgra tttcaccgct 780 acacatggaa ttccactttc ctcttctgca ctcaagtctc ccagtttcca atgaccctcc 840 acggttgagc cgtgggcttt cacatcagac ttaagaaacc acctgcgcgc gctttacgcc 900 caataattcc ggataacgct tgccacctac gta 933 <210>2 <211>937 <212>DNA <213>Flavobacterium <400>2 ggcggctggc tccataaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120 ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt 180 tgtgggattg gcttaacctc gcggtctcgc tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg 240 tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300 tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg 360 ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420 tgtcactctg cccccgaagg ggaagcccta tctctagggg tgtcagagga tgtcaagacc 480 tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600 gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660
11
tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt 720 acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780 tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc 840 cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc 900 ccaataattc cgga認(rèn)cgc ttgccaccte cgtatto 937 <210>3 <211>940 <212>DNA <213>Corynebacterium <400>3 gcggctggct ccaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60 cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120 agcgattccg gcttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aacgacttta 180 tcggattagc tccctctcgc gagttggcaa ccgtttgtat cgtccattgt agcacgtgtg 240 tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300 accggcagtc accttagagt gcccaactaa atgatggcaa ctaagatcaa gggttgcgct 360 cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420 tcaccgttgc ccccgaaggg gaaaccatat ctctacagtg gtcaacggga tgtcaagacc 480 tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600 gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660 tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agtgtcagtt 720 acagaccaga tagtcgcctt cgccactggt gttcctccaa atctctacgc atttcaccgc 780 tacacttgga attccactat cctcttctgc actcaagtct cccagtttcc aatgaccctc 840 cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaagaaac cacctgcgcg cgctttacgc 900 ccaataattc ccggacaacg cttgccacct acgtattacc 940
權(quán)利要求
一種從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油的方法，其特征在于，具體按照以下步驟實(shí)施步驟1，從油井中采集污染土樣；從油井取出石油污染土樣，其中油井深度為800～1000m；溫度為26℃～30℃，土樣經(jīng)碎散、除雜、過(guò)篩至1.25mm、混均；步驟2，原油降解菌的富集和分離、純化培養(yǎng)；取上步的污染土樣10g添加到裝有200mL無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃、200r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7d，培養(yǎng)7d后取其中的培養(yǎng)物到新鮮的同樣的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7d、30℃重復(fù)培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)基；移取10ml的富集培養(yǎng)基接入新鮮含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度30℃下培養(yǎng)7d，7d后取其中的培養(yǎng)物到新鮮的同樣的含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中再培養(yǎng)7d、30℃重復(fù)培養(yǎng)、共重復(fù)3次，7天為一周期，經(jīng)過(guò)3個(gè)周期的馴化后，得到馴化培養(yǎng)液；在無(wú)菌的條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的平板上劃線后，平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到典型菌落，然后將典型菌落在分離培養(yǎng)基的平板上反復(fù)劃線純化后得到單一菌落，分別將純化的單一菌落的菌株接種至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存于4℃冰箱中；步驟3，組合菌液配置分別將上步得到的純化的單一菌落的菌株接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)24h后得到菌懸液，分別吸取5mL菌懸液接入50mL降解液體培養(yǎng)基中，于30℃，150r/min搖床培養(yǎng)7d，并分別測(cè)定單一菌落菌株的原油降解率；利用16SrRNA鑒定原油降解率超過(guò)70％的細(xì)菌，將其中的假單胞菌、黃桿菌、棒桿菌分別接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)24h后，分別吸取濃度為108-109CFU/ml的1mL假單胞菌的菌懸液、濃度為108-109CFU/ml的20mL黃桿菌的菌懸液和濃度為108-109CFU/ml的1mL棒桿菌的菌懸液，充分混合配成組合菌菌液制劑；步驟4，組合菌液降解原油將占土壤質(zhì)量3％的組合菌液制劑用噴霧器均勻地接入土壤，根據(jù)培養(yǎng)基成分比例加入2g的MgSO4，0.5g的CuSO4，0.5g的MnSO4，0.5g的FeSO4.7H2O0.5g的CaCl2，用當(dāng)?shù)氐叵滤{(diào)節(jié)土層水分至20％左右，最后進(jìn)行充分翻耕以便各種材料混合均勻。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述降解原油的方法，其特征在于，所述步驟2中無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的組成為1.0g的K2HP04 3H20、 l.Og的KH2P04、 0.5g的MgS04 7H20、 l.Og的NH4N03、 0.02g的CaCl2、 0.03g的FeCl3、 1L去離子水，pH7.5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述降解原油的方法，其特征在于，所述步驟2中含油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為1.0g的K2HPO4 3H20、 1.0g的KH2P(V 0.5g的MgS04 7H20、 l.Og的NH4N03、 0.02g的CaCl2、 0.03g的FeCl3、 2g的原油、20g的瓊脂、1L去離子水，pH :7.0 7.5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述降解原油的方法，其特征在于，所述步驟3中種子培養(yǎng)基的組成為20g的葡萄糖、5g的蛋白胨、3g的酵母提取物、5g的NaCl， 1L的蒸餾水，pH7.5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述降解原油的方法，其特征在于，所述步驟3中的降解液體培養(yǎng)基的組成為l.Og的K2HP04 3H20、 l.Og的KH2P04、 0.5g的MgS04 7H20、 l.Og的 NH4N03、 0.02g的CaCl2、 Q.03g的FeCl3、 lg的原油、1L去離子水，pH : 7.0 7.5。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從石油污染土樣中分離組合菌液來(lái)降解原油的方法，先從油井中采集污染土樣；將原油降解菌的富集和分離、純化培養(yǎng)；然后制得組合菌液，最后將制得的組合菌液噴灑在土壤中，降解原油。采用本發(fā)明的方法，能夠降解石油、還原土壤。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101690939SQ200910023298
公開(kāi)日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者李軍, 蘇永杰, 鄧振山 申請(qǐng)人:延安市微生物研究所