一種石油降解菌固定化包埋顆粒的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物固定化領(lǐng)域，具體涉及用于修復(fù)石油污染土壤的石油降解菌固定化包埋顆粒的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]石油污染土壤是石油及石化企業(yè)的重要污染之一，其中的石油污染物對(duì)人體及環(huán)境具有很高的毒害作用。土壤的污染越來(lái)越受到人們的關(guān)注，保證土壤修復(fù)的效率，恢復(fù)健康生產(chǎn)也就變得越來(lái)越重要。
[0003]國(guó)內(nèi)外石油污染土壤的處理方法主要有:焚燒法、填埋法、堆放法以及生物修復(fù)法等。但以生物法最經(jīng)濟(jì)、最徹底，是實(shí)現(xiàn)土壤生態(tài)恢復(fù)的最有效手段。為了解決傳統(tǒng)生物處理技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中游離微生物與土著菌競(jìng)爭(zhēng)力弱、抗毒性污染能力差、易受外界環(huán)境沖擊而難以適應(yīng)環(huán)境等缺點(diǎn)，近些年，人們廣泛采用固定化微生物技術(shù)來(lái)修復(fù)受污染的流體介質(zhì)(如廢水)和半流體介質(zhì)(如泥漿)，它具有菌體密度高、微生物活性高且穩(wěn)定、耐毒性能力強(qiáng)等特點(diǎn)。因此，近十年來(lái)，對(duì)其修復(fù)受污染的非流體介質(zhì)(如土壤)的研究也日益增多，但將其廣泛應(yīng)用于受石油污染土壤修復(fù)的報(bào)道還較少。
[0004]固定化載體和固定化方法的選擇是固定化微生物技術(shù)的關(guān)鍵性問(wèn)題。載體性能是關(guān)系到固定化技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素。固定化載體主要有有機(jī)載體、無(wú)機(jī)載體和復(fù)合載體。理想的固定化載體應(yīng)該具備以下特征:對(duì)微生物細(xì)胞無(wú)毒性；基質(zhì)通透性好，傳質(zhì)性能穩(wěn)定；機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長(zhǎng)；價(jià)格低廉；重復(fù)利用率高，使用后不產(chǎn)生二次污染等。傳統(tǒng)的固定化方法主要有吸附法和包埋法，吸附法制備容易，載體可再生，但微生物與載體的結(jié)合程度不夠牢固；包埋法包埋的菌量大、細(xì)胞不易滲漏，穩(wěn)定性好、能抗有毒物質(zhì)的侵害，但是可能會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞活性喪失。
[0005]CN101177677A公開(kāi)了一種用于多環(huán)芳烴(PHAs)污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，按照重量5?20%的比例將培養(yǎng)12?14h的種子液與凝膠液混勻，在25?40°C和pH自然條件下，通過(guò)制粒器制得固定化顆粒。凝膠液質(zhì)量百分配比為:海藻酸鈉疒3%，(150目)活性炭、紅磚粉、泥炭土和/或粉煤灰0.3^0.6%，余量為水。該發(fā)明以海藻酸鈉為主要載體材料，以活性炭、紅磚粉、泥炭土和/或粉煤灰等為輔助載體，改進(jìn)了傳統(tǒng)的海藻酸鈉包埋固定化工藝，可使固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和緩釋性能大大提高。但是，該方法直接對(duì)菌體進(jìn)行包埋，影響菌體的活性，并且也不能保證載體對(duì)菌體的吸附量，所制備出的粉煤灰固定化顆粒對(duì)土壤PYR和BaP去除率最高為54.1%和45.8%，其他固定化顆粒對(duì)PYR和BaP去除率均低于50%和40%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種石油降解菌固定化包埋顆粒的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明方法制備的石油降解菌固定化包埋顆?？捎糜谑臀廴就寥赖脑恍迯?fù)，對(duì)石油污染土壤具有良好的修復(fù)效果，是一種可以推廣應(yīng)用的環(huán)保產(chǎn)品。
[0007]本發(fā)明石油降解菌固定化包埋顆粒的制備方法，包括以下內(nèi)容:(1)將35.8wt%?46.5wt%的水葫蘆、14.2wt%?18.5wt%的小麥稻桿粉碎過(guò)篩，與35wt%?50wt%的核桃殼質(zhì)活性炭混合，作為輔助載體；(2)取占包埋體系3.0wt9T7.0wt%的輔助載體，接入10wt%?20wt%的石油降解菌種子液,進(jìn)行吸附；(3)將占包埋體系8.0wt%?10wt%的聚乙烯醇(PVA)攪拌溶解于8(Tl00°C水中，加入1.2wt°/Tl.5wt%的海藻酸鈉混勻，冷卻后加入余量的水；(4)將(2)和(3)混勻組成包埋體系，滴入CaCl2溶液中交聯(lián)成球，再轉(zhuǎn)入Na2SO4溶液中固定化，獲得石油降解菌固定化包埋顆粒。
[0008]本發(fā)明中，步驟(I)所述的輔助載體最好進(jìn)行預(yù)處理，首先將按比例混合的水葫蘆、小麥秸桿與核桃殼質(zhì)活性炭混合物用蒸餾水浸泡12?24h，調(diào)節(jié)ρΗ7.(Γ7.2，濾去上層雜質(zhì)，再將濾出的混合物50°C干燥24h，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0009]本發(fā)明中，步驟(I)所述的水葫蘆全碳含量為220g/kg?260g/kg、全氮含量為38.5g/kg?45.5g/kg、全磷含量為9 g/kg?10.8 g/kg。小麥稻桿的全碳含量為28.1g/kg?35.6g/kg、全氮含量為32.9g/kg?46.8g/kg、全磷含量為0.64 g/kg?0.83 g/kg。核桃殼質(zhì)活性炭為粉末活性炭，其比表面積為960m2/g，碘吸附值為820mg/g。核桃殼質(zhì)活性炭為用ZnCl2活化法制備，具體的制備方法為:稱取一定量的粉碎過(guò)篩的核桃殼浸潰于質(zhì)量濃度50%的ZnCl2溶液中，料液比2:3，攪拌2小時(shí)后靜置24 h，干燥后放入管式加熱爐中，于3000C > N2的氛圍下炭化80min,所得炭化樣品再在50%ZnCl2溶液中浸潰20min,經(jīng)抽濾、干燥后置于馬弗爐中500°C下活化40 min，冷卻后將活化產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的鹽酸煮沸20min，再用去離子水將所得產(chǎn)物洗滌至中性，置于干燥箱中120 °C烘干。核桃殼質(zhì)活性炭表面積大，吸附能力強(qiáng)，可以有效的吸附菌絲體和游離酶，其多孔性還可以增加產(chǎn)物和底物的擴(kuò)散速度，降低擴(kuò)散阻力，增加微球內(nèi)部的通透結(jié)構(gòu)。水葫蘆和小麥秸桿本身所含的纖維物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有助于活性炭吸附菌體，保證吸附的菌量滿足要求，同時(shí)還可以滿足菌體的營(yíng)養(yǎng)需求。
[0010]本發(fā)明中，步驟(2)所述的石油降解菌種子液的制備采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在120r/min、3(TC條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的交界點(diǎn)，保證石油降解菌的數(shù)量達(dá)到I X 1ltl飛XlOltl個(gè)/mL。將石油降解菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的交界點(diǎn)，可以保證菌的最高活性和穩(wěn)定性。
[0011]本發(fā)明中，步驟(2)所述的石油降解菌的吸附是在12(Tl60r/min、3(rC條件下培養(yǎng)吸附16?24h，使石油降解菌吸附在輔助載體上，保證吸附的菌量達(dá)到Qx19Ux1iq個(gè) /mL0
[0012]本發(fā)明中，步驟(4)采用的CaCl2溶液的濃度為lwt°/T5wt%，Na2SO4溶液的濃度為10wt%。交聯(lián)成球后，將微球取出用生理鹽水洗滌，放入Na2SO4溶液中，攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)2?4h，然后再用生理鹽水洗滌，最終制得石油降解菌固定化包埋顆粒。
[0013]本發(fā)明石油降解菌固定化包埋顆粒的應(yīng)用，具體為:先將制備的石油降解菌固定化包埋顆粒在無(wú)菌條件下按10wt%?20wt%的比例接入增殖培養(yǎng)基中，120?160r/min、30°C條件下恒溫培養(yǎng)24h，然后濾掉培養(yǎng)基，以播種的方式對(duì)5(Tl00g/kg油污土壤按每平方米撒0.rikg石油降解菌固定化包埋顆粒，保持土壤30Wt9T40wt%的水分含量，并對(duì)表層(T30cm 土壤進(jìn)行翻耕，使之與石油降解菌固定化包埋顆?；旌暇鶆?，并保證土壤良好的通氣性。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下突出特點(diǎn):
1、以天然的無(wú)機(jī)載體(核桃殼質(zhì)活性炭)和天然的有機(jī)載體(水葫蘆和小麥秸桿)的混合物作為輔助載體，采用吸附-包埋組合的方法制備石油降解菌固定化包埋顆粒，可以使石油降解菌優(yōu)先吸附在輔助載體上，以輔助載體為附著載體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在微球內(nèi)可以更好的生長(zhǎng)繁殖，分泌菌絲體，比直接包埋對(duì)固定化菌的活性影響小，能夠更好的適應(yīng)外界環(huán)境的沖擊。
[0015]2、本發(fā)明所用載體對(duì)生物無(wú)毒、傳質(zhì)性能好、吸附容量大、機(jī)械強(qiáng)度大、耐酸堿、壽命長(zhǎng)，還可以為菌體的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，克服了單獨(dú)使用天然無(wú)機(jī)載體需要補(bǔ)充外來(lái)營(yíng)養(yǎng)源和單獨(dú)使用天然有機(jī)載體固定菌量不足的缺點(diǎn)。
[0016]3、水葫蘆和小麥秸桿提供給微生物的氮、磷質(zhì)量比接近細(xì)胞成分中的氮磷比，有利于提高微生物降解能力。同時(shí)，該氮磷比一方面可以滿足微生物增殖對(duì)氮磷元素的需求，還可以通過(guò)緩慢釋放滿足石油污染土壤生物修復(fù)對(duì)氮磷元素的需求量,無(wú)需額外添加氮磷營(yíng)養(yǎng)源。
[0017]4、小麥秸桿含有大量的纖維素和半纖維素物質(zhì)，具有很好的保水性能，在改善微球內(nèi)部通透性、提供氮磷營(yíng)養(yǎng)源、增加活性炭吸菌量的同時(shí)，還可以減少修復(fù)過(guò)程中的灑水頻次和灑水量，滿足細(xì)菌修復(fù)過(guò)程中所需的水分。
[0018]5、石油降解菌固定化包埋顆粒對(duì)石油污染土壤有明顯的修復(fù)效果，對(duì)50g/kg^l00g/kg油污土壤，在投料比0.5^1kg/m2 土壤、修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率可達(dá)55%?75%，比游離菌高出21%?33%，其中飽和烴去除效果最好，可達(dá)65%?85%。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
[0020]實(shí)施例1
1、輔助載體的制備
將水葫蘆和小麥秸桿曬干、粉碎，過(guò)80目篩，然后與核桃殼質(zhì)活性炭混合，其中水葫蘆46.5wt%,小麥秸桿18.5wt%,核桃殼質(zhì)活性炭35wt%?；旌衔镉谜麴s水浸泡24h，調(diào)節(jié)pH7.0，濾去上層漂浮的雜質(zhì)和上清液，將濾出的混合物50°C干燥24h，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，備用作輔助載體。
[0021]輔助載體中的水葫蘆全碳含量為250g/kg、全氮含量為43.8g/kg、全磷含量為10.2g/kg。小麥稻桿的全碳含量為32.6g/kg、全氮含量為40.8 g/kg、全磷含量為0.76g/kg。核桃殼質(zhì)活性炭為粉末活性炭，其比表面積為960m2/g，碘吸附值為820mg/g。輔助載體中的碳氮磷比為25:5.7:1，接近細(xì)胞成分中的氮磷比，一方面可以滿足微生物增殖對(duì)氮磷元素的需求，同時(shí)還可以通過(guò)緩慢釋放滿足石油污染土壤生物修復(fù)對(duì)氮磷元素的需求量，無(wú)需額外添加氮磷營(yíng)養(yǎng)源。
[0022]核桃殼質(zhì)活性炭為用ZnCl2活化法制備，具體的制備方法為:稱取一定量的粉碎過(guò)篩的核桃殼浸潰于質(zhì)量濃度50%的ZnCl2溶液中，料液比2:3，攪拌2小時(shí)后靜置24 h，干燥后放入管式加熱爐中，于300°C、N2的氛圍下炭化80min，所得炭化樣品再在50%ZnCl2溶液中浸潰20min，經(jīng)抽濾、干燥后置于馬弗爐中于500°C下活化40 min，冷卻后將活化產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的鹽酸溶液煮沸20 min，再用去離子水將所得產(chǎn)物洗滌至中性，置于干燥箱中于120 °C烘干。
[0023]2、種子液的制備
將石油降解菌接種