于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在120r/min、3(TC條件下培養(yǎng)至石油降解菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的交界點(diǎn)，制得石油降解菌的種子液，保證種子液中石油降解菌的數(shù)量達(dá)到I XlOltl個(gè)/mL。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方為:NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L和一定體積的蒸餾水混合均勻，用NaOH或鹽酸調(diào)節(jié)pH7.0，121 V水蒸氣滅菌20 min。
[0024]3、固定化包埋顆粒的制備
①取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的交界點(diǎn)的20wt%的石油降解菌種子液與7wt%的輔助載體混合，120r/min、3(TC條件下吸附16h，使石油降解菌吸附在輔助載體上，保證吸附的菌量達(dá)到9 X 19個(gè)/mL。
[0025]②將9wt%聚乙烯醇攪拌溶解于8(Tl00°C的水中，加入1.35wt%海藻酸鈉混勻，冷卻到40°C后，加入余量的水，然后與①中吸附菌體后的輔助載體混合均勻，組成包埋體系。最后用注射器滴入濃度為lwt%的CaCl2溶液中交聯(lián)成球，30min后將微球取出，用生理鹽水洗滌3次后，轉(zhuǎn)入10wt%的Na2SO4溶液中，攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)3h，然后用生理鹽水洗滌，最終制得石油降解菌固定化包埋顆粒。
[0026]4、固定化包埋顆粒的應(yīng)用
先將制備的石油降解菌固定化包埋顆粒無(wú)菌條件下按20wt%的質(zhì)量濃度接入增殖培養(yǎng)基中，120r/min、30°C條件下恒溫培養(yǎng)24h，激活固定化石油降解菌。濾掉培養(yǎng)基，以播種的方式對(duì)100g/kg油污土壤按每平方米撒0.5kg石油降解菌固定化包埋顆粒，保持土壤35wt%的水分含量，并對(duì)表層(T30cm 土壤進(jìn)行翻耕，修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率可達(dá)70.3%，比游離菌高出32.2%，其中飽和烴去除效果最好，可達(dá)79.1%。
[0027]所述的增殖培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20 g/L，酵母膏3 g/L，蛋白胨2 g/L，硝酸銨Ig/L，MgSO4.7Η20 0.2 g/L, KCl 0.2 g/L，調(diào)節(jié) pH 7.0?7.5，115 °C滅菌 30 m in。
[0028]實(shí)施例2
與實(shí)施例1不同處之一在于:輔助載體的預(yù)處理過(guò)程中，各材料的配比為:水葫蘆43wt%,小麥稻桿17wt%,核桃殼質(zhì)活性炭40wt%。不同處之二在于:制備石油降解菌種子液時(shí)，保證種子液中石油降解菌數(shù)量達(dá)到3XlOltl個(gè)/mL。不同處之三在于:石油降解菌固定化包埋顆粒制備時(shí)，加入聚乙烯醇的質(zhì)量為10wt%，海藻酸鈉1.5wt%，CaCl2溶液的濃度為3wt%中，在10wt% Na2SO4溶液中的反應(yīng)時(shí)間為2h。
[0029]其他條件相同，修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率達(dá)64.7%，其中飽和烴去除率可達(dá)73%。
[0030]實(shí)施例3
與實(shí)施例1不同處之一在于:輔助載體的預(yù)處理過(guò)程中，各材料的配比為:水葫蘆35.8wt%,小麥稻桿14.2wt%,核桃殼質(zhì)活性炭50wt%。不同處之二在于:制備石油降解菌種子液時(shí)，保證種子液中石油降解菌的數(shù)量達(dá)到5X101(I個(gè)/mL。不同處之三在于:石油降解菌固定化包埋顆粒制備時(shí)，加入的輔助載體為3wt%，120r/min、30°C條件下培養(yǎng)24h。加入PVA的質(zhì)量為8wt%，海藻酸鈉1.2wt%，CaCl2溶液的濃度為5wt%，在10wt% Na2SO4溶液中的反應(yīng)時(shí)間為2h。不同處之四在于:油污土壤含油50g/kg，石油降解菌固定化包埋顆粒撒入量為 I kg/m2。
[0031]其他條件相同，修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率達(dá)59.3%，其中飽和烴去除率可達(dá)64.6%。
[0032]比較例I
與實(shí)施例1不同處之一在于，輔助載體全為比表面積為960m2/g，碘吸附值為820mg/g的粉末狀核桃殼質(zhì)活性炭。
[0033]其他條件相同，修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率達(dá)48.9%，其中飽和烴去除率為55%。
[0034]比較例2
與實(shí)施例1不同處之一在于，輔助載體全為水葫蘆與小麥秸桿，其中，水葫蘆占71.6wt%,小麥稻桿28.4wt%。不同處之二在于:石油降解菌固定化包埋顆粒制備時(shí)，未能保證輔助載體上吸附的菌量達(dá)到9 X 19個(gè)/mL。
[0035]其他條件相同，修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率達(dá)51.6%，其中飽和烴去除率為58.5%。
[0036]比較例3
與實(shí)施例1不同處之一在于，輔助載體全為比表面積為960m2/g，碘吸附值為820mg/g的粉末狀核桃殼質(zhì)活性炭。不同之處之二在于:在使用固定化顆粒對(duì)土壤灑水翻耕的同時(shí)進(jìn)行施肥，保證碳氮磷比為25:5.7:1。
[0037]其他條件相同，修復(fù)時(shí)間40d的條件下，石油污染物去除率達(dá)72%，其中飽和烴去除率可達(dá)80.2%。
[0038]比較例4
與實(shí)施例1不同之處在于:石油降解菌固定化包埋顆粒制備時(shí)，直接將9wt% PVA攪拌溶解于8(Tl00°C的水中，加入1.35wt%海藻酸鈉溶液混合均勻，再加入7wt%輔助載體混合均勻，冷卻到40°C左右后，加入余量的水，再與培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的交界點(diǎn)的20wt%的石油降解菌種子液一起混合均勻，組成包埋體系。然后用注射器滴入濃度為lwt%的CaCl2溶液交聯(lián)成球，30min后將微球粒取出，用生理鹽水洗滌3次后，轉(zhuǎn)入10wt%的Na2SO4溶液中，攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)3h，然后用生理鹽水洗滌，制得石油降解菌固定化包埋顆粒。
[0039]將制得的石油降解菌固定化包埋顆粒以播種的方式按0.5kg/m2撒入100g/kg油污土壤中，保持土壤40wt%的水分含量，并對(duì)表層(T30cm土壤進(jìn)行翻耕，修復(fù)40d，石油污染物去除率為58.65%，比游離菌高出20.55%，其中飽和烴去除率可達(dá)63%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種石油降解菌固定化包埋顆粒的制備方法，包括以下內(nèi)容:(1)將35.8wt%?46.5wt%的水葫蘆、14.2wt%?18.5wt%的小麥稻桿粉碎過(guò)篩，與35wt%?50wt%的核桃殼質(zhì)活性炭混合，作為輔助載體；(2)取占包埋體系3.0wt9T7.0wt%的輔助載體，接入10wt%?20wt%的石油降解菌種子液,進(jìn)行吸附；(3)將占包埋體系8.0wt%?10wt%的聚乙烯醇攪拌溶解于8(Tl00°C水中，加入1.2wt°/Tl.5wt%的海藻酸鈉混勻，冷卻后加入余量的水；(4)將(2)和(3)混勻組成包埋體系，滴入CaCl2溶液中交聯(lián)成球，再轉(zhuǎn)入Na2SO4溶液中固定化，獲得石油降解菌固定化包埋顆粒。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的輔助載體進(jìn)行預(yù)處理，先用蒸餾水浸泡12?24h，調(diào)節(jié)ρΗ7.(Γ7.2，濾去上層雜質(zhì)，再將濾出的混合物50°C干燥24h，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的水葫蘆全碳含量為220g/kg?260g/kg,全氮含量為 38.5g/kg?45.5g/kg,全磷含量為 9 g/kg?10.8 g/kg。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的小麥秸桿的全碳含量為28.lg/kg?35.6g/kg,全氮含量為 32.9g/kg ?46.8g/kg,全磷含量為 0.64 g/kg ?0.83 g/kg ο
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的核桃殼質(zhì)活性炭為粉末活性炭，比表面積為960m2/g,碘吸附值為820mg/g。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的石油降解菌種子液的制備采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在120r/min、3(TC條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的交界點(diǎn)，保證石油降解菌的數(shù)量達(dá)到IX 1ltl?5 X 101°個(gè)/mL。
7.按照權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的石油降解菌的吸附是在12(Tl60r/min、3(rC條件下培養(yǎng)吸附16?24h，使石油降解菌吸附在輔助載體上，保證吸附的菌量達(dá)到9 X 19?4.6 X 101°個(gè)/mL。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)的CaCl2溶液的濃度為lwt%?5wt%, Na2SO4溶液的濃度為10wt%。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)交聯(lián)成球后，將微球取出用生理鹽水洗滌；再放入Na2SO4溶液中，攪拌反應(yīng)2?4h，再用生理鹽水洗滌。
10.按照權(quán)利要求1至9任一所述的方法制備的石油降解菌固定化包埋顆粒的應(yīng)用，其特征在于:將制備的石油降解菌固定化包埋顆粒在無(wú)菌條件下按10Wt9T20wt%的比例接入增殖培養(yǎng)基中，120?160r/min、30°C條件下恒溫培養(yǎng)24h，然后濾掉培養(yǎng)基，以播種的方式對(duì)5(Tl00g/kg油污土壤按每平方米撒0.f Ikg石油降解菌固定化包埋顆粒，保持土壤30wt%?40wt%的水分含量,并對(duì)表層0?30cm 土壤進(jìn)行翻耕。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種石油降解菌固定化包埋顆粒的制備方法，包括：（1）將35.8wt%~46.5wt%的水葫蘆、14.2wt%~18.5wt%的小麥秸稈與35wt%~50wt%的核桃殼質(zhì)活性炭混合，作為輔助載體；（2）取3.0wt%~7.0wt%的輔助載體，接入10wt%~20wt%的石油降解菌種子液進(jìn)行吸附；（3）將8.0wt%~10wt%聚乙烯醇溶解于80~100℃水中，加1.2wt%~1.5wt%海藻酸鈉混勻，冷卻后加入余量的水；（4）將（2）和（3）混勻組成包埋體系，滴入CaCl2溶液中交聯(lián)成球，再轉(zhuǎn)入Na2SO4溶液中固定化，獲得固定化包埋顆粒。將本發(fā)明制備的石油降解菌固定化包埋顆粒應(yīng)用于石油污染土壤的原位修復(fù)，對(duì)石油污染土壤具有良好的修復(fù)效果。
【IPC分類(lèi)】C12N11-14, B09C1-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104560938
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310517924
【發(fā)明人】秦麗嬌, 張勝中, 鄧德剛, 周彤
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月29日