專利名稱：：一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生理生化檢測領(lǐng)域，涉及一種基于檢測乳腺癌ERa和ER卩相對表達水平的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是一種激素誘發(fā)的腫瘤，全球每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌，有50萬的婦女死于乳腺癌，在西歐、北美等發(fā)達國家，乳腺癌的發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位；我國乳腺癌的發(fā)病率近年來不斷地上升，并出現(xiàn)了年輕化的趨勢。根據(jù)乳腺癌激素誘發(fā)的特點，對患者進行內(nèi)分泌治療已有100多年的歷史。目前，針對雌激素受體(estrogenreceptor,ER)作為治療靶點，以雌激素受體拮抗劑，作為對ER陽性乳腺癌的第一線療法之一。ER屬于核受體超家族的成員之一，是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，它與雌激素特異性結(jié)合，通過雌激素應答元件(ERE)來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。人類ER有兩種亞型，即ERa和ER卩，分別定位于6號和14號染色體，其相對分子量分別為65和59kDa，編碼ERa和ER^的基因其NCBIGenbankERa和ERJ3的GeneID分別為2099和2100。ER是多結(jié)構(gòu)域蛋白，分為6個結(jié)構(gòu)域，按功能又可分為4個功能域轉(zhuǎn)錄激活功能域、DNA結(jié)合域、配體結(jié)合域和受體變構(gòu)過程中的鉸鏈區(qū)。在發(fā)現(xiàn)了第一個雌激素受體ERa后約10年，人們于1996年成功地克隆鑒定了第二個雌激素受體ER卩。兩者具有相似的生化特征，氨基酸序列具有一定的同源性，并且兩者的功能區(qū)非常相似，結(jié)構(gòu)上的相似性使兩種受體均可以識別并結(jié)合相似的ERE，但是這兩種受體結(jié)合的配體并不完全相同。臨床上使用雌激素受體拮抗劑治療乳腺癌的原理就是利用拮抗劑與17P-雌二醇競爭性結(jié)合ERa，減低雌激素對靶器官的剌激作用。近年來發(fā)現(xiàn)許多存在于植物中的非甾體化合物，其結(jié)構(gòu)和生物活性類似于雌激素，被稱為植物雌激素。研究較多的植物雌激素包括異黃酮類、木酚素類、香豆素類、真菌雌激素類及非黃酮類多酚化合物，如白藜蘆醇等。這些植物雌激素主要選擇性的與ER卩結(jié)合，而與ERa親和力較低。ERa主要分布于子宮、乳腺、胎盤、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼等雌激素的靶組織，而ERP的分布更為廣泛。除了上述在配體結(jié)合及組織分布方面的不同外，ERa和ER卩的轉(zhuǎn)錄活性及其與協(xié)同因子的相互作用也往往不同，提示兩者的功能和生物學效應存在很大差別。雌激素受體拮抗劑是目前應用最多的內(nèi)分泌治療方法，廣泛應用于各期乳腺癌一線內(nèi)分泌治療。它能與雌激素競爭激素受體，阻斷雌激素相關(guān)基因的表達，使癌細胞維持在Gl期，從而減慢細胞的分裂和生長。但約有30%的患者接受他莫昔芬(三苯氧胺)類藥物內(nèi)分泌治療并沒有取得明顯的治療效果，但其抗藥原因目前不清，對其耐藥機制的研究也成為熱點。雌激素受體(ER)作為乳腺癌病人預后因子以及治療靶點有著重要的臨床意義，腫瘤活檢檢測ER已經(jīng)成為選擇治療方案的常規(guī)步驟。目前，臨床實驗室采用免疫組織化學法檢測乳腺癌的ER表達水平時，使用的抗體大多只針對ERa或不能有效的區(qū)分ERa和ER卩。臨床乳腺癌組織活檢只根據(jù)ERa的表達情況考慮是否使用他莫昔芬類雌激素受體拮抗藥物，而忽視ER卩的檢測造成部分病人出現(xiàn)耐藥反應以及子宮內(nèi)膜癌等副作用。隨著醫(yī)療水平的提高，針對不同的患者的具體情況，結(jié)合相關(guān)治療靶點的表達狀態(tài)，提出乳腺癌個體化治療方法，能夠有效的避免用藥的副作用，提高治療、預后效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的解決的問題在于提供一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法，該方法采用實時定量PCR法檢測ERa和ERP在乳腺癌的相5對表達水平，預測雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性，為指導臨床乳腺癌個體化用藥提供可行性基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法，采用實時定量PCR法檢測ERa和ER|3在乳腺癌的相對表達水平，以對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性做出預測，具體包括以下步驟1)設(shè)計并合成ERa的PCR擴增引物對Pl和ERP的PCR擴增引物對P2:引物對P1為上游引物gcagggagaggagtttgtgt20;下游弓I物atgtgggagaggatgaggag20;引物對P2為上游引物tgtctgcagcgattacgca20;下游引物:gcgccggtttttatcgatt19;2)作為對照的正常組織ERa和ERP基因的mRNA表達水平檢測以乳腺癌旁5cm外的乳腺組織作為正常組織,破碎乳腺癌旁5cm外的乳腺活檢組織細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以PI和P2作為引物，相對實時熒光PCR檢測ERa和E鄧基因的mRNA表達水平作為正常對照；3)待測乳腺癌ERa和ERP基因的mRNA相對表達水平檢測破碎待測乳腺癌活檢組織的細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以PI和P2作為引物，相對實時熒光PCR檢測ERa和E鄧基因的mRNA相對表達水平；4)將待測乳腺癌活檢組織的ERa和ERp基因的相對表達水平與正常對照進行對比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性6當待測乳腺癌活檢組織的ERa/ERP的比值大于正常對照的ERa/ERp的比值時，該待測乳腺癌活檢組織對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為不耐藥性；否則，該待測乳腺癌活檢組織對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為耐藥性。所述的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物為雌激素衍生物、甾體類復合物或非甾體復合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果-1、本發(fā)明提供的基于檢測乳腺癌ERa和ER(3相對表達水平的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法，為指導臨床乳腺癌個體化用藥提供可行性基礎(chǔ)，能夠減少盲目用藥導致的耐藥反應和副作用。2、本發(fā)明提供的實時熒光定量PCR分析ERa和ERp相對表達水平，克服了目前免疫組織化學法檢測乳腺癌的ER表達水平時忽視ERP的檢測；而且mRNA水平的檢測準確、方便，以病人自身的乳腺活檢組織作為正常對照，對其癌組織的ERa和ERp相對表達水平檢測具有特異性，而且在擴增引物統(tǒng)一的基礎(chǔ)上便于標準化的實施。3、本發(fā)明提供的檢測ERa和ERI3引物的溶解曲線為單一峰，保證擴增產(chǎn)物的特異性，提高了檢測的準確性。4、本發(fā)明提供的預測方法還與藥物使用的預后性相關(guān)，ERa/ERp比值大于正常對照組病例的無復發(fā)生存率和總生存率均明顯高于ERo/ER|3比值小于正常對照組。圖1為是以ERa/ER(3雙陽性表達的乳腺癌細胞T-47D的cDNA基因組為模版，實時定量PCR絕對定量檢測表明引物對P1擴增的ERa溶解曲線為單一峰，其中橫坐標為溫度，縱坐標為實時定量PCR熒光值；圖2為是以ERa/ER(3雙陽性表達的乳腺癌細胞T-47D的cDNA基因組為模版，實時定量PCR絕對定量檢測表明引物對P2擴增的ERP溶解曲線為單一峰，其中橫坐標為溫度，縱坐標為實時定量PCR熒光值；圖3是實時定量PCR相對定量檢測ERa表達水平的直方圖，以正常乳腺組織ERamRNA表達水平作為參照，16例病理報告ER陽性乳腺癌中，6例癌標本ERa的表達高于正常對照，10例癌標本ERa的表達低于正常對照；圖4是實時定量PCR相對定量檢測ERP表達水平的直方圖，以正常乳腺組織ERpmRNA表達水平作為參照，16例病理報告ER陽性乳腺癌中，11例癌標本ERP的表達低于正常對照，5例癌標本ERP的表達與正常對照無顯著差異；圖5是基于實時定量PCR相對定量檢測ERa/ER|3的直方圖，以正常乳腺組織ERa與ER(3mRNA比值作為參照，16例病理報告ER陽性乳腺癌中，7例癌標本ERa/ERp比值大于正常組，9例癌標本ERa/ER卩比值小于正常組。具體實施例方式下面對本發(fā)明做詳細描述，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明對臨床乳腺癌組織ER陽性，并服用雌激素受體拮抗藥物的長期隨訪病人作為檢測對象，總結(jié)得到一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物(雌激素衍生物、甾體類復合物或非甾體復合物)耐藥性的預測方法，采用實時定量PCR法檢測ERa和ERP在乳腺癌的mRNA相對表達水平，以對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性做出預測，具體包括以下步驟1)設(shè)計并合成ERa的PCR擴增引物對Pl和ERP的PCR擴增引物對P2:引物對P1為上游引物gcagggagaggagtttgtgt20;下游弓I物atgtgggagaggatgaggag20;引物對P2為8上游引物tgtctgcagcgattacgca20;下游引物gcgccggtttttatcgatt19;并以P-actin基因的擴增作為內(nèi)參照，其擴增的引物對為上游引物atcatgtttgagaccttcaaca22;下、游引物:catctcttgctcgaatcca19;提取ERa/ER卩雙陽性表達的乳腺癌細胞T-47D細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄其基因組cDNA，并以其cDNA為模板實時熒光PCR絕對定量擴增ERa和E鄧，檢測Pl和P2作為擴增引物的特異性；結(jié)果如圖1、圖2所示，弓|物對Pl擴增的ERa、引物對P2擴增的ERJ3其溶解曲線均為單一峰，表明引物對Pl、P2能夠特異性的擴增ERa、ERP;所述實時熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)于1996年，該技術(shù)的核心是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，通過最后擴增的目標片段數(shù)量(通過分析熒光強度得出)對模板包含的目標基因定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的弓I物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行，本發(fā)明采用非探針類。實時熒光定量PCR分為絕對定量和相對定量，絕對定量用于判斷引物的優(yōu)劣及擴增產(chǎn)物的特異性；相對定量用于分析不同樣品的mRNA表達量的差異。實時熒光定量PCR采用Takara公司的SYBRGreen實時熒光定量PCRMasterMix，該Mix里含有SYBRGreenI可用于未標記引物的摻入法實時熒光定量PCR，每個樣本分別擴增目的基因和內(nèi)參照基因，并分別設(shè)兩個復孔。實時熒光定量PCR反應體系為SYBRGreenRealtimePCRMix12.5(ilRox0.5}xlcDNA5^1上游引物(10pM4U)lpl下游引物(10pM4d)1^1水5^1實時熒光定量PCR反應條件絕對定量95.0。C預變性10s，95.0。C變性5s，60.0°C退火及延伸34s，40個循環(huán);95.0。C變性15s，60.(TC退火及延伸60s，95.0。C變性15s，l個循環(huán)。相對定量95.0。C預變性10s，95.0'C變性5s，60.0'C退火及延伸34s，共45個循環(huán)；相對定量實時熒光定量PCR以正常對照設(shè)定為1，測出待測目標與正常對照的相對比值，分析其mRNA表達量的差異。2)作為對照的正常組織ERa和ERP基因的mRNA表達水平檢測-醫(yī)學上判定乳腺癌旁5cm外的乳腺組織為正常組織，實時熒光PCR檢測其ERa和ER卩基因的mRNA表達水平作為正常對照；待測乳腺癌旁5cm外的乳腺活檢組織中加入試劑Trizol，使用勻漿器破碎細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，以l3-actin的擴增作為內(nèi)參照，分別以P1和P2作為引物，相對實時熒光PCR檢測ERa和ERJ3的表達量作為正常對照；3)待測乳腺癌組織ERa和ERp基因的mRNA相對表達水平檢測分離待測乳腺癌活檢組織中加入試劑Trizol,使用勻槳器破碎細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，以P-actin基因的擴增作為內(nèi)參照，分別以Pl和P2作為引物，相對實時熒光PCR檢測ERa和ERP基因的mRNA相對表達水平；按照上述2)、3)所述方法，對臨床乳腺癌組織ER陽性，并服用他莫昔芬類雌激素受體拮抗藥物的長期隨訪病人作為檢測對象，以其自身的乳腺癌旁5cm的乳腺活檢組織的ERa和ERPmRNA表達水平作為正常對照；分析其乳腺癌活檢組織ERa和ERpmRNA相對表達水平實時定量PCR結(jié)果表明16例長期隨訪乳腺癌病人中，6例癌標本ERa的表達高于正常對照，10例癌標本ERa的表達低于正常對照，參見圖3;11例癌標本ER卩的表達低于正常對照，5例癌標本ERP的表達與正常對照無顯著差異，參見圖4;4)將待測乳腺癌ERa和ERp基因的相對表達水平與正常對照進行對比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性上述16例長期隨訪乳腺癌病人中，實時定量PCR結(jié)果表明7例癌標本ERa/ER卩比值大于正常組，9例癌標本ERct/E鄧比值小于正常組；結(jié)合病人的隨訪資料，7例ERa/ERJ3比值大于正常組的乳腺癌患者均未出現(xiàn)耐藥，而另外9例ERa/ERp比值小于正常組的患者有5例出現(xiàn)耐藥，而且ERa/ERj3比值大于正常組病例的無復發(fā)生存率和總生存率均明顯高于ERo/ERp比值小于正常組病例，具體數(shù)據(jù)參見表l，根據(jù)表1繪制的直方圖參見圖5。表1ERa/ER|3檢測結(jié)果及對于服用藥物的耐藥反應對照表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，三苯氧胺屬于雌激素衍生物，法樂通屬于雌激素衍生物，氟維司群屬于甾體類復合物，樞瑞屬于雌激素衍生物。總結(jié)得到ERa和ERP基因的相對表達水平與雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性的相關(guān)性為當待測乳腺癌活檢組織的ERa/ERp比值大于正常對照時，待測乳腺癌活檢組織對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為不耐藥性；當待測目標ERa/ERp比值小于正常對照組時，其雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性為耐藥性；雖然上述隨訪結(jié)果表明ERo/ER(3比值小于正常對照組時可能為不耐藥性，但由于ERa/ERp比值大于正常組病例的無復發(fā)生存率和總生存率均明顯高于ERa/ER(3比值小于正常組病例，因此，總體上將待測乳腺癌活檢組織的ERa/ER卩比值小于正常對照組時，待測乳腺癌活檢組織對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為歸結(jié)為耐藥性。12核苷酸序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學<120>—種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA〈13〉人工合成的引物對P1的上游引物<400>1gcagggagaggagtttgtgt20<210>2<211>20<212>DNA〈13〉人工合成的引物對P1的下游引物<400>2atgtgggagaggatgaggag20<210>3<211>20<212>DNA〈213〉人工合成的引物對P2的上游引物<400>3tgtctgcagcgattacgca20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成的引物對P2的下游引物<400>4gcgccggtttttatcgatt19<210>5<211>22<212>DNA<213>人工合成的P-actin基因擴增的上游引物<400>5atcatgtttg3gaccttc肌cs22<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成的(3-actin基因擴增的下游引物<400>6catctcttgctcgaatcca191權(quán)利要求1、一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法，其特征在于，采用實時定量PCR法檢測ERα和ERβ在乳腺癌的相對表達水平，以對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性做出預測，具體包括以下步驟1)設(shè)計并合成ERα的PCR擴增引物對P1和ERβ的PCR擴增引物對P2引物對P1為上游引物gcagggagaggagtttgtgt20；下游引物atgtgggagaggatgaggag20；引物對P2為上游引物tgtctgcagcgattacgca20；下游引物gcgccggtttttatcgatt19；2)作為對照的正常組織ERα和ERβ基因的mRNA表達水平檢測以乳腺癌旁5cm外的乳腺組織作為正常組織，破碎乳腺癌旁5cm外的乳腺活檢組織細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以P1和P2作為引物，相對實時熒光PCR檢測ERα和ERβ基因的mRNA表達水平作為正常對照；3)待測乳腺癌ERα和ERβ基因的mRNA相對表達水平檢測破碎待測乳腺癌活檢組織的細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA基因組作為模板，分別以P1和P2作為引物，相對實時熒光PCR檢測ERα和ERβ基因的mRNA相對表達水平；4)將待測乳腺癌活檢組織的ERα和ERβ基因的相對表達水平與正常對照進行對比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性當待測乳腺癌活檢組織的ERα/ERβ的比值大于正常對照的ERα/ERβ的比值時，該待測乳腺癌活檢組織對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為不耐藥性；否則，該待測乳腺癌活檢組織對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物表現(xiàn)為耐藥性。2、如權(quán)利要求1所述的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法，其特征在于，所述的雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物為雌激素衍生物、甾體類復合物或非甾體復合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性的預測方法，采用實時定量PCR法檢測ERα和ERβ在乳腺癌的相對表達水平，以對雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性做出預測，將待測目標ERα和ERβ基因的相對表達水平與正常對照進行對比，分析雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物的耐藥性當待測目標ERα/ERβ比值大于正常對照組時，其雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性為陰性；當待測目標ERα/ERβ比值小于正常對照組時，其雌激素受體拮抗劑類內(nèi)分泌藥物耐藥性為陽性。本發(fā)明提供的耐藥性的預測方法，為指導臨床乳腺癌個體化用藥提供可行性基礎(chǔ)，能夠減少盲目用藥導致的耐藥反應和副作用。文檔編號C12Q1/68GK101659994SQ20091002359公開日2010年3月3日申請日期2009年8月14日優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日發(fā)明者劉新平,燕李,李紹青,藥立波申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學