專(zhuān)利名稱：：一種檢測(cè)黃牛Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及一種檢測(cè)黃牛S&6基因第2015位單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。因此，通常所說(shuō)的SNPs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核苷酸的變化，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起；具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們?cè)诨蚪M中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類(lèi)?？偟恼f(shuō)來(lái)，cSNP比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周?chē)蛄械?/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對(duì)遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種:一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的"含義"相同；另一種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氮基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對(duì)編碼區(qū)SNPs的非同義突變來(lái)說(shuō)，它們可能對(duì)基因功能有直接的重要影響；尤其對(duì)于無(wú)義密碼子突變來(lái)說(shuō)，更可能會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能發(fā)揮，對(duì)個(gè)體的表現(xiàn)型產(chǎn)生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見(jiàn)，故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來(lái)發(fā)現(xiàn)SNPs:即DNA序列測(cè)定方法、PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過(guò)程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陽(yáng)性問(wèn)題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強(qiáng)。RFLP-PCR方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后引入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求。S&基因家族已于斑馬魚(yú)、人類(lèi)以及小鼠等許多物種中被鑒定出來(lái)。在脊椎動(dòng)物中，^X基因家族的成員廣泛地在許多組織中表達(dá)，其在調(diào)控胚胎正常的形態(tài)發(fā)育、器官發(fā)育及細(xì)胞的分化上扮演著重要的角色。S&6基因?qū)儆谙俅贵w分泌過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要參與調(diào)控體內(nèi)一些發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，或者稱之為選擇基因(selectorgene)。這類(lèi)基因是發(fā)育調(diào)控基因的最基層層次，其表達(dá)受上級(jí)發(fā)育調(diào)控基因和同層次上的其他同源異型基因的作用；從它們表達(dá)的多肽組成及性質(zhì)看，又是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，直接調(diào)節(jié)實(shí)施基因(realizationgene，屬結(jié)構(gòu)基因范疇)的表達(dá)活性。因此，Six6基因遺傳變異或SNP位點(diǎn)在動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)胚胎形成、生長(zhǎng)激素的調(diào)控、垂體分泌、眼睛發(fā)育調(diào)控等具有重要的作用。目前，對(duì)于&x6基因的研究多在小鼠、海洋魚(yú)及人類(lèi)上，主要在前腦發(fā)育、胚胎發(fā)育形成以及眼睛晶狀體發(fā)育中做出了大量的研究。關(guān)于動(dòng)物^c6基因遺傳變異的研究國(guó)內(nèi)外多見(jiàn)于小鼠、海洋魚(yú)等動(dòng)物，未見(jiàn)黃牛5&6基因遺傳變異或SNP研究的報(bào)道。目前中國(guó)黃牛基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如日增重、出生重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、坐骨端寬等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白
發(fā)明內(nèi)容_本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種檢測(cè)黃牛^c6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，利用RFLP-PCR方法針對(duì)其基因位點(diǎn)上的無(wú)義密碼子突變可能導(dǎo)致編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，提前淘汰掉產(chǎn)生無(wú)義密碼子突變的個(gè)體，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)-一種檢測(cè)黃?；騿魏塑账岫鄳B(tài)性的方法，以包含敘6基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛S/x6基因；用限制性內(nèi)切酶服"I消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Six6基因第所述的引物對(duì)p為-上游引物gggctgactgctgggctta19;下游弓I物gggcaactcagatgtcacactcgctggc28。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性4min,;94。C變性30s，65.5。C退火30s，72°C延伸15s，30~35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳為聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛S/x6基因第2015位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為209bp和70bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為209bp、182bp、70bp和27bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為182bp、70bp和27bp條帶；其中，單核苷酸多態(tài)性CC基因型為無(wú)義密碼子突變。本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對(duì)黃牛S&6基因第2015位點(diǎn)上的無(wú)義密碼子突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)?shù)?015位點(diǎn)由T突變?yōu)镃時(shí)，原有的終止信號(hào)TGA發(fā)生突變，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中轉(zhuǎn)錄不能及時(shí)終止，從而繼續(xù)延伸直到下次出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TGA為止。當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，轉(zhuǎn)錄過(guò)程mRNA多延伸12個(gè)堿基，相應(yīng)的蛋白質(zhì)多編碼了4個(gè)氨基酸(肽鏈由223個(gè)氨基酸變?yōu)?27個(gè)氨基酸)，使具有重要生理功能的腺垂體分泌過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子^x6基因所編碼蛋白的空間二、三級(jí)構(gòu)型發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物學(xué)功能；由于，黃牛為二倍體，因此當(dāng)5Yx6基因第2015位點(diǎn)的SNP為CC型時(shí)為無(wú)義密碼子突變。本發(fā)明提供的黃牛^x6基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，針對(duì)第2015位點(diǎn)由T突變?yōu)镃的轉(zhuǎn)換突變，通過(guò)引物設(shè)計(jì)人為的在下游引物的3'端引入堿基錯(cuò)配，當(dāng)由T變?yōu)镃時(shí)，PCR擴(kuò)增S&6基因后在錯(cuò)配位置形成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，而突變沒(méi)有發(fā)生時(shí)，PCR擴(kuò)增5^6基因后不能形成//7wl識(shí)別位點(diǎn)；通過(guò)電泳檢測(cè)分型可以準(zhǔn)確、快速、方便的檢測(cè)S/x6基因單核苷酸多態(tài)性不包含279bp條帶為CC基因型個(gè)體；不包含182bp條帶為T(mén)T基因型個(gè)體；同時(shí)包含209bp和182bp條帶為T(mén)C基因型個(gè)體；進(jìn)而對(duì)種群的SZx6基因SNP的等位基因頻率變化監(jiān)控。由于S&6基因功能涉及日增重、體高、體重、體斜長(zhǎng)、坐骨端寬等生長(zhǎng)性狀，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為S&6基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS),快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。圖1為黃牛5Vx6基因PCR產(chǎn)物電泳圖2為成功引入i^fll酶切位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳；圖3為黃牛S/x6基因包含終止密碼子的279bpPCR產(chǎn)物的i7/wl酶切電泳結(jié)果；圖4為黃牛Six6基因SNP的不同基因型測(cè)序圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對(duì)黃牛57x6基因第2015位點(diǎn)無(wú)義密碼子突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，下面結(jié)合對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛&x6基因含終止密碼子區(qū)域PCR引物的設(shè)計(jì)以NCBI所公布的海福特牛(NC一007308)序列為參考，利用Primer5.0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含黃牛S&6基因終止密碼子區(qū)域的PCR引物，其引物序列如下上游引物gggctgactgctgggctta19;下游引物-agaccaagcaacccagcg185以上述引物對(duì)黃?；蚪M擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含黃牛5Vx6基因(NC—007308序列)終止密碼子區(qū)域1765bp2147bp的383bp的基因片段，擴(kuò)增后片段的電泳檢測(cè)如圖l所示，其中，泳道110為檢測(cè)片段，泳道M為Marker;對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定后，其中，第1988bp2047bp的序列為如下所C3cttcggccatctccatC3cttccagtgacagcgagtg|tga|catctgagttgcccgcc^當(dāng)?shù)?015bp(即Six6基因CDS區(qū)第667位)的T突變?yōu)镃時(shí)，導(dǎo)致編碼第223位的密碼子由TGA(如劃線所示序列)突變?yōu)镃GA，從而形成終止密碼子突變，即由223Ter突變?yōu)?23Arg，這樣使得翻譯延伸12bp，到下一個(gè)終止密碼子TGA(如框線所示的序列)才終止，所編碼的肽鏈延長(zhǎng)了4個(gè)氨基酸殘基<精氨酸(Arg)谷丙氨酸(Gln)精氨酸(Arg)纈氨酸(Val)>;由于在2015bp處(SNP位點(diǎn))無(wú)自然酶切位點(diǎn)，不能通過(guò)直接酶切檢驗(yàn)，而如果在2017bp處人工設(shè)計(jì)PCR引物錯(cuò)配，由A錯(cuò)配為C;當(dāng)2015bp由T突變?yōu)镃時(shí)，PCR擴(kuò)增Six6基因產(chǎn)物的第2014bp2017bp序列為gcgc，形成了限制性內(nèi)切酶/^"I的酶切位點(diǎn)，當(dāng)在2015位點(diǎn)沒(méi)有突變時(shí)，PCR擴(kuò)增S&6基因產(chǎn)物的第2014bp2017bp序列為gtgc，限制性內(nèi)切酶M"I不能識(shí)別；這樣就可以對(duì)該位點(diǎn)SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)；因此設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物P為-上游引物gggctgactgctgggctta19;下游弓i物gggcaactcagatgtcacactcgctggc28;其中，引入的錯(cuò)配堿基為下游引物第27bp的C;引物P對(duì)應(yīng)擴(kuò)增的基因片段是敘6基因的1765bp2043bp的279bp的片段，擴(kuò)增后片段的電泳檢測(cè)如圖2所示，其中，泳道18為檢測(cè)片段，泳道M為Marker;當(dāng)用限制性內(nèi)切酶服"I對(duì)引物P對(duì)應(yīng)擴(kuò)增的基因片段酶切消化時(shí)，由于1835bp183Sbp還有一處識(shí)別位點(diǎn)，因此，能夠被切成2段或3段片段。b、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測(cè)黃牛的5^6基因片段1、黃牛樣本采集及基因組DNA提取1)黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以3個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的種群作為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見(jiàn)表l:河南南陽(yáng)牛(269)，陜西秦川牛(236)，河南平頂山市郟縣紅牛(435);表l黃牛樣本的采集<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2)血樣基因組DNA的分離、提取、純化1)冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500]iL至1.5mLEppendorf離心管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心10min(4°C)，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500pL，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37'C水浴lh;3)加蛋白酶K至3nL(20mg/mL)并混勻，55。C過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1piL蛋白酶K混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500|jL,溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中，重復(fù)一次；5)加氯仿500pL，充分混勻20min，4。C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24:1)500[iL，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL離心管中；7)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，直至白色的絮狀沉淀析出，-20°。保存30601^11;8)4。C，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9)4。C，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；10)干燥后的DNA溶于80100的TE液，4"C保存直至DNA完全溶解，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80匸保存。11)500nL的DNA溶液中加入10。/。SDS使其終濃度為0.1%，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到50pg/mL;12)5。C保溫10h左右；13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25:24:1)和氯仿分別抽提一次；14)12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無(wú)水乙醇沉淀DNA;16)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60pL滅菌超純水溶解，4°C待檢測(cè)。3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個(gè)1.5mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2:表2PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>25^L反應(yīng)體系包括0.625UTaqDNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2xBuffer12.5(內(nèi)含Mg"、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng4iL含5Vx6基因的黃?；蚪MDNA0.45^L,10pmol/nL上、下游引物各0.5^L;PCR反應(yīng)程序94。C預(yù)變性4min;94。C變性30s，，65.5。C退火30s，^30~35個(gè)循環(huán)；72°C延伸15s，，72。C延伸10min;對(duì)3個(gè)黃牛品種的940個(gè)樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得940個(gè)個(gè)體的黃牛S/:c6基因中包含該SNP位點(diǎn)的279bp的DNA片段。c、///^I酶切消化PCR擴(kuò)增的S/;c6基因片段1、報(bào)al酶切反應(yīng)消化體系(2530pL):10-15(iLPCR產(chǎn)物，10x緩沖液(含BSA)2.5~3.0mL,Hhal(10U/pL)為1.0~1.5|aL，1L516.5^L滅菌純水(H20);2、酶切消化條件37。C恒溫培養(yǎng)箱中消化510h。d、消化PCR產(chǎn)物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析1)制作10%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，200V電壓電泳52min，EB染色；2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時(shí)，在BIO-RADGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)成像；3)根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析SNP多態(tài)性用BIO-RADGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)照相分析，判斷SNP的多態(tài)性敘6基因的第2015bp由T突變?yōu)镃時(shí)，由于引入了堿基錯(cuò)配，PCR擴(kuò)增的S紅6基因產(chǎn)物的第2014bp2017bp序列為gcgc，限制性內(nèi)切酶識(shí)別后在gcg/c對(duì)擴(kuò)增片段酶切，切取27bp的下游引物片段，將擴(kuò)增片段切為3段；而&x6基因的第2015bp沒(méi)有發(fā)生突變，限制性內(nèi)切酶服"I不能識(shí)別堿基錯(cuò)配引入的酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段切為2段；由于黃牛為2倍體，所以黃?；蚪M的版6基因的第2015位的SNP的多態(tài)性的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果為T(mén)T基因型表現(xiàn)為209bp和70bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為209bp、182bp、70bp和27bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為182bp、70bp和27bp條帶；由于27bp較小，故在聚丙烯酰胺電泳分析中不太清楚，但通過(guò)209bp和182bp條帶還是能夠準(zhǔn)確的鑒別TT基因型、TC基因型和CC基因型不包含279bp條帶為CC基因型個(gè)體；不包含182bp條帶為T(mén)T基因型個(gè)體；同時(shí)包含182bp和209bp條帶為T(mén)C基因型個(gè)體；如圖3所示，其中，泳道l不包含279bp條帶，其為CC基因型個(gè)體，包含182bp和70bp條帶(27bp由于基因片段太小，電泳效果顯示不明顯)，泳道2、泳道5不包含182bp條帶，為T(mén)T基因型個(gè)體，包含209bp和70bp條帶，泳道3同時(shí)包含182bp和209bp條帶，為雜合子TC基因型個(gè)體，包含(209bp、182bp和70bp條帶(27bp由于基因片段太小，電泳效果顯示不明顯)，泳道M為MarkerI(600bp,500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。4)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證利用ABI377和ABI3730測(cè)序儀對(duì)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測(cè)序；同時(shí)，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含182bp和209bp條帶的雜合子TC基因型個(gè)體其2015位的測(cè)序圖的確表示為T(mén)或C，如圖4a所示，自左向右第7個(gè)峰為兩個(gè)峰，而CC基因型、TT基因型分別為C、T，如圖4b、c所示。e、黃牛S/x6基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析1)基因和基因型頻率基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。Paa二Naa/N，其中Paa代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式可以寫(xiě)成PA=(2NAA+NAal+NAa2+Naa3+NAa4+……+NAan)/2N其中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al—an為等位基因A的n個(gè)互不相同的復(fù)等位基因。在不同黃牛品種5^6基因SNP中的T等位基因頻率變化幅度在61.73%73.73%,C等位基因頻率變化幅度在26.27%38.27%之間，如表4所示。上述基因頻率的計(jì)算公式為PT=(2nTT+nTc)/2nPc=(2ncc+nTC)/2n其中，nTT:TT基因型數(shù)，nTC:TC基因型數(shù)，ncc:CC基因型數(shù)，n:總數(shù)；在所分析的中國(guó)黃牛群體中C等位基因頻率在26.27%38.27%之間，符合動(dòng)物分子標(biāo)記育種中SNP大于5.0%10%的要求，具備群體遺傳多樣性特征，可作為標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行育種。表4黃牛Six6基因第2015位SNP基因頻率分布表黃牛品種基因型的觀測(cè)數(shù)目總計(jì)(n)等位基因頻率TTTCCC940CT秦川牛12892162360.26270.7373南陽(yáng)牛121123252690.32160.6784郟縣紅牛139259374350.38270.6173核苷酸序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120>—種檢測(cè)黃牛Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法<160>2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成的引物對(duì)P上游引物<400>1gggctgactgctgggctta19<210>2<211>28<212>DNA<213>人工合成的引物對(duì)P下游引物<400>2gggcaactcagatgtcacactcgctggc28權(quán)利要求1、一種檢測(cè)黃牛Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含Six6基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Six6基因；用限制性內(nèi)切酶HhaI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Six6基因第2015位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為上游引物gggctgactgctgggctta19；下游引物gggcaactcagatgtcacactcgctggc28。2、如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛5^x6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性4min;94。C變性30s，65.5。C退火30s，72°C延伸15s，30~35個(gè)循環(huán)；72'C延伸10min。3、如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛S/x6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為10%。4、如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛S&6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛S&6基因第2015位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為209bp和70bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為209bp、182bp、70bp和27bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為182bp、70bp和27bp條帶；其中，單核苷酸多態(tài)性CC基因型為無(wú)義密碼子突變。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)黃牛Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Six6基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Six6基因；用限制性內(nèi)切酶HhaI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Six6基因第2015位的單核苷酸多態(tài)性；由于Six6基因功能涉及日增重、體高、體重、體斜長(zhǎng)、坐骨端寬等生長(zhǎng)性狀，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為Six6基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101629209SQ20091002359公開(kāi)日2010年1月20日申請(qǐng)日期2009年8月14日優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日發(fā)明者剛?cè)?屈玉嬌,淮永濤,璟王,胡沈榮,藍(lán)賢勇,賴新生,宏陳,雷初朝,亮馬申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)