本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。

背景技術(shù)：

micrornas(mirnas)是一類由18-24個堿基組成的非編碼單鏈小分子rna，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡等重要生物過程。最近的一些醫(yī)學(xué)研究表明，mirna的表達(dá)水平，或增大或減少，都在某種程度上與人類重大疾病如癌癥等有著密不可分的聯(lián)系。這使得mirna可以作為腫瘤標(biāo)記物來早期地監(jiān)控癌癥的發(fā)生。

mirna-21的編碼基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(vacuolemembraneprotein-1，vmp1)編碼區(qū)，vmp1基因的第十內(nèi)含子。vmp1也被稱為跨膜蛋白49(transmembraneprotein-49,tmem-49)。mirna-21對多種癌癥都有高表達(dá)，如：胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等等。因此mirna-21是一個公認(rèn)的致癌性小rna，對mirna-21進(jìn)行定量檢測可以有效的監(jiān)控癌癥的發(fā)生。

目前發(fā)展出了許多檢測mirna的方法，比如northern印跡技術(shù)、微陣列芯片(microarray)、實(shí)時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、電化學(xué)方法、熒光分析、電化學(xué)發(fā)光、比色分析等等。但上述方法都具有一定的局限性，比如檢測靈敏度低、缺乏足夠的分析物、特異性不佳、需要耗費(fèi)大量的時間和人力，而且經(jīng)常需要昂貴和繁瑣的工具和熟練的專業(yè)人員，限制了其在臨床診斷方面的潛在應(yīng)用。

熒光檢測方法，由于其靈敏度高、操作簡單，目前正在獲得越來越多的關(guān)注。然而，目前熒光傳感器具有一些特殊的局限性，包括探頭尺寸小，穩(wěn)定性低，光漂白，與背景熒光光譜相重疊，低豐度和高序列相似性等等。因此開發(fā)一種能夠快速、高選擇性和高靈敏度地檢測mirna-21的方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。本發(fā)明所述檢測mirnas-21的方法能夠快速、高選擇性和高靈敏度地檢測待測樣品中的mirnas-21含量。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種檢測mirnas-21的方法，將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合，檢測金納米棒修飾的聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光亮度的變化；

其中所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經(jīng)單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna堿基互補(bǔ)；h1探針與h2探針均為發(fā)夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發(fā)生鏈置換反應(yīng)。

作為優(yōu)選，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。

作為優(yōu)選，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。

作為優(yōu)選，所述金納米棒修飾的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。

作為優(yōu)選，所述待測樣品為血清。

本發(fā)明還提供了一種檢測mirnas-21的探針組，包括h1探針與h2探針，h1探針與h2探針均為發(fā)夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發(fā)生鏈置換反應(yīng)。

作為優(yōu)選，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。

本發(fā)明還提供了一種檢測mirnas-21的試劑盒，其特征在于，包括上述探針組。

作為優(yōu)選，所述的試劑盒還包括金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經(jīng)單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna堿基互補(bǔ)。

作為優(yōu)選，所述金納米棒修飾的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。

作為優(yōu)選，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明還提供了所述探針組、所述試劑盒在制備癌癥診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。本發(fā)明所述檢測mirnas-21的方法，將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合，檢測金納米棒修飾的聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光亮度的變化；其中所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經(jīng)單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna堿基互補(bǔ)；h1探針與h2探針均為發(fā)夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發(fā)生鏈置換反應(yīng)。本發(fā)明所述檢測mirnas-21的方法中修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna通過雜交配對形成金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，同時使聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光淬滅，將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合后，待測樣品中的目標(biāo)分子mirna-21可催化發(fā)夾探針自組裝，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna進(jìn)行單鏈取代，金納米棒與聚二乙炔微米管脫離，從而使聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光從淬滅轉(zhuǎn)而恢復(fù)，根據(jù)熒光變化強(qiáng)度可檢測待測樣品中的mirnas-21的含量。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述檢測方法，對mirna-21顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光恢復(fù)的具體反應(yīng)原理示意圖；

圖2示實(shí)施例1單鏈dna修飾微米管的反應(yīng)過程的示意圖(a)及修飾的微米管紅外光譜(b)和拉曼光譜圖(c)；其中圖(b)中i代表聚二乙炔微米管的紅外光譜圖，ii代表聚二乙炔微米管和烯丙基縮水甘油醚反應(yīng)后得到雙鍵修飾的聚二乙炔微米管的紅外光譜圖，1130cm^-1代表c-o-c鍵的伸縮振動，923cm^-1代表c＝ch鍵的伸縮振動；圖(c)中i代表雙鍵修飾的聚二乙炔微米管的拉曼光譜圖，ii代表單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管拉曼光譜圖，多出來的峰為dna的特征峰；

圖3示實(shí)施例3單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交的反應(yīng)過程的示意圖(a)及得到的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管的xps光譜圖(b)和的光波導(dǎo)熒光變化(c)；其中圖(b)中i代表單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管的xps光譜圖，ii代表單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交后的xps光譜圖，雜交后微米管表面有金元素，表明雜交成功；圖(c)單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交后，微米管端頭熒光光譜變化圖，隨著單鏈dna修飾的金納米棒濃度不斷提高，微米管端頭熒光強(qiáng)度不斷降低；

圖4示實(shí)施例4金納米棒修飾的聚二乙炔微米管在疏水片上反應(yīng)的濃縮富集效應(yīng)示意圖(a)，金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測mirna-21的示意圖(b)及不同濃度mirna-21反應(yīng)后的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管光波導(dǎo)熒光變化(c)；其中圖(a)中在疏水片上進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)濃縮富集效應(yīng)，反應(yīng)物集中于微米管表面發(fā)生反應(yīng)；圖(b)中在金納米棒-微米管體系中，由532nm光激發(fā)后，微米管端頭熒光微弱，當(dāng)加入檢測的mirna-21后，微米管端頭熒光亮度增強(qiáng)；圖(c)在金納米棒-微米管體系中，加入不同濃度的mirna-21溶液，濃度由10fm到50pm，微米管端頭熒光逐漸恢復(fù)，并且從10fm到100fm的濃度范圍內(nèi)，微米管端頭熒光變化和mirna-21的濃度成比例關(guān)系；

圖5示實(shí)施例5金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測不同濃度的mirna-21光波導(dǎo)熒光變化圖(a)及檢測極限圖(b)；在金納米棒-微米管體系中，加入不同濃度的mirna-21溶液，濃度由10fm到50pm，微米管端頭熒光逐漸恢復(fù)，并且從10fm到100fm的濃度范圍內(nèi)，微米管端頭熒光變化和mirna-21的濃度成比例關(guān)系；

圖6示實(shí)施例6金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測不同濃度mirna-21、單堿基錯配mirna-21、三堿基錯配mirna-21、mirna-144、mirna-199a的光波導(dǎo)熒光變化圖；

圖7示實(shí)施例7金納米棒修飾的聚二乙炔微米管檢測健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清、胃癌病人的血清的光波導(dǎo)熒光變化變化圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明所述檢測mirnas-21的方法中修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna通過雜交配對形成金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，同時使聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光淬滅；將金納米棒修飾的聚二乙炔微米管與h1探針、h2探針和待測樣品混合后，待測樣品中的目標(biāo)分子mirna-21可催化發(fā)夾探針自組裝，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna進(jìn)行單鏈取代，金納米棒與聚二乙炔微米管脫離，從而使聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光從淬滅轉(zhuǎn)而恢復(fù)。根據(jù)熒光變化強(qiáng)度可檢測待測樣品中的mirnas-21的含量。

聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光恢復(fù)的具體反應(yīng)原理如圖1所示。mirna-21通過紅色toehold端把h1探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，并和h1探針雜交形成h1-mir-21。h2探針通過藍(lán)色toehold端把h1-mir-21中的mirna-21替換下來，h1和h2雜交形成h1-h2。在這一過程中，mirna-21可看做催化劑，使反應(yīng)循環(huán)發(fā)生，同時mirna-21不消耗，從而提高微米管傳感器檢測target的靈敏度，降低反應(yīng)極限。

本發(fā)明所述聚二乙炔微米管采用聚二乙炔化合物材料，能將檢測與顯示集為一體，是一種非常理想的傳感器材料。本發(fā)明通過組裝方法制備一維聚二乙炔微米管，構(gòu)筑高靈敏度、高選擇性的新型生物傳感器用于復(fù)雜生物環(huán)境中的mirna的檢測。

本發(fā)明用于制備聚二乙炔微米管的氨基雙炔單體的方法如下：二乙炔分子與1.2倍當(dāng)量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)及1.2倍當(dāng)量的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)溶解于30ml精制的二氯甲烷中，25℃條件下磁子攪拌反應(yīng)6小時，得到的產(chǎn)物經(jīng)過旋蒸、萃取，再加入1.1倍當(dāng)量的乙二胺液體溶于二氯甲烷溶劑中，30℃下磁子攪拌反應(yīng)1小時，最后經(jīng)過萃取、旋蒸，得到氨基雙炔單體。

本發(fā)明所述聚二乙炔微米管的制備方法具體為：取0.0056g氨基雙炔與0.00075g十八胺取代的三聚氰胺溶于2ml的無水乙醇溶液中，將溶液倒入到75℃的300ml超純水中，超聲60min后置于黑暗處自然冷卻至室溫，再放入4℃的冰箱中過夜，即可得到復(fù)合囊泡。在稱量瓶分別加入10ml囊泡溶液與10μl的硝酸鉛溶液，在室溫下敞開放置于通風(fēng)處，兩至三周后出現(xiàn)白色絲狀物質(zhì)的析出，即得到聚二乙炔微米管。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管的制備方法具體為：聚二乙炔微米管從稱量瓶中取出，置于254nm的紫外燈管下，照射10分鐘，使雙炔聚合變成藍(lán)相。藍(lán)相的雙炔置于80℃加熱10分鐘，使其變?yōu)榧t相。取20μl烯丙基縮水甘油醚稀釋至10ml，加入微米管，30℃下反應(yīng)過夜，得到雙鍵修飾的微米管。將單根微米管與200μl的巰基修飾的單鏈dna及2959光引發(fā)劑(n(2959):n(dna)＝1:100)混合均勻，在365nm光照下反應(yīng)6小時，得到單鏈dna修飾的微米管。

進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述單鏈dna修飾的金納米棒的制備方法具體為：通過種子生長法制備出金納米棒，與巰基修飾的單鏈dna進(jìn)行孵育，得到單鏈dna修飾的金納米棒。

在一些實(shí)施方案中，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。

在一些實(shí)施方案中，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。

在一些實(shí)施方案中，所述金納米棒修飾的聚二乙炔微米管固定在疏水片上。疏水片具有濃縮富集效應(yīng)，可使h1探針、h2探針和待測樣品混合的液滴聚集在金納米棒修飾的聚二乙炔微米管表面，提高反應(yīng)靈敏度，降低反應(yīng)極限。

按照本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本發(fā)明所述待測樣品包括但不限于血清。

本發(fā)明還提供了一種檢測mirnas-21的探針組，包括h1探針與h2探針，h1探針與h2探針均為發(fā)夾探針，在mirnas-21存在下可自組裝形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后通過toehold與修飾金納米棒的單鏈dna發(fā)生鏈置換反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述h1探針的序列如seqidno：3所示；所述h2探針的序列如seqidno：4所示。

本發(fā)明還提供了一種檢測mirnas-21的試劑盒，包括上述探針組。

在一些實(shí)施方案中，所述的試劑盒還包括金納米棒修飾的聚二乙炔微米管，所述金納米棒和聚二乙炔微米管分別經(jīng)單鏈dna修飾，且修飾金納米棒的單鏈dna與修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna堿基互補(bǔ)。

在一些實(shí)施方案中，所述修飾金納米棒的單鏈dna的序列如seqidno：1所示；所述修飾聚二乙炔微米管的單鏈dna的序列如seqidno：2所示。

在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明分別向不同的單根聚二乙炔微米管上滴加mirna-21、單堿基錯配mirna-21、三堿基錯配mirna-21、mirna-144、mirna-199a，然后加入h1探針、h2探針，結(jié)果顯示只有加入mirna-21時聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光變化強(qiáng)烈，表明聚二乙炔微米管檢測mirna-21具有良好的選擇性。

在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明向單根微米管上滴加h1探針、h2探針及健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清或胃癌病人的血清，結(jié)果顯示，患有癌癥的病人血清，其mirna-21信號表達(dá)明顯高于健康人血清。

因此本發(fā)明還提供了所述探針組、所述試劑盒在制備癌癥診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果之一：對mirna-21的檢測顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測手段簡單。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

如無特殊說明，本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。

實(shí)施例1：單鏈dna修飾的微米管的制備

取20μl烯丙基縮水甘油醚稀釋至10ml，加入聚二乙炔微米管，30℃下反應(yīng)過夜，得到雙鍵修飾的聚二乙炔微米管。將單根聚二乙炔微米管與200μl的5’端巰基修飾的單鏈dna(ssdna1序列如seqidno：1所示)、2959光引發(fā)劑(n(2959):n(ssdna1)＝1:100)混合均勻，在365nm光照下反應(yīng)6小時，得到單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管。其中單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管的微米管紅外光譜見圖2b，單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管拉曼光譜見圖2c。

實(shí)施例2：單鏈dna修飾金納米棒

通過種子生長法制備出金納米棒，純化后與5’端巰基修飾的單鏈dna(ssdna2序列如seqidno：2所示)進(jìn)行孵育(金納米棒與dna的摩爾比為1:25600)，得到單鏈dna修飾的金納米棒。具體操作為：首先向7.5ml的0.1m的十六烷基三甲基溴化銨(ctab)溶液中加入250μl的0.01m的氯金酸，并攪拌均勻。然后加入600μl的0.01m的硼氫化鈉溶液(硼氫化鈉提前在-20℃下放置10分鐘)，之后在機(jī)械攪拌下(轉(zhuǎn)速400rpm)攪拌2分鐘。2分鐘后會形成淺棕色的溶液，即為金種子溶液。金種子溶液需在室溫下放置1小時后使用。生長溶液的制備:機(jī)械攪拌條件下(攪拌速度為250rpm)，將9.5ml的0.1m的十六烷基三甲基溴化銨，400μl的0.01m的氯金酸混合，攪拌均勻，加入60μl0.01m的硝酸銀，然后將64μl的0.1m的抗壞血酸加入上述溶液中，觀察到此時溶液的顏色由亮黃色變?yōu)闊o色透明，說明弱還原劑抗壞血酸將au³⁺還原成au⁺。最后把20μl的金種子加入上述溶液中，攪拌1分鐘后停止攪拌，靜置一夜即可得到金納米棒。整個實(shí)驗(yàn)過程要求避光，溫度為25℃。。將制得的金納米棒在13000rcf下離心30分鐘，移除上清液，沉淀溶解在10mmpbs中(ph＝8.0，包含0.3％(w/v)十二烷基硫酸鈉)。將此過程重復(fù)三次，最后得到10ml純化的金納米棒，懸浮在上述緩沖溶液中。然后加入10ml聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液(10％w/v)，在40℃下攪拌18小時。反應(yīng)完成之后離心，移除上清液，重新分散在含有0.3％十二烷基硫酸鈉的pbs中，。這個過程重復(fù)三次。之后測試紫外吸收光譜，根據(jù)朗伯比爾定律a＝kbc，算出金納米棒的濃度。得到金納米棒的具體濃度后，加入巰基修飾的dna。所加入的dna提前用三(2-羧乙基)膦處理2小時，使得被氧化了的巰基被還原。然后按照dna與金納米棒摩爾比為25600：1加入dna，超聲5秒后，室溫下放置16小時。反應(yīng)完成后加鹽熟化以減弱金納米棒與dna之間的靜電相互作用，使更多的dna與金納米棒反應(yīng)。鹽溶液為10mmpb(ph＝8.0)、300mm氯化鈉、4mm氯化鎂、0.3％十二烷基硫酸鈉的混合溶液。每隔半小時加一次，使得最終鹽濃度為150mm氯化鈉，2mm氯化鎂。。室溫下放置16小時后，在9300rcf離心3次，每次30分鐘。這個過程重復(fù)3次。最終將制備好的單鏈dna修飾金納米棒懸浮于緩沖液中，置于4℃冰箱保存。

實(shí)施例3：金納米棒修飾的聚二乙炔微米管

將單鏈dna修飾的金納米棒與單鏈dna修飾的聚二乙炔微米管雜交，得到金納米棒修飾的聚二乙炔微米管。具體操作為：用針管挑出單根的聚二乙炔微米管于小試管中，浸沒于200μl單鏈dna修飾的金納米棒溶液中，置于90℃水浴環(huán)境中5分鐘。之后將小試管移出水浴鍋緩慢降溫至室溫，降溫時間約為1h-2h。反應(yīng)完成后，用針管從金納米棒溶液中挑出聚二乙炔微米管，用超純水輕輕地沖洗微米管數(shù)次，除去未吸附的金納米棒。

對得到金納米棒修飾的聚二乙炔微米管進(jìn)行光波導(dǎo)熒光變化的檢測，結(jié)果見圖3c。xps光譜檢測結(jié)果見圖3b。結(jié)果顯示雜交后微米管表面有金元素，表明雜交成功，獲得金納米棒修飾的聚二乙炔微米管。

實(shí)施例4：檢測mirna

將實(shí)施例3得到的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管置于疏水片上，滴加10μl包含h1(300nm，序列如seqidno：3所示)探針、h2(1000nm，序列如seqidno：4所示)探針、mirna-21(序列如seqidno：5所示)的溶液，室溫下放置2h，超純水清洗后進(jìn)行光波導(dǎo)熒光變化的檢測，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示在疏水片上進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)濃縮富集效應(yīng)，反應(yīng)物集中于微米管表面發(fā)生反應(yīng)。在金納米棒-微米管體系，由532nm光激發(fā)后，微米管端頭熒光微弱，當(dāng)加入檢測的mirna-21后，微米管端頭熒光亮度增強(qiáng)。隨著加入的mirna-21濃度的逐漸增強(qiáng)，微米管端頭熒光逐漸恢復(fù)。實(shí)施例5：靈敏度檢測

將實(shí)施例3得到的金納米棒修飾的聚二乙炔微米管至于疏水片上，滴加10μl包含h1(300nm)探針、h2(1000nm)探針、mirna-21的溶液。其中mirna-21的濃度由10fm增加到50pm，觀察金納米棒修飾的聚二乙炔微米管端頭光波導(dǎo)熒光亮度的變化結(jié)果見圖5a。以mirna-21濃度為橫坐標(biāo)，以金納米棒修飾的聚二乙炔微米管光波導(dǎo)熒光亮度變化為縱坐標(biāo)，計(jì)算檢測極限，結(jié)果見圖5b。

結(jié)果顯示，在金納米棒-微米管體系中，加入不同濃度的mirna-21溶液，濃度由10fm到50pm，微米管端頭熒光逐漸恢復(fù)，并且從10fm到100fm的濃度范圍內(nèi)，微米管端頭熒光變化和mirna-21的濃度成比例關(guān)系。

實(shí)施例6：專一性檢測

分別向不同的實(shí)施例3得到的金納米棒修飾的單根聚二乙炔微米管上滴加10μlmirna-21、單堿基錯配mirna-21(序列如seqidno：6所示)、三堿基錯配mirna-21(序列如seqidno：7所示)、mirna-144(序列如seqidno：8所示)、mirna-199a(序列如seqidno：9所示)，然后分別加入h1(300nm)探針、h2(1000nm)探針，室溫下放置2h，超純水清洗后進(jìn)行光波導(dǎo)熒光變化的檢測，觀察金納米棒修飾的聚二乙炔微米管對mirna-21的專一性，結(jié)果見圖6。

結(jié)果顯示，在四個濃度下，金納米棒修飾的聚二乙炔微米管分別與單堿基錯配的mirna-21，三堿基錯配的mirna-21，mirna-144，mirna-199a反應(yīng)后，金納米棒修飾的聚二乙炔微米管的熒光無法恢復(fù)。當(dāng)加入mirna-21時，發(fā)現(xiàn)金納米棒修飾的聚二乙炔微米管的熒光恢復(fù)。表明本發(fā)明所述檢測方法對于mirna-21有較好的檢測專一性。

實(shí)施例7：血清檢測

分別向不同的實(shí)施例3得到的金納米棒修飾的單根聚二乙炔微米管上滴加含有健康人的血清、胰腺癌病人的血清、乳腺癌病人的血清、胃癌病人的血清，然后分別加入h1(300nm)探針、h2(1000nm)探針，室溫下放置2h，超純水清洗后進(jìn)行光波導(dǎo)熒光變化的檢測，結(jié)果見圖7。

結(jié)果顯示，患有三種癌癥的病人血清，其信號表達(dá)明顯高于健康人血清。

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<110>中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)

<120>一種檢測mirnas-21的方法、探針組及試劑盒

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