專利名稱：肝臟特異的與肝癌分化和進(jìn)展相關(guān)的基因和蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝臟特異的與肝癌分化、進(jìn)展相關(guān)的新蛋白和編碼該種蛋白的基因，尤其涉及基因HCC-C11及其3個(gè)剪切變異體，并進(jìn)一步涉及這種蛋白和基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌是人類(lèi)原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，也是全世界最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，尤其在東南亞及非洲，它的發(fā)病率更高。除了極高的發(fā)病率外，肝細(xì)胞癌還以高惡性度和高死亡率著稱，如果不進(jìn)行治療，從診斷到死亡的預(yù)期壽命約是6個(gè)月，5年存活率小于3％；若單純行手術(shù)治療，小肝癌的五年存活率為62.7％，大肝癌的僅為37.1％。就中國(guó)而言，每年約有110,000人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人數(shù)的四分之一。這種高死亡率，主要是由于早期肝癌缺乏特異臨床癥狀，導(dǎo)致大部分患者就診遲，而又缺乏有效治療手段及術(shù)后易復(fù)發(fā)所致。發(fā)病率高、惡性度高、診斷遲、治療方法少、預(yù)后差，是肝癌的幾大特點(diǎn)。盡管?chē)?guó)內(nèi)外科研人員都對(duì)肝癌進(jìn)行了多方面的研究，但目前肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理還不太清楚，對(duì)肝癌的治療也主要是采取手術(shù)治療及局部或全身化療，少數(shù)病人輔以腫瘤生物療法，但術(shù)后生存期仍不盡人意。為此，對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理的研究成為當(dāng)前的迫切要求，希望籍此早日闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，并找到特異的分子標(biāo)志，或與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子，以便隨訪高危人群，有效預(yù)防、早日診斷、綜合治療、減少?gòu)?fù)發(fā)。
以前的研究表明，肝癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多步驟的過(guò)程，這一過(guò)程中伴隨著機(jī)體許多的細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)的改變，出現(xiàn)多種基因表達(dá)異常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因滅活，激發(fā)異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡異常，從而使得細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并隨著各種分子異常的累積，腫瘤出現(xiàn)進(jìn)展、轉(zhuǎn)移。此外，肝癌在分子水平的改變是異質(zhì)性的，可能存在多個(gè)基因，多個(gè)途徑交疊作用。所以，明確這些差異表達(dá)的基因，對(duì)于肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的闡明和對(duì)肝癌的臨床診斷、治療都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種肝臟特異的與肝癌分化、進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)和編碼這種蛋白質(zhì)的新基因，并進(jìn)一步提供了這種蛋白質(zhì)和基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種肝臟特異的與肝癌分化、進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)HCC-C11，它具有圖4A中的氨基酸序列。進(jìn)一步涉及包含上述蛋白質(zhì)的融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因序列。優(yōu)選該基因序列為HCC-C11基因或HCC-C11基因的剪切變異體；HCC-C11的剪切變異體優(yōu)選為基因HCC-C11_V1，基因HCC-C11_V2或基因HCC-C11_V3。
本發(fā)明還提供了所述的蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明又提供了一種所述的基因在肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明表明，我們克隆出的新基因HCC-C11及其剪切變異體是一個(gè)肝臟特異表達(dá)的與肝癌組織分化及進(jìn)展相關(guān)的基因，對(duì)于它的功能的研究，將有助于肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理的闡明。目前對(duì)于肝癌的術(shù)后診斷，主要依賴于腫瘤的大小、轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)近及組織學(xué)檢查。但由于腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移在早期是一個(gè)微觀的過(guò)程，僅憑目前的檢查手段及臨床觀察，對(duì)于腫瘤的臨床分期，難于做出精確的診斷。并且由于腫瘤的異質(zhì)性，即便是組織學(xué)上相同的肝癌，它們之間的遺傳學(xué)改變也可能明顯不同。HCC-C11及其剪切變異體mRNA表達(dá)與肝癌組織分化和進(jìn)展的關(guān)系，可望作為肝癌的臨床分期及組織分化診斷的分子標(biāo)志，從而精確診斷肝癌的分期及組織分化，指導(dǎo)肝癌手術(shù)后的相應(yīng)輔助治療。HCC-C11及其剪切變異體基因組織表達(dá)的特異性，以及在中低分化肝癌及中晚期肝癌中的低表達(dá)，可視為肝臟特異的抑癌基因，并且這四種基因編碼同樣的蛋白質(zhì)HCC-C11，這些基因和蛋白都可能為將來(lái)發(fā)展肝癌的肝臟特異的治療提供一個(gè)較好的靶點(diǎn)。晚期肝癌中的HCC-C11及其剪切變異體mRNA的低表達(dá)及不表達(dá)，也可作為肝癌預(yù)后判斷的一個(gè)指標(biāo)。


圖1A為HCC-C11的5’RACE其中泳道MK為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為用下游外側(cè)引物C11RTA與上游引物UPM擴(kuò)增的RACE-PCR產(chǎn)物；泳道2為用下游內(nèi)側(cè)引物C11-4與上游引物UPM擴(kuò)增的RACE-PCR產(chǎn)物。箭頭所指為每個(gè)PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增條帶。
圖1B為HCC-C11的5’RACE和3’RACE其中泳道MK為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為5’RACE用下游引物C11-8與上游引物AUAP進(jìn)行巢式RACE-PCR的產(chǎn)物；泳道2為3’RACE用上游外側(cè)引物C11S與下游引物UPM擴(kuò)增的第一輪RACE-PCR的產(chǎn)物；泳道3為3’RACE用上游內(nèi)側(cè)引物C11-1與下游引物UPM擴(kuò)增的巢式PCR的產(chǎn)物。箭頭所指為每個(gè)PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增條帶。
圖2A為HCC-C11基因及其變異體全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增其中泳道MK為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為HCC-C11基因及其變異體全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2B為HCC-C11基因及其變異體Northern blot驗(yàn)證圖其中所用肝癌標(biāo)本為最初用于消減雜交的早期高分化肝癌，每個(gè)泳道上樣40μg總RNA，Ca指示此泳道上樣的為肝癌組織的RNA，Adj指示此泳道上樣的為癌旁組織的RNA。用G3PDH雜交做為上樣對(duì)照。
圖3為HCC-C11基因及其變異體的基因結(jié)構(gòu)圖其中方框代表外顯子，方框內(nèi)的數(shù)字為外顯子的編號(hào)，每個(gè)外顯子的大小見(jiàn)方框上的指示。
圖4A為HCC-C11基因的核苷酸序列及其編碼的HCC-C11蛋白的氨基酸序列。
圖4B為HCC-C11_v1基因的核苷酸序列。
圖4C為HCC-C11_v2基因的核苷酸序列。
圖4D為HCC-C11_v3基因的核苷酸序列。
圖5A為HCC-C11 mRNA在16種正常組織中的表達(dá)其中Po(positive control)陽(yáng)性對(duì)照；He(heart)心臟；Br(brain)腦；Pl(placenta)胎盤(pán)；Lu(lung)肺；Li(liver)肝臟；Sk(skeletal muscle)骨骼?。籏i(kidney)腎臟；Pa(pancreas)胰腺；Sp(spleen)脾臟；Th(thymus)胸腺；Pr(prostate)前列腺；Te(testis)睪丸；Ov(ovary)卵巢；In(intestine)小腸；Co(colon)結(jié)腸；Le(leucocytes)白細(xì)胞；Ne(negative control)陰性對(duì)照。
圖5B為HCC-C11 mRNA在6種肝癌細(xì)胞系、胎肝、膽囊中的表達(dá)其中Po(positive control)陽(yáng)性對(duì)照；7701QGY7701細(xì)胞系；7702QGY7702細(xì)胞系；7703QGY7703細(xì)胞系；7721SMMC7721細(xì)胞系；HLE；Hep2G；FL(fetal liver)胎肝；GB(gall bladder)膽囊。
圖6A為HCC-C11基因及其3個(gè)剪切變異體的mRNA在5對(duì)人原發(fā)性肝癌中的表達(dá)其中T代表模板為來(lái)自于癌組織標(biāo)本(tumorous tissue)的cDNA，N代表模板為來(lái)自于癌旁組織標(biāo)本(non-tumorous tissue)的cDNA；數(shù)字編號(hào)代表標(biāo)本來(lái)自不同病例，編號(hào)相同的T和N代表標(biāo)本來(lái)自于同一個(gè)病例。
圖6B為HCC-C11基因及其3個(gè)剪切變異體的mRNA在10份肝硬化組織中的表達(dá)其中C代表模板為來(lái)自肝硬化組織標(biāo)本(cirrhotic liver tissue)的cDNA，數(shù)字編號(hào)代表標(biāo)本來(lái)自不同病例。
圖6C為HCC-C11基因及其3個(gè)剪切變異體的mRNA在9份正常肝及1份睪丸組織中的表達(dá)。
其中L代表模板為來(lái)自正常肝組織(liver tissue)標(biāo)本的cDNA，數(shù)字編號(hào)代表不同標(biāo)本。Te代表模板為來(lái)自正常睪丸組織(testis tissue)的cDNA。
其中圖6A-6C中的G3PDH作為參照基因，檢測(cè)每份標(biāo)本的質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)體系和結(jié)果的可信度。
圖7為HCC-C11基因的原位雜交圖(40×)其中A為早期中分化肝癌的癌組織用反義探針雜交的結(jié)果。
B為肝癌細(xì)胞系BEL7402細(xì)胞用反義探針雜交的結(jié)果。
C為早期中分化肝癌的癌旁組織用反義探針雜交的結(jié)果。
D為癌旁組織用正義探針雜交的對(duì)照。圖7中黑色的信號(hào)為陽(yáng)性信號(hào)。圖8重組pET32(a)-C11融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果其中泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
泳道2為空pET32(a)載體誘導(dǎo)后4小時(shí)的菌體裂解物。箭頭所指示的條帶為pET32(a)載體表達(dá)的硫氧還原蛋白(Thioredoxin，trxA)。
泳道3-7為pET32(a)-C11融合蛋白的對(duì)照及不同時(shí)間的誘導(dǎo)產(chǎn)物。其中泳道3為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前，即0小時(shí)的表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照。泳道4為不誘導(dǎo)下重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照。
泳道5為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)4小時(shí)的表達(dá)情況。泳道6為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)6小時(shí)的表達(dá)情況。泳道7為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)10小時(shí)的表達(dá)情況。箭頭所指示trxA-C11融合蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.HCC-C11基因及3個(gè)剪切變異體的克隆過(guò)程(1)肝癌中差異表達(dá)cDNA片斷C11的發(fā)現(xiàn)尋找癌與癌旁組織中差異表達(dá)的基因，目前已經(jīng)成為了解細(xì)胞惡性表型的分子基礎(chǔ)的一個(gè)重要手段。近年來(lái)發(fā)展了多種篩選差異表達(dá)基因的方法，包括差異顯示PCR，消減雜交，代表性差異顯示(representational differenceanalysis)，Microarray等，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。抑制消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractive hybridization，SSH)是一個(gè)敏感性高，能夠篩選低豐度基因的有效方法，它通過(guò)兩輪雜交，兩輪抑制PCR，有效平衡高豐度和低豐度的基因，從而使低豐度的差異表達(dá)基因得以克隆，并可能發(fā)現(xiàn)組織特異的一些基因。自SSH問(wèn)世以來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員已利用此技術(shù)在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域克隆了許多基因。
為了篩選原發(fā)性肝細(xì)胞癌中差異表達(dá)的基因，我們利用Clontech公司的SSH試劑盒(PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit)，選取了一例早期高分化肝癌標(biāo)本作為材料，采用抑制消減雜交技術(shù)，以肝癌組織作為檢測(cè)者(tester)，相應(yīng)的癌旁組織作為驅(qū)趕者(driver)，進(jìn)行了抑制消減雜交。
首先按TRIzol試劑盒(Gibco公司)的操作說(shuō)明提取肝癌及癌旁組織總RNA1)組織勻漿在液氮浴中把組織標(biāo)本研磨為粉狀，加入適量TRIzol試劑(50-100mg組織加入1ml TRIzol)，繼續(xù)研磨至勻漿液清亮為止，分裝1ml每管(1.5ml eppendorf)室溫孵育5分鐘。2)抽提每管加入0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，劇烈震蕩15秒，室溫孵育2-3分鐘，4ε，12,000g離心15分鐘。3)RNA沉淀吸取上清至新管(每1ml TRIzol約有600μl上清)，加入等體積異丙醇(約1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇)，上下顛倒混勻。室溫孵育10分鐘(為最大量沉淀RNA，-20ε沉淀2小時(shí)以上)。4ε，12,000g離心15分鐘。4)RNA洗滌棄上清，每管用1ml 75％乙醇洗滌沉淀，4ε，7500g離心5分鐘。5)RNA溶解空氣干燥RNA沉淀5-10分鐘，以適量的DEPC處理過(guò)的超純水溶解沉淀。紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的OD260和OD280值，甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量(28S和18SrRNA的比例)。
采用Promega公司PolyATract mRNA分離試劑盒(Promega，Madison，WI)分離mRNA，其基本原理是用帶有親和素的磁珠在磁場(chǎng)的作用下貼壁于管壁的同時(shí)，可與生物素化的oligo(dT)結(jié)合，通過(guò)oligo(dT)與mRNA3’端的PolyA尾互補(bǔ)雜交使mRNA得到分離純化。操作流程如下1)探針退火在一個(gè)1.5ml的無(wú)RNA酶的eppendorf管中，用無(wú)RNA酶的水把1mg總RNA稀釋至500μl。將此eppendorf管置于65℃水浴中10分鐘。在管中加入3μl生物素化的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC，輕輕混勻，室溫孵育直至冷卻。此過(guò)程約需10分鐘，在此期間準(zhǔn)備下列液體。2)準(zhǔn)備液體0.5×SSC 1.2ml在一個(gè)1.5ml的無(wú)RNA酶的eppendorf管中加入1.170ml無(wú)RNA酶的水和30μl的20×SSC，混勻；0.1×SSC 1.4ml在一個(gè)1.5ml的無(wú)RNA酶的eppendorf管中加入1.393ml無(wú)RNA酶的水和7μl的20×SSC，混勻。3)洗滌鏈親和素結(jié)合的磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles(SA-PMPs))沖懸SA-PMPs，用手指輕彈eppendorf管直至磁珠完全懸浮，用磁架收獲磁珠(約30秒)；吸出上清，注意勿攪動(dòng)磁珠；用0.5×SSC洗滌磁珠3次，每次300μl，用磁架收獲及棄上清；用100μl的0.1×SSC懸浮磁珠。4)Oligo(dT)-mRNA雜交體的捕獲及洗滌將退火的Oligo(dT)-mRNA加入到有洗滌過(guò)的磁珠的管中；室溫孵育10分鐘，每1-2分鐘輕輕混勻一下；用磁架收獲磁珠，棄上清；用0.1×SSC洗滌磁珠3次，每次300μl，最后一次洗滌后，盡量棄除上清，勿攪動(dòng)磁珠。5)mRNA的洗脫用100μl無(wú)RNA酶的水懸浮磁珠，用手指輕彈混勻；用磁架收獲磁珠，將上清(mRNA)吸到一個(gè)無(wú)RNA酶的管中；用150μl無(wú)RNA酶的水重復(fù)洗脫一次。紫外分光光度檢測(cè)mRNA的濃度和純度。
SSH操作流程按試劑盒說(shuō)明，以2μlmRNA合成cDNA第一鏈及第二鏈，繼而用RsaI酶消化雙鏈cDNA，酚/氯仿抽提純化cDNA片斷，tester cDNA分為兩份，分別與兩種接頭(adaptor)于16℃連接過(guò)夜，取1μl連接產(chǎn)物稀釋于200μl水中，檢測(cè)連接效率。將連接有不同接頭的tester雙鏈DNA各1.5μl分別與1.5μl driver雙鏈DNA及1μl 4×雜交液98℃變性1.5分鐘，68℃雜交8小時(shí)。然后混合兩份雜交樣品及過(guò)量的新鮮變性的driver，68℃雜交16小時(shí)。雜交結(jié)束后加入200μl稀釋液稀釋后作為模板，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增(引物PCR Primer 15’CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’；Nested PCR Primer15’TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG T 3’；NestedPCR Primer 2R5’AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT 3’)，第一次PCR循環(huán)參數(shù)為75℃5分鐘，30循環(huán)94℃30秒，66℃30秒，72℃1.5分鐘。將第一輪PCR產(chǎn)物1∶10稀釋后，取1μl作模板進(jìn)行巢式PCR(nested PCR)15循環(huán)94℃10秒，68℃30秒，72℃1.5分鐘。各取第一、二次PCR產(chǎn)物8μl用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。用試劑盒提供的G3PDH(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸脫氫酶)5’及3’引物按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)消減雜交效率。
將第二輪PCR產(chǎn)物按常規(guī)方法克隆入pGEM-T Easy vector，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli TOP10F’菌，構(gòu)成消減文庫(kù)，隨機(jī)挑選47個(gè)克隆，提取質(zhì)粒后用EcoRI酶切，或用SP6，T7引物擴(kuò)增鑒定插入片斷大小，結(jié)果顯示大部分克隆的大小不同。
為了篩選真正的差異表達(dá)基因，采用Reverse northern blot篩選克隆。稀釋由消減文庫(kù)提取的質(zhì)粒，取2ng質(zhì)粒作模板，用SP6，T7引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增30循環(huán)，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后，取5μl產(chǎn)物稀釋至100μl體積，加入100μl 0.6M NaOH變性PCR產(chǎn)物，通過(guò)BIO-RAD點(diǎn)雜交加樣器點(diǎn)樣于尼龍膜上，每孔加樣相當(dāng)于2μl PCR產(chǎn)物(80μl變性產(chǎn)物)，平行點(diǎn)兩張膜。采用3份肝癌及癌旁組織總RNA分別混合后提取mRNA，取2μg用AdvantageRT-for-PCR試劑盒(Clontech)逆轉(zhuǎn)錄合成地高辛標(biāo)記的cDNA探針，檢測(cè)探針質(zhì)量后進(jìn)行雜交。雜交條件為含50％去離子甲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)雜交液，42℃水浴雜交18小時(shí)，雜交后用2×SSC，0.1％SDS室溫洗膜2次，每次1 5分鐘，再用0.1×SSC，0.1％SDS 68℃洗膜兩次，每次30分鐘，隨后用CSPD(Rhoche公司)進(jìn)行檢測(cè)。雜交信號(hào)用Bio-Rad Quantity one軟件掃描分析。結(jié)合反向Northern blot篩選，得到多個(gè)差異表達(dá)的基因，選取有明顯差異的片斷，送上?；倒緶y(cè)序，所得結(jié)果用Blast軟件與GenBank中的核酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，多數(shù)為已知基因。C11為肝癌組織中高表達(dá)的cDNA片斷，長(zhǎng)為289bp，僅有同源的EST(expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)片斷，無(wú)已知基因。
(2)HCC-C11及其3個(gè)剪切變異體全長(zhǎng)基因的克隆為了得到C11的全長(zhǎng)基因，根據(jù)其同源EST設(shè)計(jì)引物，采用SMARTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech.Palo Alto，CA)進(jìn)行5’RACE和3’RACE(rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端的快速擴(kuò)增)擴(kuò)增基因的5’和3’末端。對(duì)于5’RACE，先利用下游外測(cè)引物C11RTA(5’GGC AAC TGATCC AGG GTC ACC 3’)和上游引物UPM(Universal Primer Mix，試劑盒提供，5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3′)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR條件為94℃2分鐘，35循環(huán)94℃30秒，68℃30秒，72℃2分鐘。擴(kuò)增結(jié)果得到明顯的3條帶(480bp，800bp，980bp)。利用下游內(nèi)側(cè)引物C11-4(5’GCT TGT TAGCCT GAT GTG CAG 3’)和上游引物UPM進(jìn)行擴(kuò)增，PCR條件同上，得到相應(yīng)減小的片斷(見(jiàn)圖1A)，將此片斷凝膠回收后連接入pGEM-T Easy vector，測(cè)序，C11向5’端延伸了66bp，命名為HCC-C11，同時(shí)得到兩個(gè)剪切變異體HCC-C11_v1和HCC-C11_v2。
對(duì)于3’RACE，先利用上游外測(cè)引物C11S(5’AGC AGG AAT GAG CTCTCC GAC 3’)和下游引物UPM進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到明顯的4條帶500bp，700bp，750bp，和1.0kb，再用上游內(nèi)側(cè)引物C11-1(5’AGA TAG AGG CCCTGG AGC TGG 3’)和下游引物UPM進(jìn)行PCR擴(kuò)增(兩輪PCR的參數(shù)同5’RACE)，得到單一一條片斷，大小約350bp(見(jiàn)圖1b)，測(cè)序后見(jiàn)有明顯的加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴，證實(shí)HCC-C11基因的3’末端已經(jīng)獲得。
因無(wú)明顯的編碼蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀碼框架存在，推測(cè)基因HCC-C11的5’端未到頭，但利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit做了多次5’RACE均未使得5’端向前延伸，故采用了另外一種5’RACE系統(tǒng)(Invitrogen，SanDiego，CA)，先用1μg mRNA，以C11-2(5’CAC TTG CTG TTC ATG CCC TCCG3’)為引物，用ThermoScriptTMReverse Transcriptase(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)，60℃60分鐘合成cDNA第一鏈，用QIAqicknucleotide removel kit(Qiagen)純化后，按Invitrogen 5’RACE系統(tǒng)說(shuō)明加尾，先用上游引物Abridged anchor primer(5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGTACG GGI IGG GII GGG IIG-3)′和下游引物C11-6 (5’CAG AGA CCT CTGATC ACC ACC 3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未見(jiàn)明顯條帶。然后再用下游巢式引物C11-8(5’GAG CCC TCT TAT CCT CTA TGG 3’)和上游引物AUAP(Abridged Universal Amplification Primer，5’GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC 3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系加入10％DMSO(二甲基亞砜)。兩輪PCR的參數(shù)相同，94℃2分鐘，35循環(huán)94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分鐘。巢式PCR后得到一條150bp大小的片斷，連接入pGEM-T Easy vector，測(cè)序，HCC-C11基因再向5’端延伸了98bp(見(jiàn)圖1b)。至此，已經(jīng)得到628bp大小的片斷，定位于基因組序列AC018992。
根據(jù)Northern blot的結(jié)果，HCC-C11基因的轉(zhuǎn)錄本大小約為840bp，考慮缺失的5’端可能就在AC018992上已克隆出來(lái)的序列的5’端，故在上游相應(yīng)位置設(shè)計(jì)了上游引物C11gsp1(5’CGC TAATGG ATG GTG AGG CAC 3’)，并在基因的3’端設(shè)計(jì)了下游引物C11gsp2(5’GAC TTT AAT AAG GAT TTA ATC TTTATG 3’)。以1μg mRNA為模板，以oligo(dT)為引物，用ThermoScriptTMReverse Transcriptase在60℃，反應(yīng)60分鐘，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以1μl此cDNA為模板，以C11gsp1為上游引物，C11gsp2為下游引物，反應(yīng)體系中加入10％二甲基亞砜(V/V)，反應(yīng)條件如下94℃變性2分鐘；35循環(huán)94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分鐘。PCR結(jié)果得到4條明顯的擴(kuò)增帶，大小與預(yù)計(jì)相符合(見(jiàn)圖2A)。四條擴(kuò)增帶的大小為HCC-C11為790bp，HCC-C11_v1為1129bp，HCC-C11_v2為1318bp，HCC-C11_v3為1543bp。將得到的片斷克隆、測(cè)序，cDNA序列長(zhǎng)度與Northern blot的結(jié)果一致，并含有預(yù)測(cè)的蛋白編碼序列。
至此，克隆到了C11及其3個(gè)剪切變異體的全長(zhǎng)，將全長(zhǎng)基因命名為HCC-C11基因(GenBank NumberAY211906)，同時(shí)克隆到了它的3個(gè)剪切變異體HCC-C11_v1基因(GenBank NumberAY211907)，HCC-C11_v2基因(GenBank NumberAY211908)，HCC-C11_v3基因(GenBank NumberAY225521)。
(3)Northern blot檢測(cè)和驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄本的大小為檢測(cè)和驗(yàn)證HCC-C11基因及其變異體的轉(zhuǎn)錄本的大小，采用了Northernblot方法。本方法是一個(gè)比較經(jīng)典的方法，其原理是將細(xì)胞或組織的總RNA或mRNA電泳，轉(zhuǎn)到尼龍膜上，用待檢測(cè)基因特異的探針與膜進(jìn)行雜交，再經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的洗膜條件，通過(guò)酶聯(lián)抗體及酶底物顯色，使特異的雜交信號(hào)顯于膜上。根據(jù)雜交條帶的位置，參照RNA marker或28S，18S RNA，計(jì)算出待測(cè)基因的大小。雜交信號(hào)的強(qiáng)弱顯示基因表達(dá)的豐度的高低。
用于Northern blot的DNA探針位于HCC-C11基因的494-790核苷酸的位置，用上游引物C11-1及下游引物C11gsp2從3’RACE質(zhì)粒中擴(kuò)增、純化cDNA片斷，用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(BoehringerMannhein，Germany)標(biāo)記。采用建消減文庫(kù)的肝癌標(biāo)本的總RNA為樣品，40μg來(lái)自癌組織及癌旁組織的總RNA分別上樣于含1％瓊脂糖的甲醛凝膠，Ca指示此泳道上樣的為肝癌組織的RNA，Adj指示此泳道上樣的為癌旁組織的RNA，用G3PDH雜交做為上樣對(duì)照。電泳后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，80℃干烤2小時(shí)，先在含50％甲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)雜交液(50％甲酰胺，5×SSC，0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)(十二烷基肌氨酸鈉)0.02％SDS，2％封閉試劑，100μg/ml剪切的鮭魚(yú)精DNA)中42℃雜交3小時(shí)，然后在含地高辛標(biāo)記的cDNA探針的標(biāo)準(zhǔn)雜交液中，42℃雜交18小時(shí)。洗膜條件為(1)在2×SSC，0.5％SDS的液體中，室溫洗膜2次，每次30分鐘。(2)在1×SSC，0.1％SDS的液體中，65℃洗膜2次，每次30分鐘。在高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下洗膜后，用CSPD試劑，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)膜上的信號(hào)(x光片曝光時(shí)間為6-12小時(shí))。雜交結(jié)果顯示，癌組織中檢測(cè)到兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，大小為840bp(相當(dāng)于HCC-C11)和1350bp(相當(dāng)于HCC-C11_v2)，以前者為主。癌旁組織中檢測(cè)到一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，為840bp(相當(dāng)于HCC-C11)。癌和癌旁中其它剪切變異體未檢測(cè)到為表達(dá)豐度低所致。同樣制備G3PDH深針和雜交作為參照，在癌組織和癌旁組織中都檢測(cè)到預(yù)計(jì)的信號(hào)。以上實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了HCC-C11及HCC-C11_v2轉(zhuǎn)錄本的大小(見(jiàn)圖2B)。
實(shí)施例2.基因分析根據(jù)生物信息學(xué)分析，HCC-C11基因定位于人基因的8號(hào)染色體上，具體位置為8q24.2。HCC-C11由2個(gè)外顯子組成，HCC-C11_v1由3個(gè)外顯子組成，HCC-C11_v2由2個(gè)外顯子組成，HCC-C11_v3僅由1個(gè)外顯子組成，它們的第一個(gè)及最后一個(gè)外顯子相同(見(jiàn)圖3，所示的基因大小為實(shí)驗(yàn)中PCR擴(kuò)增出來(lái)的大小，不包含Poly(A)尾巴)。圖3顯示HCC-C11基因及其變異體利用了不同的外顯子。HCC-C11利用的是1、5外顯子；HCC-C11_v1利用的1、3、5外顯子；HCC-C11_v2利用的是1、3、4、5外顯子；HCC-C11_v3利用的是1、2、3、4、5外顯子。四個(gè)轉(zhuǎn)錄本共用第1個(gè)和第5個(gè)外顯子。預(yù)測(cè)的開(kāi)放讀碼框架位于第1個(gè)外顯子，mRNA加尾信號(hào)位于第5外顯子，因此HCC-C11基因及其3個(gè)變異體編碼的蛋白序列相同，加尾信號(hào)也完全相同。HCC-C11及其3個(gè)變異體的轉(zhuǎn)錄本大小分別為807bp，1146bp，1335bp，1560bp(包含Poly(A)尾巴)，它們的最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框架相同，均為234bp，編碼77個(gè)氨基酸。圖4A為HCC-C11基因的核苷酸序列及其演繹的氨基酸序列，在氨基酸序列中，潛在的糖基化位點(diǎn)用加方框表示，磷酸化位點(diǎn)加圓圈表示；圖4B為HCC-C11_v1的核苷酸序列，cDNA全長(zhǎng)為1146bp，開(kāi)放讀碼框架與HCC-C11完全相同；圖4C為HCC-C11_v2的核苷酸序列，cDNA全長(zhǎng)為1335bp，開(kāi)放讀碼框架與HCC-C11完全相同；圖4D為HCC-C11_v3的核苷酸序列，cDNA全長(zhǎng)為1560bp，開(kāi)放讀碼框架與HCC-C11完全相同；其中圖4A-4D的核苷酸序列中帶下劃線的核苷酸序列為加尾信號(hào)，加邊框表示的ATG為預(yù)測(cè)的蛋白翻譯起始密碼，TAA為預(yù)測(cè)的翻譯終止密碼。
實(shí)施例3.HCC-C11及其3個(gè)剪切變異體的mRNA的組織分布用RT-PCR方法檢測(cè)了HCC-C11 mRNA在人的17種正常組織(心臟、腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨胳肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、白細(xì)胞、膽囊)，6種肝癌細(xì)胞系(QGY7701、QGY7702、QGY7703、SMMC7721、HLE、HepG2)及胎肝中的分布，結(jié)果顯示HCC-C11mRNA在正常肝中強(qiáng)表達(dá)，在睪丸中弱表達(dá)，在所檢測(cè)的肝癌細(xì)胞系中均不表達(dá)，是一個(gè)肝臟特異表達(dá)的基因。(見(jiàn)圖5A和圖5B)。所用引物為上游引物C11-1B(5’TAC TGA GAT AGA GGC CCT GGA G 3’)，下游引物C11RTA(5’GGC AAC TGATCC AGG GTC ACC 3’)，用PE9700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下94℃變性2分鐘；30循環(huán)94℃變性15秒；68℃退火20秒；72℃延伸20秒；最后72℃延伸6分鐘。用2.0％的瓊脂糖/溴乙錠凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片斷大小及特異性。以G3PDH作為參照基因，上游引物為5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’，下游引物為5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’。
檢測(cè)HCC-C11的3個(gè)剪切變異體所用的引物為上游引物C11S(5’AGCAGG AAT GAG CTC TCC GAC 3’)，下游引物同上，為C11RTA。PCR條件也同上。見(jiàn)圖6A-6C圖6A為HCC-C11及其3個(gè)剪切變異體的mRNA在5對(duì)人原發(fā)性肝癌中的表達(dá)，其中T代表模板為癌組織的cDNA，N代表模板為癌旁組織的cDNA。圖6B為HCC-C11及其3個(gè)剪切變異體的mRNA在10份肝硬化組織中的表達(dá)，其中C(cirrhotic liver tissues)代表肝硬化組織。圖6C為HCC-C11及其3個(gè)剪切變異體的mRNA在9分正常肝及1分睪丸組織中的表達(dá)。HCC-C11的RT-PCR循環(huán)數(shù)為32，G3PDH的RT-PCR循環(huán)數(shù)在(A)和(B)中為28，在(C)為29。以上結(jié)果表明，HCC-C11的3個(gè)剪切變異體的mRNA與HCC-C11表達(dá)一致，但是在肝來(lái)源的組織中以HCC-C11及HCC-C11_v2為主，在睪丸中以HCC-C11 HCC-C11_v3為主。
實(shí)施例4.HCC-C11 mRNA的表達(dá)豐度與肝癌的臨床病理的聯(lián)系用Real-time RT-PCR檢測(cè)了HCC-C11在51份肝癌，10份肝硬化，10份正常肝組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，HCC-C11 mRNA在肝癌中的表達(dá)與肝癌的組織分化程度及臨床分期有關(guān)。肝癌的組織分化程度越低，臨床分期越晚，癌組織中HCC-C11 mRNA表達(dá)越低(見(jiàn)表1，表2，表3)。在早期高分化肝癌(I-II期)中，HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達(dá)比癌旁高。在中晚期高分化肝癌(III-IV期)，HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達(dá)比癌旁低。在早期中分化肝癌中，HCC-C11 mRNA在癌組織中與癌旁組織中的表達(dá)基本相同。在中晚期中分化肝癌及所有的低分化肝癌中，HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達(dá)均明顯比癌旁組織的低，且有相當(dāng)一部分病例(28.2％)的肝癌組織中不表達(dá)HCC-C11 mRNA。此外，HCC-C11 mRNA在肝硬化組織中的表達(dá)也比正常肝組織中的表達(dá)低(表4)。
表1肝癌中不同HCC-C11 mRNA表達(dá)指數(shù)(EI)的頻率病例數(shù)n(％)癌組織 癌旁組織 肝硬化正常肝EId(AU)0-10 38(75) 16(31)0(0) 0(0)10-100 6(12) 23(45)8(80)0(0)＞100 7(13) 12(24)2(20)10(100)總病例數(shù)(100％)51 5110 10P值c癌旁組織 0.000a肝硬化 0.000b1.0b
正常肝0.000b0.000b0.001ba為Pearson Chi-Square檢驗(yàn)的結(jié)果。
b為Fisher’s精確檢驗(yàn)的結(jié)果。
c表中的P值為相應(yīng)的行和列兩組統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的結(jié)果。
dEI值由real-time RT-PCR的結(jié)果計(jì)算得到。
EI值＝(HCC-C11 mRNA的分子拷貝數(shù)/G3PDH mRNA的分子拷貝數(shù))×1000AU(AU，arbitrary unit)表2HCC-C11 mRNA表達(dá)與肝癌臨床分期的關(guān)系Edmondson TNM 分病例數(shù)(n) N/T比值aP值分級(jí)期(分析的例數(shù)e/總例 (均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)數(shù))G1I-II 4/4 0.078±0.036III 2/2 33.700±19.799 0.017bG2I-II 6/6 0.709±0.257III 8/8 29.850±10.743 0.001bIV 6/8 255.567±81.8670.000c0.000dG3I-II 3/5 7.753±2.608III 5/8 59.350±16.288 0.003bIV 6/10 421.650±130.874 0.001c0.001daN/T比值，由real-time RT-PCR計(jì)算出的HCC-C11 mRNA在癌旁組織中的EI值比癌組織的EI值。
bP為I-II期與III期之間比較的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。
cP為III期與IV期之間比較的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。
dP為I-II期與IV期之間比較的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。
e為HCC-C11 mRNA在癌組織及癌旁組織均表達(dá)的病例數(shù)。在余下的病例中，HCC-C11 mRNA只在癌旁組織中表達(dá)，而在癌組織中不表達(dá)，這些病例無(wú)法做N/T分析。
表3HCC-C11 mRNA表達(dá)與肝癌組織分化程度的關(guān)系TNM分期Edmondson 病例數(shù)(n)N/T比值aP值分級(jí) (分析的例數(shù)e/總 (均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)例數(shù))I-IIG14/4 0.078±0.036G26/6 0.709±0.2570.003bG33/5 7.753±2.6080.003c0.002dIII G12/2 33.700±19.799G28/8 29.850±10.743G35/8 59.350±16.288 0.008cIV G26/8 255.567±81.867G36/10421.650±130.8740.025caN/T比值，由real-time RT-PCR計(jì)算出的HCC-C11 mRNA在癌旁組織中的EI值比癌組織的EI值。
bP為G1與G2之間比較的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。
cP為G2與G3之間比較的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。
dP為G1與G3之間比較的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。
e為HCC-C11 mRNA在癌組織及癌旁組織均表達(dá)的病例數(shù)。在余下的病例中，HCC-C11mRNA只在癌旁組織中表達(dá)，而在癌組織中不表達(dá)，這些病例無(wú)法做N/T分析。
表4HCC-C11 mRNA在肝硬化組織及正常肝組織中的表達(dá)的比較組別病例數(shù) EI(AU)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)P值正常肝10190.680±85.169肝硬化1056.420±37.542 0.000實(shí)驗(yàn)方法用Bio-Rad iQ/iCycler Real-Time PCR系統(tǒng)(BioRad，Hercules，CA，USA)進(jìn)行HCC-C11在mRNA水平表達(dá)的定量檢測(cè)。其原理是將熒光染料SYBR green加入PCR反應(yīng)體系，隨著PCR反應(yīng)中雙鏈DNA的產(chǎn)生，SYBRgreen嵌入到雙鏈中，由相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)出熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)樣品(由PCR產(chǎn)物做成的質(zhì)粒)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而得到未知cDNA樣品的模板數(shù)。用HCC-C11特異的引物C11-1B和C11RTA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。先做熔點(diǎn)曲線確定收集熒光信號(hào)的溫度。定量反應(yīng)中的PCR循環(huán)參數(shù)為50℃2分鐘，95℃10分鐘；45循環(huán)95℃變性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸20秒，88℃10秒收集熒光信號(hào)。1∶10梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(每反應(yīng)管的模板數(shù)為108到102)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)至少在0.98以上，以保證數(shù)據(jù)的精確性。同樣制備G3PDH的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及做每份樣品的定量檢測(cè)(引物同前)，作為HCC-C11的參照。計(jì)算每份病例中HCC-C11 mRNA在癌旁組織中的表達(dá)量(N)比上在癌組織中的表達(dá)量(T)的比值(N/T)，分析HCC-C11 mRNA的表達(dá)水平與肝癌的組織分化程度及臨床分期的關(guān)系。計(jì)算每個(gè)樣品的HCC-C11 mRNA的表達(dá)指數(shù)(mRNA EI)，分析HCC-C11mRNA的表達(dá)在肝癌、肝硬化、正常肝中的差異。mRNA EI＝(HCC-C11 mRNA的拷貝數(shù)/G3PDH mRNA的拷貝數(shù))×1000AU(AU為arbitrary unit)。PCR產(chǎn)物行2.0％的瓊脂糖凝膠電泳，以證實(shí)PCR的特異性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。EI值的差異的顯著性用Pearson卡方檢驗(yàn)及Fisher’s精確檢驗(yàn)。N/T比值的差異的顯著性用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。
實(shí)施例5.原位雜交為了確定HCC-C11 mRNA表達(dá)的細(xì)胞定位，從而進(jìn)一步證明該基因與肝癌關(guān)系的相關(guān)性。以肝癌組織切片及肝癌腫瘤細(xì)胞系BEL7402(RT-PCR證實(shí)有HCC-C11 mRNA表達(dá))的培養(yǎng)細(xì)胞爬片為材料，進(jìn)行了原位雜交。
以上游引物C11-1B(5’TAC TGA GAT AGA GGC CCT GGA G 3’)及下游引物C11RTA(5’GGC AAC TGA TCC AGG GTC ACC 3’)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物構(gòu)建成質(zhì)粒(Real time PCR中的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒)，測(cè)序證實(shí)。用DIG RNA labelingKit(T7/SP6)(Roche)按試劑盒說(shuō)明分別標(biāo)記正義及反義RNA探針。
簡(jiǎn)要操作步驟如下制備8μm厚的冰凍切片，及BEL7402的培養(yǎng)細(xì)胞爬片，50℃干烤2小時(shí)。用DEPC處理過(guò)的PBS水化，0.2M的鹽酸室溫處理10min，PBS洗滌2×5秒，用20μg/ml的蛋白酶K在37℃消化30分鐘。PBS洗滌2×5秒，用4％多聚甲醛固定10分鐘。PBS洗滌3×5秒，70％，95％，100％梯度乙醇脫水。每個(gè)切片滴加30μl預(yù)雜交液(50％甲酰胺，10％dextran sulfate，1×Denhard’s溶液，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM NaCl，1mM EDTA，250μg/ml酵母tRNA)，37℃預(yù)雜交60分鐘。然后用含0.5μg/ml的探針的雜交液，42℃雜交16小時(shí)。雜交后用2×SSC，50％甲酰胺37℃洗滌30分鐘，然后用2×SSC37℃洗滌2×15分鐘，0.1×SSC 37℃洗滌2×15分鐘。以堿性磷酸酶耦連的地高辛標(biāo)記的抗體(1∶500稀釋)檢測(cè)雜交信號(hào)。藍(lán)紫色的信號(hào)為陽(yáng)性信號(hào)。
結(jié)果在所檢測(cè)的早期中分化肝細(xì)胞癌的癌組織中，幾乎所有癌細(xì)胞中均見(jiàn)有HCC-C11 mRNA表達(dá)。癌旁組織中，幾乎所有肝細(xì)胞中均有表達(dá)。BEL7402的培養(yǎng)細(xì)胞爬片中，所有癌細(xì)胞均見(jiàn)HCC-C11 mRNA表達(dá)。而用正義對(duì)照探針雜交未見(jiàn)到陽(yáng)性雜交信號(hào)(見(jiàn)圖7)。
以上結(jié)果說(shuō)明，HCC-C11是一個(gè)肝臟特異的表達(dá)于正常肝細(xì)胞及分化相對(duì)比較好或早期肝癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞系的基因。
實(shí)施例6.重組蛋白的表達(dá)(1)重組pET32(a)-C11質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)HCC-C11的基因序列設(shè)計(jì)引物如下上游引物5’GCG GAT GGT GAG GCA CAG TTT G 3’，下游引物5’GCG TTT ATTTGT GAA CTT GAT TAG 3’。PCR擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物，分別用引物上加載的酶切位點(diǎn)(引物中加邊框的核苷酸)的內(nèi)切酶(BamH I和PstI)進(jìn)行酶切，同時(shí)用同樣的酶切載體pQE30，分別凝膠回收目的基因片斷及載體片斷(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen)，用T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化入TOP10F’菌，挑取克隆酶切鑒定后送測(cè)序，測(cè)序證實(shí)無(wú)突變后，用BamHI和Hind III亞克隆到表達(dá)載體pET32(a)，然后轉(zhuǎn)化TOP10F’菌，挑取轉(zhuǎn)化菌落經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜分析篩選插入正確的重組菌落，然后將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32(a)-C11轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21 rare coden。
(2)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取分隔良好的單個(gè)菌落，用3ml LB細(xì)菌培養(yǎng)基(每升含10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，10克氯化鈉，pH7.0)，加入氯霉素(終濃度34μg/ml)和氨芐青霉素(終濃度50μg/ml)，37℃空氣浴搖床震搖過(guò)夜。第二天取3個(gè)新?lián)u菌管，加入含氯霉素和氨芐青霉素的新鮮2YT細(xì)菌培養(yǎng)基(每升含16克胰蛋白胨，10克酵母提取物，5克氯化鈉，pH 7.0)，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1∶20稀釋，37℃空氣浴搖床震搖培養(yǎng)，到菌液OD600＝0.7時(shí)開(kāi)始用IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑的終濃度為1mM。分別于誘導(dǎo)前(0hr)，誘導(dǎo)后4、6、10小時(shí)取菌液1ml，同時(shí)設(shè)1管不誘導(dǎo)對(duì)照，于相應(yīng)時(shí)間取菌液1ml。將留取的菌液離心，加入100μl SDS-PAGE上樣緩沖液，沖懸菌體，沸水浴煮10分鐘，4℃離心5分鐘。取20μl上清電泳。同樣誘導(dǎo)含有空pET32(a)載體的表達(dá)菌，取10μl電泳作為誘導(dǎo)對(duì)照。
結(jié)果見(jiàn)空載體對(duì)照在預(yù)計(jì)位置20kDa處見(jiàn)表達(dá)條帶，重組pET32(a)-C11融合蛋白在預(yù)計(jì)位置30kDa處見(jiàn)表達(dá)條帶，4小時(shí)誘導(dǎo)已經(jīng)達(dá)高峰，6小時(shí)、10小時(shí)表達(dá)逐漸下降。而誘導(dǎo)前(0小時(shí))及不誘導(dǎo)對(duì)照(4小時(shí))未見(jiàn)有目的蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖8)。
雖然現(xiàn)有的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)有HCC-C11蛋白的同源蛋白，但是分析HCC-C11基因的啟動(dòng)子時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，HCC-C11基因和甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(Albumin)基因在啟動(dòng)子區(qū)域有許多共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，主要是一類(lèi)稱為homeoprotein的轉(zhuǎn)錄因子，包括肝細(xì)胞核因子1(HNF1)和6(HNF6)、OCT1，NKX 3.1，EN1，CSX，PDX1，POU factor Brn-2，CDX2。Homeoprotein是一類(lèi)在腫瘤中常發(fā)生異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它的主要功能主要分為兩類(lèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化；或促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖。有研究已表明HNF1能夠轉(zhuǎn)錄激活許多肝臟特異的基因表達(dá)，HNF-1alpha的表達(dá)水平與肝癌的組織分化程度有關(guān)，在高分化肝癌中，HNF-1 alpha在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，而在中分化及低分化肝癌中，HNF-1 alpha在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織。HNF6也與肝細(xì)胞的特化(Specification)有關(guān)。我們知道，甲胎蛋白是目前的一個(gè)最通用的肝癌的標(biāo)志物，它一般只在胚胎時(shí)期及出生后的短時(shí)間內(nèi)表達(dá)，正常成人不表達(dá)，而在肝癌發(fā)生時(shí)，許多病人又出現(xiàn)高表達(dá)。白蛋白是一個(gè)肝臟特異的標(biāo)志，主要表達(dá)于分化的肝癌細(xì)胞，在肝癌病人中，白蛋白在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織。
由此可知，HCC-C11蛋白是一個(gè)肝臟特異的蛋白，它象甲胎蛋白和白蛋白一樣，受homeoprotein轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，作為homeoprotein轉(zhuǎn)錄因子的下游基因，執(zhí)行肝臟特異的功能；或者作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者，調(diào)節(jié)其它肝臟特異的基因。而最終的表現(xiàn)為，HCC-C11促進(jìn)肝細(xì)胞的分化，抑制肝細(xì)胞的增殖。在肝癌中則表現(xiàn)為促進(jìn)肝癌細(xì)胞分化，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，從而抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。HCC-C11蛋白可望作為肝癌的特異治療的靶點(diǎn)而對(duì)肝癌進(jìn)行相應(yīng)治療，該蛋白同樣可用于臨床分期中的分子診斷。
實(shí)施例7.HCC-C11 mRNA在人原發(fā)性肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用人原發(fā)性肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷的應(yīng)用1)取肝癌手術(shù)后的癌組織及癌旁組織標(biāo)本(約0.5-1克)提取總RNA(可用Gibco公司的TRIzol試劑盒)；2)分別以1μg總RNA為模板，20μl反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，加水稀釋至100μl(Clontech公司的Advantage RT for PCR Kit)；3)以2.5μl的cDNA第一鏈為模板，以C11-1B(5’TAC TGA GAT AGA GGCCCT GGA G 3’)為上游引物，以C11RTA(5’GGC AAC TGATCC AGG GTCACC 3’)為下游引物，25μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)如下94℃變性2分鐘；30循環(huán)94℃變性15秒；68℃退火20秒；72℃延伸20秒；最后72℃延伸6分鐘。用2.0％的瓊脂糖/溴乙錠凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片斷大小及特異性。以G3PDH作為參照基因，上游引物為5’ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC 3’，下游引物為5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’。
4)結(jié)果判定凝膠掃描后半定量分析或定量PCR檢測(cè)，結(jié)合病理組織學(xué)檢查，準(zhǔn)確診斷，判斷病情及預(yù)后。
高分化肝癌若HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達(dá)比癌旁高，為早期肝癌，術(shù)后預(yù)后相對(duì)好。若癌組織中的表達(dá)比癌旁組織低，為晚期肝癌，手術(shù)后應(yīng)該輔助予化療、免疫治療等預(yù)防復(fù)發(fā)。
中分化肝癌若HCC-C11 mRNA在癌組織中的表達(dá)與癌旁基本一致，為早期肝癌；若癌組織中比癌旁低，或癌組織中不表達(dá)，為中晚期肝癌。結(jié)合臨床指針行手術(shù)后的治療。
低分化肝癌無(wú)論早期或中晚期肝癌中均為癌組織中的表達(dá)比癌旁低，甚至在癌組織中檢測(cè)不到HCC-C11 mRNA的表達(dá)。大部分晚期肝癌中癌組織中的表達(dá)非常低，此類(lèi)病人預(yù)后很差。
PI034449-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>北京大學(xué)<120>肝臟特異的與肝癌分化和進(jìn)展相關(guān)的基因和蛋白<130>PI034449<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>807<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(6)..(236)<223>
<400>1cgcta atg gat ggt gag gca cag ttt gaa aaa ctg cat tct ttc agg aca 50Met Asp Gly Glu Ala Gln Phe Glu Lys Leu His Ser Phe Arg Thr1 5 10 15ctg aat ggt cag aac cca atg tgc ttt tat tca ttc att caa caa ata 98Leu Asn Gly Gln Asn Pro Met Cys Phe Tyr Ser Phe Ile Gln Gln Ile20 25 30ttt gtg gcc atg tat aat gta tca ggt gct gta ttt act gta ctt cat 146Phe Val Ala Met Tyr Asn Val Ser Gly Ala Val Phe Thr Val Leu His35 40 45gcc agg aaa gca aca gag aag aaa aca tac cca gtc cag tcc ctg acc 194Ala Arg Lys Ala Thr Glu Lys Lys Thr Tyr Pro Val Gln Ser Leu Thr50 55 60tca tgt cat tta caa tct cgg cta atc aag ttc aca aat aaa 236Ser Cys His Leu Gln Ser Arg Leu Ile Lys Phe Thr Asn Lys65 70 75taattccaaa tcatgatggg agtgaagcca tagaggataa gagggctcgg ggtggtgatc296agaggtctct gaggcaatga tctggaagct gccacctaca agataaagag taagcaagat356agagacagca ggaatgagct ctccgacgga gggcatgaac agcaagtgca aaggccctgc416gactcgaaag agcatgaaag actgaggaag cggccagtgt ggctccaaca cagtggagga476gtggggggat cctactgaga tagaggccct ggagctggct cctccacagc tctcaggaat536gacagtaaac acagacggcc ctgcatgtat tccggctgtg gcagecttcc tcctgggctg596cacatcaggc taacaagccc agccctcagc ttcacaggga ttggagagct ggtgacccta656gtcaaggaag ctggtgaccc tggatcagtt gcctcccctc tctgtgccta aatcccccac716cccacttctg tcaattagga ggatgatgcc ttcttcaaag tgttgtcata aagattaaat776ccttattaaa gtctaaaaaa aaaaaaaaaa a 807<210>2<211>77<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Asp Gly Glu Ala Gln Phe Glu Lys Leu His Ser Phe Arg Thr Leu1 5 10 15
PI034449-sequence list.txtAsn Gly Gln Asn Pro Met Cys Phe Tyr Ser Phe Ile Gln Gln Ile Phe20 25 30Val Ala Met Tyr Asn Val Ser Gly Ala Val Phe Thr Val Leu His Ala35 40 45Arg Lys Ala Thr Glu Lys Lys Thr Tyr Pro Val Gln Ser Leu Thr Ser50 55 60Cys His Leu Gln Ser Arg Leu Ile Lys Phe Thr Asn Lys65 70 75<210>3<211>1146<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3cgctaatgga tggtgaggca cagtttgaaa aactgcattc tttcaggaca ctgaatggtc 60agaacccaat gtgcttttat tcattcattc aacaaatatt tgtggccatg tataatgtat 120caggtgctgt atttactgta cttcatgcca ggaaagcaac agagaagaaa acatacccag 180tccagtccct gacctcatgt catttacaat ctcggctaat caagttcaca aataaataat 240tccaaatcat gatgggagtg aagccataga ggataagagg gctcggggtg gtgatcagag 300gtctctgagg caatgatctg gaagctgcca cctacaagat aaagagtaag caagatagag 360acagcaggaa tgagctctcc gacggagggc atgaacagca agtgcaaagg ccctgcgact 420cgaaagagca tgaaagactg aggaagcggc cagtgtggct ccaacacagt ggaggagtgg 480ggggatccta ctgagataga ggccctgggc tgaataattc tcatccttca aggcccaact 540ccagccaatg gcaccgacct cctggacctg ctaggcagaa gtggtggctc cctctcagct 600gaccccagag cacttcctta gctcctgctg atctcagagc acacacacca atccactctg 660gccactcagc aatttttctt gatggccctg gcatggcacc tatgctgggg tcagaccctc 720aaccagccct tcagtgttga aatgcacaac ctcagccctc tagcctcagc ggaggaagca 780gggctcttca gtttgggaga accatataca accagaagaa ggggccaaaa tatctgaagc 840ccccaggagc tggctcctcc acagctctca ggaatgacag taaacacaga cggccctgca 900tgtattccgg ctgtggcagc cttcctcctg ggctgcacat caggctaaca agcccagccc 960tcagcttcac agggattgga gagctggtga ccctagtcaa ggaagctggt gaccctggat1020cagttgcctc ccctctctgt gcctaaatcc cccaccccac ttctgtcaat taggaggatg1080atgccttctt caaagtgttg tcataaagat taaatcctta ttaaagtcta aaaaaaaaaa1140aaaaaa 1146<210>4<211>1335<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4cgctaatgga tggtgaggca cagtttgaaa aactgcattc tttcaggaca ctgaatggtc 60agaacccaat gtgcttttat tcattcattc aacaaatatt tgtggccatg tataatgtat120caggtgctgt atttactgta cttcatgcca ggaaagcaac agagaagaaa acatacccag180
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PI034449-sequence list.txtccttagctcc tgctgatctc agagcacaca caccaatcca ctctggccac tcagcaattt 900ttcttgatgg ccctggcatg gcacctatgc tggggtcaga ccctcaacca gcccttcagt 960gttgaaatgc acaacctcag ccctctagcc tcagcggagg aagcagggct cttcagtttg1020ggagaaccat atacaaccag aagaaggggc caaaatatct gaagccccca ggtagcgggg1080ctaaaagaaa gggataaatg gcctcttctg gttttttttc tttgtttgtt tttgttttta1140ctggaaacaa ctctaagggg agactggtcc cagtgaagat gatcccctga aaggctagta1200agcaggtcac ctttgaatgt caagggcaaa atcactgttg gtgtcctgtt ctccctccag1260gagctggctc ctccacagct ctcaggaatg acagtaaaca cagacggccc tgcatgtatt1320ccggctgtgg cagccttcct cctgggctgc acatcaggct aacaagccca gccctcagct1380tcacagggat tggagagctg gtgaccctag tcaaggaagc tggtgaccct ggatcagttg1440cctcccctct ctgtgcctaa atcccccacc ccacttctgt caattaggag gatgatgcct1500tcttcaaagt gttgtcataa agattaaatc cttattaaag tctaaaaaaa aaaaaaaaaa1560
權(quán)利要求
1.一種肝臟特異的與肝癌分化、進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)，具有圖4A中的氨基酸序列。
2.一種融合蛋白，其特征在于該融合蛋白包含權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)序列。
3.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于該基因?yàn)镠CC-C11或HCC-C11的剪切變異體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于剪切變異體為HCC-C11-V1，HCC-C11-V2或HCC-C11-V3。
6.一種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求4所述的基因在肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝臟特異的與肝癌分化、進(jìn)展相關(guān)的新蛋白和編碼該種蛋白質(zhì)的基因，尤其是基因HCC－C11及其3個(gè)剪切變異體，并進(jìn)一步公開(kāi)了這種新蛋白和新基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的組織分化及臨床分期的分子診斷中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1548456SQ03136070
公開(kāi)日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者陳慰峰, 蘇艷蓉, 董學(xué)員, 王宏程 申請(qǐng)人:北京大學(xué)