專利名稱：抗肝癌基因藥物組合物、小分子干擾rna及其篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因治療，具體涉及肝癌的基因治療藥物及其篩選方法。
背景技術：
肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝炎和肝癌的高發(fā)病國家，全世界肝癌患者的48％集中在我國。近20年來我國肝癌的發(fā)病率上升了近40％，居惡性腫瘤中的第三位。肝癌的早期診斷非常困難，而手術后的復發(fā)率高達50％，肝癌的死亡率在我國僅次于胃癌。
已有的研究結果表明，肝癌的發(fā)生與肝炎病毒(HBV，HCV)感染、肝硬化、黃曲霉素B1以及一些遺傳因子密切相關。與其它組織來源的腫瘤相似，肝癌的發(fā)生發(fā)展同樣是多階段多步驟的過程，腫瘤的發(fā)生經常與致癌基因的過表達和抑癌基因的沉默有關。目前已經證明與人類肝癌的發(fā)生相關的一切基因如p21、p53、Ras、Raf、c-Myc(Naka T，Toyota N，Kaneko T，Kaibara N.AnticancerRes，199818555-564.Fujimoto Y，Hampton LL，Wirth PJ，Wang NJ，XieJP，Thorgeirsson SS.Cancer Res.1994 Jan 1；54(1)281-5.)等，牽涉多條信號傳導途徑；但其中尚未發(fā)現一個為肝癌發(fā)生過程所獨有或在大量樣品中擁有顯著的檢出率者，例如ras癌基因在肝癌中發(fā)生變異的檢出率僅為10-25％，抑癌基因p53的變異在肝癌樣品中的檢出率也只有30-50％。
為了研究與肝癌相關的基因表達，本發(fā)明者選取來自肝癌組織和正常肝組織的RNA為模板，分別逆轉錄放射性cDNA探針后，用之雜交固定有人類基因(EST)的尼龍膜。雜交結果經放射自顯影后將圖像通過專用軟件GDA處理后，我們發(fā)現一個EST(Gemome System克隆號Hs15496)在肝癌組織樣品中高表達而在正常肝組織樣品中無表達(ratio值為99.9999，為對比之最大值)，差異十分顯著。然后根據已知的EST Hs15496的序列分別合成上下游引物，以人肝細胞cDNA文庫中抽提的質粒為模板對該片段進行了擴增，并隨即進行了放射性同位素標記，用于人肝細胞cDNA文庫的雜交篩選。通過兩輪篩選，將陽性克隆進行了DNA序列測定。用測序獲得的較長的cDNA片段對GenBank數據庫進行查詢，發(fā)現該基因的全長cDNA序列此時已經登錄。該基因在GenBank的注冊號(GI)為11434794，其cDNA全長為1233bp，由STS定位于第14號染色體上，在數據庫中被稱為假想蛋白FLJ10648(hypothetical proteinFLJ10648)。經比較，通過cDNA文庫篩選所獲得的cDNA片段的核苷酸序列與該假想蛋白的C端序列完全一致。檢索結果發(fā)現，該基因僅僅是編碼序列被報道，相關的功能研究仍是空白，故我們將其命名為fup1(function-unknownprotein 1)(見序列表中SEQ ID NO1，其中下劃線表示fup1基因上游的結合位點，大寫字母表示fup1基因的開放閱讀框(ORF))。
分別采用帶有BamHI和EcoRI切割位點的上下游引物，以人肝細胞cDNA文庫中抽提的質粒為模板，通過PCR擴增得到目的基因fup1和反義fup1基因(見序列表中SEQ ID NO2)。以上fup1基因和反義fup1基因的PCR產物分別經EcoRI和BamHI處理后，根據其引物兩端酶切位點的差異，采用雙粘性末端連接，定向插入用相同核酸內切酶處理的pcDNA3真核表達載體內。經DNA測序鑒定，其正反向序列與GenBank中登錄的序列數據完全一致。經采用Sim4軟件將fup1 cDNA序列與最新的人第14號染色體基因組DNA序列數據進行比較，發(fā)現包含fup1基因的DNA序列全長為7415bp；其開放閱讀框(ORF)由3個外顯子(起始堿基數分別是1-82，1115-2194和7345-7415)組成，編碼一個含有410個氨基酸殘基的蛋白。經TESS軟件分析，FUP1基因的上游啟動子區(qū)域中除了AP-1、TFIID、GATA等在真核細胞中常見轉錄因子結合位點外，還含有在肝臟中多見的AFP-1、C/EBP-β和HNF-4等轉錄因子的結合位點。這些轉錄因子的存在表明該基因的表達可能具有組織特異性。
編碼fup1基因的長度約為7.5kb的DNA序列位于一個更大的、長度約為45kb的mRNA前體上。經過轉錄和剪切后，該段前體所對應的成熟的mRNA可由一段cDNA序列來表示。在這段長度為2548bp的cDNA上，第306位至1538位堿基構成了FUP1的ORF，其5’和3’方向各有一段由305和1010個核苷酸構成的非翻譯區(qū)域。
本發(fā)明者進一步測定了fup1基因在人類細胞株中的分布。采用人肝癌細胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721和BEL 7404，抽提這些細胞的總RNA，在含有甲醛的凝膠上進行的RNA電泳，然后將變性RNA轉移至尼龍膜上。采用隨機摻入法制備放射性探針，將標記好的fup1特異性探針和β-actin內參探針雜交固定有人類肝癌細胞株RNA的尼龍膜。Northern Blots結果顯示fup11基因在所檢測的4種人類肝癌細胞株中都有高表達，表達量遠高于正常肝組織。
將fup1基因克隆到帶FLAG標簽的重組載體上，瞬時轉染小鼠成纖維細胞NIH3T3，發(fā)現轉染72小時后表達fup1的細胞在核內顯示出很強的熒光信號，說明fup1蛋白定位于細胞核內。
九十年代初期發(fā)現21到28個核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表達，隨后在動物細胞中也發(fā)現了這一現象。但直到1998年2月華盛頓卡耐基研究院的Fire和馬塞諸塞大學癌癥中心的Mello首次將雙鏈RNA(dsRNA)注入線蟲，結果發(fā)現誘導了比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強的靶向專一性的基因表達沉默(gene silencing)。他們將這種現象稱為RNA干擾(RNA interference，簡稱RNAi)。隨后許多研究者先后采用不同長度的dsRNA使線蟲、果蠅、植物、動物卵細胞和哺乳動物等的靶向基因表達明顯降低或沉默，因此人們把這種利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默，從而研究目的基因的功能即為RNA干擾技術(RNAi技術)(Hannon GJ.RNA interference.Nature.2002；418(6894)244-51)。由于能夠作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，所以可以毫不夸張地說，RNAi正在功能基因組學領域掀起一場真正的革命，并將徹底改變這個領域的研究步伐，為此被SCIENCE評為2002年最重要的科研成果之一。科學家們逐漸意識到，將這項新穎的技術，應用于疾病治療上可能具有莫大的潛力。如果進一步證實這種技術在人體內有效，將為許多疾病和感染提供新療法。相對與其它的基因治療手段如腺病毒、逆轉錄病毒等方法RNA干擾技術具有安全性高、用量低等優(yōu)點。然而，目前并未發(fā)現用RNAi進行肝癌治療的報道。
本發(fā)明者基于fup1基因在各種肝癌細胞株中高表達的發(fā)現，進行了大量潛心研究，并將RNA干擾技術應用到fup1基因體內外表達的研究上，試驗了RNAi技術治療肝癌的可能性，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供抗肝癌基因藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供抗肝癌基因藥物的篩選方法，用以篩選拮抗肝癌高表達基因fup1的藥物。
本發(fā)明的再一個目的是提供用所述抗肝癌基因藥物篩選方法篩選出的抗肝癌小分子。
本發(fā)明提供的抗肝癌基因藥物組合物包括安全、有效量的反義fup1基因和/或小分子干擾RNA，及藥學上可以接受的輔劑。
所述抗肝癌基因藥物組合物中的反義fup1基因具有序列表中SEQ ID NO2所示的DNA序列。
所述抗肝癌基因藥物組合物中的小分子干擾RNA包含序列表中SEQ ID NO3所示序列。
“安全、有效量”指的是所述反義fup1基因和/或小分子干擾RNA的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴重的副作用。所述反義fup1基因和/或小分子干擾RNA的安全、有效量根據治療對象的年齡、病情、療程等具體情況在0.1-100mg的范圍內選擇。本發(fā)明的組合物宜包含0.1wt％(重量百分比)至10wt％的反義fup1基因和/或小分子干擾RNA，最佳為0.5％至5％。
“藥學上可以接受的輔劑”指的是一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各輔劑能與活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低活性成分的藥效。本發(fā)明的藥物組合物中輔劑的選擇取決于給藥方式。
本發(fā)明者根據核酸雜交原理，分別構建了含有fup1基因序列(SEQ IDNO1)和反義fup1基因序列(SEQ ID NO2)的真核表達載體pcDNA3-fup1和pcDNA3-as-fup1，并測定了轉染fup1基因和反義fup1基因的真核細胞的生長曲線和在裸鼠體內的成瘤性。實驗結果說明，fup1基因的表達對小鼠成纖維細胞的增殖具有促進作用，并能使小鼠成纖維細胞較對照細胞表現出顯著增強的成瘤性；而fup1反義基因能抑制肝癌細胞的增殖和在軟瓊脂上的集落的生長速度，并能明顯減弱肝癌細胞在裸鼠體內的成瘤性。
用細胞周期和凋亡芯片檢測fup1基因的表達對小鼠成纖維細胞NIH3T3基因表達的影響，發(fā)現許多促癌生長因子上調，而抑癌生長因子下調，提示fup1基因的表達可能在fup1基因轉化的小鼠成纖維細胞的惡性生長過程中起了重要作用。
本發(fā)明還提供了一種抗肝癌基因藥物的篩選方法，用以篩選拮抗肝癌高表達基因fup1的基因藥物。這種篩選方法的特征在于采用ambion網站提供的RNAi設計軟件，針對fup1的編碼區(qū)設計小分子干擾RNA。
本發(fā)明進一步提供一種小分子RNA，所述小分子RNA包含序列表中SEQ IDNO3所示序列。
本發(fā)明者用這種小分子干擾RNA(siRNA)分別轉染人肝癌細胞和人正常肝細胞后得到的實驗結果表明，這種小分子干擾RNA對肝癌細胞的增殖具有抑制作用，而對正常肝細胞的生長沒有影響。
本發(fā)明采用反義技術和RNA干擾技術，以在肝癌細胞中高表達的基因fup1為藥靶，針對其基因序列設計了拮抗分子，為肝癌的基因治療提供了有力的武器，并為進一步篩選抗肝癌的基因藥物提供了很好的篩選平臺。


圖1顯示fup1基因的表達對小鼠成纖維細胞NIH 3T3生長的影響。
圖2顯示反義fup1基因的表達對人肝癌細胞BEL-7404生長的影響。
圖3為反義fup1基因轉染的人肝癌細胞BEL-7404在軟瓊脂上的集落形成能力分析。其中，(a)反義fup1基因轉染的肝癌細胞BEL-7404穩(wěn)定株；(b)空載體轉染的肝癌細胞BEL-7404穩(wěn)定株。
圖4為fup1基因轉染的小鼠成纖維細胞NIH3T3在裸鼠體內的成瘤性分析。其中，A.裸鼠皮下注射空載體轉染的NIH3T3細胞；B.裸鼠皮下注射fup1基因轉染的NIH3T3細胞。
圖5為反義fup1基因轉染的人肝癌細胞BEL7404在裸鼠體內的成瘤性分析。其中，C.裸鼠皮下注射反義fup1基因轉染的BEL7404細胞；D.裸鼠皮下注射空載體轉染的BEL7404細胞。
圖6為裸鼠皮下注射腫瘤細胞后產生的腫瘤。
圖7顯示fup1基因對裸鼠體內產生的腫瘤體積的影響。
圖8顯示fup1基因對裸鼠體內產生的腫瘤重量的影響。
圖6-圖8中的腫瘤細胞來自于(A)裸鼠皮下注射空載體轉染的NIH3T3細胞；
(B)裸鼠皮下注射fup1轉染的NIH3T3細胞；(C)裸鼠皮下注射反義fup1轉染的BEL7404細胞；(D)裸鼠皮下注射空載體轉染的BEL7404細胞。
圖9顯示siRNA轉染對人肝癌細胞BEL-7404生長速率的影響。
圖10顯示siRNA轉染對人肝癌細胞SMMC-7721生長速率的影響。
圖11顯示siRNA轉染對人肝癌細胞Hep3B生長速率的影響。
圖12顯示siRNA轉染對人正常肝細胞L02生長速率的影響。
具體實施例方式
下列實施范例旨在進一步舉例描述發(fā)明，而不是以任何形式限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的基本精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何替代、改動或改進都將落入本發(fā)明待批權力要求的范圍內。
實施例1 反義fup1基因序列的獲得根據fup1的編碼基因序列(SEQ ID NO1)用DNATool軟件處理后得到了反義fup1基因的cDNA序列(SEQ ID NO2)。分別采用帶有BamHI和EcoRI切割位點的上下游引物，以人肝細胞cDNA文庫中抽提的質粒為模板，通過PCR擴增得到目的基因fup1和反義fup1基因。以上fup1基因和反義fup1基因的PCR產物分別經EcoRI和BamHI處理后，根據其引物兩端酶切位點的差異，采用雙粘性末端連接，定向插入用相同核酸內切酶處理的pcDNA3真核表達載體內。
實施例2 轉染fup1基因和反義fup1基因的真核細胞的生長曲線測定將整合有fup1全長和反義fup1 cDNA的pcDNA3質粒和空載體用脂質體法轉染小鼠成纖維細胞NIH3T3NIH 3T3細胞培養(yǎng)于35mm的培養(yǎng)皿，待滿度大約達到60％后，按每個轉染反應使用2ug質粒和5ug脂質體進行操作先將質粒和脂質體分別混勻于100ul DMEM基本培養(yǎng)基中，再將二者相互混合后于室溫放置30分鐘。此后向樣品中加入0.8ml DMEM基本培養(yǎng)基并混勻，再將以上混合物加到經DMEM基本培養(yǎng)基洗去殘余血清的細胞上。于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)5小時后，向轉染細胞中加入1ml含20％血清的DMEM培基，于37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在轉染開始的24小時后用完全細胞培養(yǎng)基(即含有10％胎牛血清的DMEM)替換上述培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。72小時后將所培養(yǎng)的細胞以1∶10分盤，在G418濃度為0.8mg/ml條件下對陽性細胞株進行初篩。每2天更換一次選擇性培養(yǎng)液，以及時除去死細胞。細胞培養(yǎng)2周后，挑取肉眼可辨的單克隆細胞株接種于24孔細胞培養(yǎng)皿中，在相同濃度的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)體系隨細胞增殖而放大，最后轉移至10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。用RT-PCR鑒定所建細胞株中目的基因產物的表達分別以抽提的1ug總RNA為模板，采用oligo-dT引物，用AMV反轉錄酶在50℃作用30分鐘，以合成互補cDNA鏈。隨后再以后者為模板，加入fup1特異性引物(上游引物5’GGTGCTAATGCATCTAATTA’3，下游引物5’AGATTGAGGCAGTAAGCAGC’3)及陽性對照G3PDH的特異性引物(上游引物5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物5’TCCACCACCCTG TTGCTGTA 3’)和Taq DNA聚合酶，在94℃解鏈、55℃退火和72℃延伸條件下反應35個循環(huán)；瓊脂糖電泳檢測反應結果。
將經RT-PCR鑒定的穩(wěn)定轉染fup1的NIH3T3細胞(樣品)以及pcDNA3空載體轉染的NIH3T3對照細胞(對照)，經計數后按每孔3×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。我們從0時刻起檢測第一組數據，其后每隔24小時檢測一次吸去每孔內的培養(yǎng)液，將MTT母液(100g/L)用含有10％胎牛血清的DMEM溶液進行1∶10稀釋后按每孔100ul加入培養(yǎng)皿，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4小時。棄去上述溶液，加入100ul DMSO使結晶狀物完全溶解，于570nm波長下測吸收值。取5個點的平均值作為檢測數據。如圖1所示，在接種后的48小時以內，轉染fup1基因的樣品細胞，其增殖與對照比較基本沒有區(qū)別；而從轉染之后的第三天起，轉染目的基因的細胞，其增殖明顯較對照組為快。數據顯示72小時后樣品細胞的數量較對照組上升72％，以后基本按照相同比例生長；表明fup1基因在NIH 3T3細胞中的表達對細胞的增殖具有促進作用。
采用相同的方法，將經RT-PCR鑒定的穩(wěn)定轉染fup1反義cDNA的BEL7404細胞(樣品)以及pcDNA3空載體轉染的BEL7404對照細胞(對照)，經計數后按每孔3×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。我們從0時刻起檢測第一組數據，其后每隔24小時檢測一次，取5個點的平均值作為檢測數據。如圖2所示，接種后的前72小時以內，轉染fup1反義cDNA的樣品細胞，其增殖與對照比較基本沒有區(qū)別；而從轉染的72小時之后起，轉染FUP1反義cDNA的細胞，其增殖較對照組表現出明顯的抑制效應。數據顯示樣品組細胞的生長在接種后的72小時至144小時內，較對照組平均下降了42.7％；表明fup1反義cDNA在BEL 7404細胞中的轉錄可能對細胞的增殖具有抑制作用，從而從反面證實了FUP1具有促進細胞增殖的功能。
實施例3 反義fup1基因轉染人肝癌細胞BEL7404的軟瓊脂集落形成實驗混合0.5ml 1.2％瓊脂和0.5ml 2×培養(yǎng)基，配成含有0.6％瓊脂的完全培養(yǎng)基，迅速加入6孔培養(yǎng)板中，靜置于室溫使其凝固，作為下層培養(yǎng)基；再混合0.5ml 0.6％瓊脂和0.5ml 2×培養(yǎng)基，配成含有0.3％瓊脂的完全培養(yǎng)基。將經RT-PCR鑒定的穩(wěn)定轉染fup1反義cDNA的BEL7404細胞以及pcDNA3空載體轉染的BEL7404對照細胞，經計數后按每孔5×103個細胞接種于6孔培養(yǎng)板的軟瓊脂培養(yǎng)基內，并加在下層培養(yǎng)基上。待上層培養(yǎng)基于室溫下凝固后，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，于相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝影。分析結果表明，穩(wěn)定轉染fup1反義cDNA的BEL7404細胞在軟瓊脂上所形成的集落，不僅數目上減少了約10％，而且所形成集落的半徑與作為正對照的BEL7404細胞所形成的集落相比也有明顯減小(圖3)。
實施例3 fup1基因和反義fup1基因的轉染細胞的裸鼠皮下注射將經RT-PCR鑒定的穩(wěn)定轉染fup1基因的NIH3T3細胞以及pcDNA3空載體轉染的NIH3T3對照細胞進行離心收集后用PBS溶液淋洗并重懸，經計數后按每點5×106細胞/100ul對裸鼠進行皮下注射。圖4顯示了B樣品(即注射fup1基因轉染的NIH3T3細胞之樣品)脊柱右側的皮下有較為明顯的腫瘤形成，而A樣品(對照組)中則無腫瘤形成(僅為細胞注射遺留的痕跡)。
采用相同方法，我們將經RT-PCR鑒定的穩(wěn)定轉染fup1反義cDNA的BEL7404細胞以及pcDNA3空載體轉染的BEL7404對照細胞進行離心收集后用PBS溶液淋洗并重懸，經計數后按每點5×106細胞/100ul對裸鼠進行皮下注射。圖5顯示了C樣品(即注射轉染fup1反義cDNA之樣品)皮下所形成的腫瘤，其體積明顯小于D樣品(對照組)。
處死裸鼠后，用鈍器將腫瘤從其皮下剝離，展示如圖6。
簡單測量腫瘤的最小直徑(a)和最大直徑(b)后，按照公式腫瘤體積V＝a2×b粗略測算腫瘤的體積(圖7)。
從腫瘤的體積可以看出，腫瘤樣品2的體積和腫瘤樣品1(陰性對照)相比，增加了近24倍，差異十分顯著；證明了fup1的表達對于NIH3T3在體內環(huán)境中的成瘤作用有很大的促進，使后者發(fā)生了明顯的致癌轉變。而腫瘤樣品3的體積和腫瘤樣品4(陽性對照)比較，則縮小了近63％，表明fup1反義cDNA的轉錄對于BEL7404細胞的體內成瘤作用有明顯的抑制作用。
實施例4腫瘤重量的比較分析新鮮剝離的腫瘤標本經液氮快速冷凍后，分別用天平檢測其重量。
從腫瘤的重量比較可以看出，腫瘤樣品2的重量和腫瘤樣品1(陰性對照)相比，增加了近19倍，差異十分顯著。而腫瘤樣品3的重量和腫瘤樣品4(陽性對照)比較，則減輕了近60％，抑制效果也很明顯(圖8)。
以上腫瘤樣品的重量測量與體積測量的結果基本一致，有力地證明了fup1在NIH3T3細胞中的表達所產生的體內成瘤性及其反義cDNA的轉錄對腫瘤生長的抑制作用。
實施例5針對fup1基因的siRNA的篩選采用Ambion公司網站(www.ambion.com)的軟件，針對fup1的編碼區(qū)設計小分子干擾RNA。從fup1基因的轉錄本開始尋找長度為19個核苷酸的潛在靶位點。使用BLAST將潛在的序列和相應的基因組數據庫(人、小鼠、大鼠等等)進行比較，排除那些和其它編碼序列/EST同源的序列。通過化學方法分別合成正鏈和負鏈，末端加上2個T以增加雙鏈的穩(wěn)定性。使用BECKMAN OLIGO1000M全自動合成儀，合成的正負鏈序列如下正鏈5’CAG CUG CUU ACU GCC UCAATT 3’；負鏈5’UUG AGG CAG UAA GCA GCU GTT 3’。
實施例6對人肝癌細胞BEL7404中fup1表達的RNA干擾體外實驗將人肝癌細胞BEL7404以每孔1×104個的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)液為DMEM+10％FBS(胎牛血清)，培養(yǎng)16-20hr待細胞貼壁后，輕輕吸取上清培養(yǎng)液，用OPTI-MEM培養(yǎng)基洗兩次。將針對fup1基因的siRNA(s3)以及不相關的siRNA(對照)分別用OPTI-MEM稀釋，同樣將轉染試劑Oliogofectamine用OPTI-MEM稀釋，5分鐘內將上述稀釋好的siRNA和Oliogofectamine混合，室溫放置20-40min后，將不同量的上述混合物加入相應的細胞培養(yǎng)孔中，4-5hr后補加FBS至終濃度為10％，置于37度、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72hr后MTT法檢測細胞數目。如圖9所示，針對fup1基因的siRNA(s3)轉染后能以劑量依賴的方式抑制人肝癌細胞BEL-7404的生長。
實施例7 對人肝癌細胞SMMC7721的中fup1表達的RNA干擾的體外實驗將人肝癌細胞SMMC7721以每孔1×104個的密度接種到96孔板中，操作方法同實施例4。如圖10所示，針對fup1基因的siRNA(s3)轉染后能以劑量依賴的方式抑制人肝癌細胞7721的生長。
實施例8 對人肝癌細胞Hep3B的中fup1表達的RNA干擾的體外實驗將人肝癌細胞Hep3B以每孔4×104個的密度接種到24孔板中，操作方法同實施例4。如圖11所示，針對fup1基因的siRNA(s3)轉染后能以劑量依賴的方式抑制人肝癌細胞Hep3B的生長。
實施例9對人肝癌細胞L02的中fup1表達的RNA干擾的體外實驗將人肝細胞L02以每孔1×104個的密度接種到96孔板中，操作方法同實施例4。如圖12所示，針對fup1基因的siRNA(s3)轉染后對人肝癌細胞L02細胞的生長速率沒有影響。
實施例10用細胞周期和凋亡芯片檢測fup1基因的表達對小鼠成纖維細胞基因表達的影響分別抽提轉染fup1基因的小鼠成纖維細胞NIH3T3和對照細胞的總RNA，反轉錄后分別標記Cy5和Cy3熒光，再與人細胞周期及凋亡芯片雜交，檢測兩種熒光的強度后比較轉染細胞和對照細胞中與細胞周期和凋亡相關的基因的表達量的變化。數據結果說明，與對照細胞相比，轉染fup1基因的細胞中許多與細胞周期相關基因的表達水平上調，如CDC27、E2F3、E2F4、MAPK1、MAPK3、MAPK8、RFC5等；一些抗凋亡因子表達水平上調如VEGFC；而一些促凋亡因子表達水平下調如BZRP；還有一些癌基因如BRAF表達水平上調。總之，發(fā)現許多促癌生長因子上調，而抑癌生長因子下調，這可能在fup1基因轉化的小鼠成纖維細胞的惡性生長過程中起了重要作用。
序列表SEQ ID NO1-600 attatacaga ttaaagattg atttttagca actttatttt aaggcagaaa aacaactaatTFIID HNF-3BC/EBP-β-540 caattatgtg ttatttgtatgtgcggtacc agtgttgacc tcttaaatgt ttgtaaattgC/EBP-β GATA-1 AFP-1 TFIID-480 cttacaatgt tagataataatgaatggtga ttgcctctaa ggatttaaaa caaaaattaaTBP NF-1GATA-2 C/EBP-α(β)-420aacatttatt ttcagtccaa gtacttttcc ctgtgttttc aaatactctt cctgtaactaTFIID CP-1(2) GATA-2 AP-1TFIID C/EBP-α(β)-360tatatttaaa ttggtttgat atgttacttt ttactgactt agaaagtata taattggtacAP-1 GATA-1 APF C/EBP-α(β)-300attttatggc tcaaattgca gctaacacag ataattcaag cttaaagatt tacattttatAP-3 AP-5，GAGA AFP-1-240gaaaatttga catgtgaatt tgacagcgtg ttgttatttg tgaatgaaag cagttttcagAFP-1 GATA-1AFP-1-180tagcttttta aaaaaaactg tgatctgaga tacacttgaa aaaatgaatt aaattattttC/EBP-α(β) PEA-3 AP-4 HNF-4-120tatttcatat caagaaatgg atgaaaagag gctgctggat ccagggttga aggttcataaTFIID，AF-1 AP-1，CP-1 C/EBP-β-60aggcctctgg gattatactc tgaagaaccc gcagacggaa tgcctgagtgactgaagaaa1ATGGGTGCTA ATGCATCTAA TTATCCTCAT TCATGTTCCC CGAGGGTAGG GGGAAATTCA61 CAGGCCCAAC AGACTTTTAT AGgtaacttt cagtttttct aacttcattt tcttttgtga121 ctataataga attgtgtttt cggtagtctc tgtagatgac aaaagaagtg agctgtagtt181 attataataa ttctgcagca tctaggtttt ttcccccaac aaacgtaaat cttaagtctg241 gtttgtatgg tttttatctt aaaccacttg tagcacaatt gagcttttct atgttttaac301 cataattgcc aattacctta ggcaaactag cagtctccat tggtgttaaa acagcgaagt361 acatatttcc tgtgtcccat ttcatttatt ttgcccatac aaatgcagac ttgtgtaatt421 aagaagaaaa agaaacattt cacaattata tacaagtaat gttcttaatt tacaactctg481 cctatttttc attcctaaaa acccatgatt aagatctatg acaaatgtcc tttgatagcc541 agggaacgaa agactttttc taaaaaaatt tagactaatt tgctctgttt gtccctattt601 cttatttaat ataaaaaatg taggccagtc acaatggctc acacctgtaa tcccagcact661 ttaggaggcc aaggcaggaa gattgcatga ggccaggaca ggagttcaag accagcctga721 gcaacattag tgagacccta tctctaccaa aaaaagaaaa aaaaattttt ttaattagcc781 aggcatggtg gcacatgcct atactcccag ctacttggga agctgaggtt ggggagaatc841 ccttgagccc aggagtttga ggctgcagtg agctatgatc ttcccactgc actccagctt901 gagcaacaca gtgagactcc atctctaaaa attaaattga attgaaaact aaaatgagtt961 aattgaactt tttgtcttcc tttataaaaa acaaatgcaa ttttgagtgg ttcggtaatg1021 tctgcttaca gaatttttca acatgaaaaa tgttaaacgt tgaaaatgaa tgttaagaaa1081 aaataaattt tcatttgttt aatttttttc ttagGGACCT CATCCTATTC TCAGCAAGGC1141 TATGGTTGCG AATCAAAGTT GTATAGCCTT GACCATGGCC ATGAGAAACC ACAAGACAAA1201 AAAAAGAGAA CCTCTGGTCT TGCCACCCTC AAAAAGAAGT TTATTAAGCG TCGGAAATCT1261 AATAGGTCTG CCGATCATGC CAAGCAGATG CGAGAACTCC TCTCTGGGTG GGATGTTAGA1321 GATGTCAATG CATTAGTGGA GGAATATGAG GGAACATCAG CATTAAAGGA GCTTTCTCTA1381 CAAGCCAGTT TGGCTAGACC AGAAGCCCGG ACATTGCAGA AAGATATGGC TGATCTTTAT1441 GAGTACAAGT ATTGTACTGA TGTAGACTTA ATATTTCAAG AAACTTGTTT TCCTGTTCAT1501 CGTGCCATTT TGGCAGCAAG GTGTCCATTT TTTAAAACAC TGCTTTCTTC CTCACCAGAG1561 TATGGGGCAG AGATAATAAT GGACATCAAT ACAGCTGGTA TTGATATGCC CATGTTTTCT1621 GCTTTGTTAC ACTACCTTTA TACAGGAGAG TTTGGAATGG AGGACTCAAG GTTTCAAAAT1681 GTCGATATCC TTGTTCAGCT TAGTGAAGAA TTTGGAACAC CAAATTCCCT TGATGTAGAT1741 ATGCGTGGAC TCTTTGATTA CATGTGTTAT TATGATGTCG TCCTTAGTTT TTCTTCAGAC1801 TCTGAACTGG TTGAAGCTTT TGGTGGAAAT CAGAACTGTT TAGATGAAGA GCTCAAAGCC1861 CACAAGGCTG TTATTTCTGC ACGGTCCCCA TTTTTTCGAA ATTTATTACA AAGGAGGATA1921 CGAACTGGTG AAGAAATCAC AGACCGAACT TTGAGGACTC CCACAAGAAT TATATTAGAT1981 GAGTCCATTA TACCAAAAAA ATATGCAACA GTGATATTAC ACTGTATGTA TACCGACGTG2041 GTGGACCTCT CTGTTTTGCA CTGTAGCCCC TCTGTGGGGA GTCTCAGTGA AGTTCAGGCT
2101 CTCGTCGCAG GGAAGCCAAA CATGACCAGG GCAGAAGAAG CCATGGAACT TTACCACATA2161 GCACTGTTCT TGGAATTTAA CATGCTTGCA CAAGgtatga agttctggtt tttaattctg2221 atttatagaa ttatgtattg atcttccaaa ttgaaaacac aaccagtata ttctatgatt2281 tcagtgtttg ggatgttaca gggtcagttt ttttgaacct tcagttatga catctgagac2341 agattgaggg tcagtattaa tgtggttctt tatttactag taaaaccaag tattcagtac2401 taatgacttc agagcattaa atgagacttg aggttctttc ttccctaatg taagacgata2461 ggtatgggaa tatataatta ccaacctaca ccctctccac ccaagctttg aaagagccca2521 gtttcccaca ttttgagtct catatttatg ttcagtacct tgttgatgtt taaatgtttg2581 gataagaata aaaattcatt acaaaaatga agatagtcac atttagatac gaatttagtt2641 gaatcagaat tgggcagggt ttctgattta aattttaaaa tattccttat cttattttta2701 gattcaactt gtacatcaag ccacagccta cagcgtgtaa aacacagtta gcgctagact2761 catgtgcctt cttcatttaa tttaaactaa aattttttta aaattaggac ggcacgtttt2821 ttgtgttata ggcaaacaaa ttcatgaaag ttacattaaa agaagtatac atctgttggt2881 aaatgttaga atcttaacat ttcagagctg gaaagagacc ttttgtagga gagcaaagac2941 agtttgctgt tttgacagag tgcattctta gctttctgtg accatatatt aaaagaaaat3001 aagctatgtg acatgagact acttgagaaa tttagctaat gcatattagc taaaagaaca3061 ttagaagttg ccagttagaa gaaaatatta atggtttggg taagagacat gaatttaaat3121 aaggaaagct aagtactgaa cttgaaaata atatgtatta tatggttaag tcagcctatc3181 aatagggctt tgagaaattg aaaaatagcc ccagttaaat aacaacatta agccagtctc3241 agtggtgtgt ggttgtagtt ctatctactt gggaggctga ggcaggaaga ccgcttgagg3301 tcaggagttc agggctgcag tgagctgtga tcatacctgt gaatagctac tgcactgtac3361 tctgggcagc atagtgagaa ctcagctgta ttttttaaaa atctcagtaa taaaatggga3421 acttacacag aagaaggcgt tgataaacat gagtgggaaa atgttgagat ttcttttaca3481 taaagaatct tttaaaacct tactttacca taatcctttt ataatagatg ttttatttta3541 ttacaacaac caaaatgtca ttaaaacagt ttattagttt agaataagaa ttattgtatc3601 aataatagac tatttagatg tcaaactgta ggaaaaatat gttatcaaaa atagagtagc3661 agtttaagct actatttttt tctgtaaaac caaatttgtc agaaaatgct tctacagaaa3721 aatttgaagt ttgcaacatt accaaaaaaa aaactatatt ttctcaaaat atttttattt3781 ttgatgcctt ttaataagaa accaaattat atagactttg tatgagaaag cattctttaa3841 tatatgtttt tttgtttgtt tttaaaaacg gagtcttgat cttgtcaccc aggctggagt3901 gcaatggcgc aatttcggct cactgcaacc tccgcctcct ggattcaagt gattctcctg3961 cctcagcctc ttgagtagct gggattacag gctcctgcca ccatgcccag ctaatttctg4021 tatttttagt agagacaggg ttttaccatg ttggccaggc tggtctcaaa ctcctaacct4081 caggtgatcc acctgcctcg gcctcccaag gtgctgggat tacaggcatg agccaccgca4141 ccttgcaggt ttttttaagt tttagatgca aagtaaaatt gtcagccagc tctaagatct4201 ttggtaatac ttgattattt atctagagtt tatcttgagt taatttctct tttttttttt4261 ttagtgttta gctaaaagtt gtattttatt cagtgtattt aaagatataa aataatactt4321 tttgcattgt ctaatctggt tacttaaaac aagcaaaaaa aaatcttgtg tacaaatatt4381 cccttaaatg tggatatata tgctcttctt tttccctttg ttactcaaaa tagagtttga4441 gttatttttg ttttgttttt tgtaacccat gtggggcata tctttccccc atacccatga4501 aatattcata ttaaggttta taaaagacta taactttaac ataattttta tctcatttcc4561 ataggaagaa gaatattagc tcgcttgagg taggatttta taccataaag ctcaagagtt4621 caggttctaa aaccagacag actgggtttc agttctctac cgtgtcttag tttgacctta4681 accaagtcac atagcctaag cccctctttt ctcatttgta aaataaagat agtaaaccct4741 ataagctatg atgattaaag gaaataatat atgttaaatg atctgagtag cacctgttac4801 atagtaaaca ttcagtaaat gttagctgct aaactataat aatcaccaca acatatgtct4861 ctcactacca tatagttttt ttctaaaaat aactttaagt ttaaaaaata attttactag4921 gccaggtgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg agaggctgag gcaggaggat4981 cacttgagcc caggagttca agatcagctt gggcaatata gtgagacctc gtctctacca5041 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaactaggc ctagcacagt ggcccacact tgtaatccca5101 gcactttggg aggccgaggt ggatggatca cttgaggcca ggagtttaag accagcttga5161 ccaacatggt gaaaccccat ctctaccaaa aaatacaaaa attagccagg catcatggta5221 cacgcttcta gtcccaggta ggctgaggca ggagaatcgt ttgaacccgg gagatggagg5281 ttgcagtgag ctgagatcgc accactgcac accagcctgg gcgacagagt gagtctccat5341 ctcaaaaaaa taaaaataca aaaaaattta gctgggtgtg gtggcacaca cctgtaatcc5401 cagctaccca ggaggctgag gcatgagaat tacttgaacc caggagcggg aggtggcagt5461 gagccaagat tgcaccactc cactccagcc cgggtgatag agtgagactt tgtcttaaaa5521 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ggccaagtgc agtgggtcac gcctgtaacc ccagcacttt5581 gggaggccgg ggcaggcaga tcacgaggtc aggagatcga gaccatcctg gctaacaggg5641 tgaaaccccg tctctactaa aaatacaata aattagctgg gcatggtggc aggtgcctgt
5701 agtcccagct gctcaggagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacccagga ggcgaagctt5761 gcagtgagct gagatcgcac cactgcactc caacctgggc gacggagtga ac tgcgtct5821 caaaaaaaaa aaaaaattaa aaggcagtat tggcagacag ctagagtggt ttggcaagtg5881 ggtaaaagga ttcttggtgc caggtgcggt ggctcaaaca cctttaatcc cagcactttg5941 ggaggccaag gcaggcggat cacctgaagt caggagttcg agaccagcct ggccaacatg6001 gtgaaacccc cgtctctaac tacaaaaatt agttgggcgt ggtggtgcat acctgtaatc6061 ccagctacta gggaggctga ggcacaataa ttgcttaaac ctaggaggca gaggttgcag6121 taagtcgaga tcacagcact gca tccaag cctgggcaac tgagtgagac tctgtctcca6181 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcccagagag ttgagattct tggcctacac agagaatgtg6241 ttttatatca gtagggagga gcaggcagta ggcaatcaca agtagataac ggcctcaact6301 tacaggcctg gcatttagga ccagatttaa cttcacttga ttttcattta aacataacaa6361 aatgaatatg tttaatttta tttccttcaa agccctatta tcatagtgaa ggaataaaac6421 aaatataagc tctcaaggac aaagagacaa agatacctaa ggagaaaaca acaatgggga6481 agatgttgaa atttttggaa aatggaaagc agatagagac ttgattactg gcttaacaga6541 ggagcagcct gtaattagat gctgtaaagg gggctactga ggagaagtga ggcagttcac6601 ctgttagagc tctggcgtgg ctcaggccag gtggaactaa gtactctgga aagaagggat6661 atgcatagca tagaactaaa aagacagagt tgattttaag tctgaatact gagggatcag6721 accctttccc caaccctgga attcatcttt atgtatggta ttagaaaagg atgtggtttt6781 gttcttctgc atatagtgag ccaagtattc cctactaatt ccctattcct gatttgtgcc6841 actcttaaag ctgctatgta tgcatggatt gtattcatgc atcagtactc agtctccatt6901 ttgtcccagt ggtccatttg tctgttcttg cattactatc acttgcaaca aggtgacatg6961 cccttgtccc cgccccctca attcgcctct ctgctactgc ccccacaaca aaacacagga7021 gacctgagat tttctaaaat tttctgaatt ttctaaagaa attagagaga ttccaaatct7081 ggaaatagca acagaggagg gtagggatgt ggcacagggt tgaaatctat aattatgtga7141 aaccctatgg tgaaatcacc tacttcctta acccctgctg taataccagc caggcaaata7201 caagaagaaa ctggagtcct ggaaatggtg aacagctcaa aagtatatac acttacagat7261 actgatgttt tgggtttcca cagtgaaatt acactcaggg gttataaaat gaaaaagcca7321 gcttgccttc catttgtttt acagAGGAGA CTACAGTCAT CAGGCCTGCC TGTGCAGCAG7381 AGCTTTCAAA CAGCTGCTTA CTGCCTCAAT CTTAAatatg aaaacccatc caaggataac7441 tggacatttg aggaaagctt ccaaattgag acagagatca gagcaaaaag aacaaagtcc7501 tggaggaagc agacaatgaa gggagcagag gaaaacttca gtagaatcaa aatatcctta7561 tataaaagaa ctttttatgg aatcagtgag acataagcag gatgctatta aagtaaaaac7621 aggagctttt agaaataaga tagcagaaat gaaagatata atggaagcat tgaaaggtac7681 agttgaggaa atctagaaag taaataatat aataaagaga tgagtggaga caaataaaacSEQ ID NO21 TACCCACGAT TACGTAGATT AATAGGAGTA AGTACAAGGG GCTCCCATCC CCCTTTAAGT61 GTCCGGGTTG TCTGAAAATA TCCCTGGAGT AGGATAAGAG1 TCGTTCCGAT ACCAACGCTT121 AGTTTCAACA TATCGGAACT GGTACCGGTA CTCTTTGGTG TTCTGTTTTT TTTCTCTTGG181 AGACCAGAAC GGTGGGAGTT TTTCTTCAAA TAATTCGCAG CCTTTAGATT ATCCAGACGG241 CTAGTACGGT TCGTCTACGC TCTTGAGGAG AGACCCACCC TACAATCTCT ACAGTTACGT301 AATCACCTCC TTATACTCCC TTGTAGTCGT AATTTCCTCG AAAGAGATGT TCGGTCAAAC361 CGATCTGGTC TTCGGGCCTG TAACGTCTTT CTATACCGAC TAGAAATACT CATGTTCATA421 ACATGACTAC ATCTGAATTA TAAAGTTCTT TGAACAAAAG GACAAGTAGC ACGGTAAAAC481 CGTCGTTCCA CAGGTAAAAA ATTTTGTGAC GAAAGAAGGA GTGGTCTCAT ACCCCGTCTC541 TATTATTACC TGTAGTTATG TCGACCATAA CTATACGGGT ACAAAAGACG AAACAATGTG601 ATGGAAATAT GTCCTCTCAA ACCTTACCTC CTGAGTTCCA AAGTTTTACA GCTATAGGAA661 CAAGTCGAAT CACTTCTTAA ACCTTGTGGT TTAAGGGAAC TACATCTATA CGCACCTGAG721 AAACTAATGT ACACAATAAT ACTACAGCAG GAATCAAAAA GAAGTCTGAG ACTTGACCAA781 CTTCGAAAAC CACCTTTAGT CTTGACAAAT CTACTTCTCG AGTTTCGGGT GTTCCGACAA841 TAAAGACGTG CCAGGGGTAA AAAAGCTTTA AATAATGTTT CCTCCTATGC TTGACCACTT901 CTTTAGTGTC TGGCTTGAAA CTCCTGAGGG TGTTCTTAAT ATAATCTACT CAGGTAATAT961 GGTTTTTTTA TACGTTGTCA CTATAATGTG ACATACATAT GGCTGCACCA CCTGGAGAGA1021 CAAAACGTGA CATCGGGGAG ACACCCCTCA GAGTCACTTC AAGTCCGAGA GCAGCGTCCC1081 TTCGGTTTGT ACTGGTCCCG TCTTCTTCGG TACCTTGAAA TGGTGTATCG TGACAAGAAC
1141 CTTAAATTGT ACGAACGTGT TCTCCTCTGA TGTCAGTAGT CCGGACGGAC ACGTCGTCTC1201 GAAAGTTTGT CGACGAATGA CGGAGTTAGASEQ ID NO3正鏈5’CAG CUG CUU ACU GCC UCA ATT 3’；負鏈5’UUG AGG CAG UAA GCA GCU GTT 3’。
權利要求
1.一種抗肝癌基因藥物組合物，包含安全、有效量的反義fup1基因和/或小分子干擾RNA，及藥學上可接受的輔劑。
2.如權利要求1所述的基因藥物組合物，其中所述的反義fup1基因具有序列表中SEQ ID NO2所示DNA序列。
3.如權利要求1所述的基因藥物組合物，其中所述的小分子干擾RNA具有序列表中SEQ ID NO3所示RNA序列。
4.如權利要求1所述的基因藥物，其中所述反義fup1基因的安全、有效量為0.1-100mg。
5.小分子RNA，包含序列表中SEQ ID NO3所示序列。
6.如權利要求5所述的小分子RNA，所述小分子RNA具有干擾fup1基因在肝癌細胞中高表達的作用。
7.權利要求5所述小分子RNA在制備治療肝癌藥物上的應用。
8.一種抗肝癌基因藥物的篩選方法，其特征在于采用ambion網站提供的RNAi設計軟件，針對fup1的編碼區(qū)設計小分子干擾RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗肝癌基因藥物組合物，包含安全、有效量的反義fup1基因和/或小分子干擾RNA，及藥學上可接受的輔劑。其中所述反義fup1基因具有序列表中SEQ ID NO2所示DNA序列，所述小分子干擾RNA包含序列表中SEQ ID NO3所示RNA序列。還提供采用ambion網站提供的RNAi設計軟件，針對fup1的編碼區(qū)設計小分子干擾RNA的抗肝癌基因藥物篩選方法。進一步提供包含序列表中SEQ ID NO3所示RNA序列的抗肝癌小分子。本發(fā)明以在肝癌細胞中高表達的基因fup1為藥靶，針對其基因序列設計拮抗分子，為肝癌的基因治療提供了有力的武器，并為進一步篩選抗肝癌的基因藥物提供了很好的篩選平臺。
文檔編號A61K48/00GK1654074SQ200410016210
公開日2005年8月17日 申請日期2004年2月11日 優(yōu)先權日2004年2月11日
發(fā)明者周慶瑋, 張倩, 朱俊, 潘巍, 金由辛, 甘人寶, 李載平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院