專利名稱：：三重復合微球制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥劑學領(lǐng)域，涉及生物可降解微囊及微球制劑及其制備方法，尤其涉及海藻酸鈣-殼聚糖-乙交酯丙交酯共聚物三重復合微球制劑及其制備方法。這種新型的復合制劑對解決蛋白類疫苗投藥的瓶頸問題有著重大的意義。
背景技術(shù)：
：接種疫苗是除純凈水供應外最有效的抗感染性疾病的公共衛(wèi)生措施。只是一些疫苗如乙肝疫苗、破傷風疫苗常需接種2-3次才能達到預期的免疫效果，漏種率很高，嚴重影響免疫效果也導致疫苗儲運費用和醫(yī)護開支的增加。因此，首次接種疫苗即獲完全免疫是世界衛(wèi)生組織疫苗發(fā)展規(guī)劃的主要目標之一。開發(fā)一次接種便獲全程免疫的單劑量疫苗是一種理想的解決辦法。關(guān)鍵是選擇合適的可生物降解的高分子材料，建立長時間脈沖釋放抗原的傳輸系統(tǒng)。疫苗載體常用聚酯、聚氨基酸、聚酸酐等。聚酯類常用乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)[1]，且PLGA微球用于疫苗給藥具有佐劑作用。目前，PLGA微球作為水溶性蛋白、多肽類疫苗控釋給藥系統(tǒng)的發(fā)展所遇到的最大阻力便是此類藥物的穩(wěn)定性問題及藥物從PLGA基質(zhì)的突釋和不完全釋放問題，而且PLGA的疏水性使親水性蛋白藥物的包封效果亦較差。首先，能溶解PLGA的有機溶劑種類極少，以二氯甲烷最為常用。蛋白類藥物與有機溶劑反復超聲或攪拌導致蛋白聚集，活性受損。其次，隨著聚合物的降解而產(chǎn)生的酸性成分也是蛋白失活的一個重要原因。已有許多方法報道用于避免蛋白的活性損失(1)制備時，直接以蛋白凍干粉分散于有機溶劑中，以增加蛋白的穩(wěn)定性[2]；(2)先制成W/O乳液，初乳液中的油可以隔開蛋白藥物和聚合物有機相；(3)采用新包囊技術(shù)，使用溫和的有機溶劑如醋酸、苯甲醇、三乙酸甘油酯和N，N’-二甲乙酰胺溶解PLGA，使最低限度引起蛋白變性[3]；(4)加入蛋白保護劑，如海藻糖、環(huán)糊精、聚乙二醇(PEG)等多羥基類物質(zhì)，吐溫20等表面活性劑及牛血清白蛋白等。它們或先于蛋白吸附于兩相界面，減少包囊蛋白與有機溶劑的接觸，或依靠多羥基圍繞在蛋白周圍，固定蛋白的天然構(gòu)象[4]；(5)消除PLGA降解過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)的不良影響，為抗原創(chuàng)造pH值相對穩(wěn)定的微環(huán)境?？杉尤氲姆€(wěn)定劑有明膠、阿拉伯膠、乙?；讱べ|(zhì)、谷氨酸鈉等，也可直接應用氫氧化鎂、碳酸鎂、碳酸鋅等堿性物質(zhì)，甚至直接將蛋白藥物溶于磷酸鹽緩沖劑以維持PLGA降解過程中的pH值。對3％Mg(OH)2和10％蔗糖對包裹入PLGA微球內(nèi)牛血清白蛋白(BSA)的穩(wěn)定性結(jié)果考察比較不加附加劑微球在37℃孵育4周81％蛋白發(fā)生聚集，加糖后為50％；加堿后則少于7％[5]。(6)將蛋白藥物包囊于瓊脂糖水凝膠顆粒中，再進一步分散于PLGA微球。此復合微球包封率高，水合作用快，更重要的是瓊脂糖水凝膠對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用，但未能改變蛋白藥物的突釋[6]。此外，水溶性蛋白的PLGA微球的制備常采用W/O/W復乳法，多可形成多孔性微球，且真空干燥使孔隙率更大[7]。也有一系列方法用于減少藥物突釋如減少內(nèi)水相體積比；外水相中加入緩沖鹽；改變有機相組成或在有機相中加入甘油；改變操作方法如以減壓溶劑揮發(fā)法代替常壓溶劑揮發(fā)法，超聲乳化代替高速攪拌等[8]。但始終水溶性蛋白、多肽類藥物從PLGA微球中的突釋現(xiàn)象及由于蛋白聚集等原因而導致的不完全釋放等問題得不到很好的解決。天然的或合成的生物可降解材料在藥物制劑方面的應用日益增加。較非生物降解材料，它具有更多優(yōu)點如給藥更為方便，有良好的順應性，應用后期仍具有一定的釋藥速率，甚至隨降解材料的變化有可能產(chǎn)生脈沖給藥等。然而，無論是親水性材料還是疏水性材料，單獨應用于蛋白藥物的投藥系統(tǒng)均不理想。親水性材料具有良好的生物相容性，但常常具有較快的釋藥速度。另一方面，疏水性材料具有緩釋作用，但它與水溶性的蛋白、多肽類藥物不相容，會引起原本處于折疊態(tài)的天然蛋白結(jié)構(gòu)伸展，導致活性的改變，而且包封率也很難提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種新的復合微球制劑及其制備方法，即三重復合微球制劑及其制備方法，目的在于提供水溶性多肽、蛋白類疫苗以穩(wěn)定的親水性微環(huán)境，從而很好地保護蛋白藥物，使其免受或少受有機溶劑及隨PLGA生物降解產(chǎn)生pH下降所致的活性損失，同時提高藥物包封率，大大減少藥物的突釋，并通過最外層的PLGA本身聚乳酸(PLA)與聚羥乙醇酸(PGA)比例的調(diào)整使藥物的最終控釋成為可能，這種新型的復合制劑對解決蛋白類疫苗投藥的瓶頸問題有著重大的意義。本發(fā)明提供的三重復合微球制劑及其制備方法，是采用W/O乳化、異丙醇洗滌制備小粒徑海藻酸鈣微囊，并以殼聚糖進一步包裹海藻酸鈣微囊，形成結(jié)構(gòu)更為致密的海藻酸-殼聚糖雙層微囊，再采用乳化-溶劑揮發(fā)法將海藻酸-殼聚糖雙層微囊包裹入乙交酯丙交酯共聚物內(nèi)形成三層復合微球。本發(fā)明微球制劑的主要組成為模型藥物3％、海藻酸鈣10％、殼聚糖2％、乙交酯丙交酯共聚物85％，還包括藥用敷料。本發(fā)明制備方法主要通過以下方案實現(xiàn)(1)海藻酸鈣微囊制備將模型藥物溶于0.5％～2％(w/v)海藻酸鈉溶液中為水相，另取第一乳化劑，按4％～6％(w/v)濃度溶于異辛烷作為油相，兩相體積比為1∶2，高速乳勻轉(zhuǎn)速為5000～20000rpm，兩相高速乳勻1～5分鐘后滴加第二乳化劑，再乳勻1～5分鐘，逐滴加入1％～10％(w/v)交聯(lián)劑后依然乳勻1～5分鐘，加入異丙醇在相同轉(zhuǎn)速下最后乳勻1～3分鐘。離心后制得海藻酸鈣微囊。(2)海藻酸鈣-殼聚糖雙層微囊制備用0.1％～2.0％、pH4～6的殼聚糖溶液孵育海藻酸鈣微囊10～40分鐘，離心收集微囊后用殼聚糖溶液和/或水清洗，冷凍干燥得到粒徑均勻、形態(tài)圓整的海藻酸鈣-殼聚糖雙層微囊。(3)三層復合微球制備將上述雙層微球以1％～1.5％(w/w)濃度分散至3.5～4.0g二氯甲烷中，探頭式超聲儀50～200w，10～40秒超聲，再稱取乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)，消旋PLGA(DL-PLGA)及左旋PLA(L-PLA)(按40∶54∶6比例)共1g加入上述混懸液中，渦旋使溶解作為油相；另配制0.1％～0.5％羧甲基纖維素鈉溶液5～10ml作為水相，將油相加至水相，1200～2000rpm攪拌下乳勻3～5分鐘，隨后，將其逐滴加入50～200ml，0.5％～1％聚乙烯醇(PVA)溶液中，500～600rpm下乳勻1～2分鐘后提高轉(zhuǎn)速至800rpm～2000rpm繼續(xù)攪拌1～3分鐘，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去二氯甲烷，離心收集復合微球，蒸餾水洗滌后冷凍干燥即可。(4)也可將海藻酸鈣-殼聚糖微囊以≤1.2％(w/v)濃度分散至乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)的乙腈溶液中(微球∶PLGA＝1∶4～1∶10)，探頭式超聲儀50～200w，5～30秒超聲后作為混懸水相，司盤80按4％～8％(w/v)溶于花生油作為油相。油相在500～600rpm攪拌下緩慢滴入上述混懸液，隨后，提高轉(zhuǎn)速至800～2000rpm并繼續(xù)攪拌1～2分鐘，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙腈，離心收集復合微球，石油醚洗滌后37℃揮干或真空干燥即可。本發(fā)明的模型藥物主要包括多肽類、蛋白類藥物。海藻酸鈉溶液的含量為0.5％～2％。第二乳化劑用量為第一乳化劑用量的15％～49％，第一乳化劑優(yōu)選司盤80，第二乳化劑優(yōu)選吐溫80。三層復合微球制備中所用的PLGA，其PLA與PGA的比例為50～100∶50～0。海藻酸鈣-殼聚糖微囊的粒徑1～5μm。復合微球粒徑為20μm～50μm。本發(fā)明的三層復合微球制劑的制劑形式包括注射劑型和口服劑型。本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果(1)發(fā)明首先采用較溫和的修飾乳化及離子交聯(lián)法將水溶性多肽、蛋白類疫苗包裹入海藻酸鈣-殼聚糖雙層微囊內(nèi)，一方面提供一個穩(wěn)定的水凝膠微環(huán)境，從而很好地保護蛋白類藥物，使其免受或少受有機溶劑對活性的影響，另一方面PLGA生物降解產(chǎn)生的pH下降，也隨殼聚糖的溶解可帶走部分H+，從而減少因降解產(chǎn)物酸性所致的活性損失，減少蛋白的不完全釋放。(2)大多數(shù)蛋白類藥物在水中溶解度大，通過乳化交聯(lián)技術(shù)制備海藻酸鈉微囊時采用水洗法制得的微囊包封率為4％～18％，遠遠低于醇洗法的80％～100％。同時，水洗法所得微囊的量為醇洗法的50％左右。因此，本發(fā)明進一步用殼聚糖包裹的海藻酸鈣微囊采用醇洗法制備得到，使復合微囊制備的第一步建立在較高的起點上。得到的海藻酸微囊進一步在殼聚糖溶液中孵育，通過靜電作用包囊以及隨后疏水性PLGA材料的第三次包囊，包封效率都可接近于100％，不僅使水溶性蛋白類藥物在疏水性PLGA微球中包封率大大提高，也使海藻酸微囊對水溶性藥物的泄漏和快速釋放得以阻滯，從而更好地控制藥物釋放模式。(3)復合微球明顯減少藥物的突釋現(xiàn)象，由單純PLGA微球24h內(nèi)釋藥約50％左右到復合微球的大約10％，并通過最外層的PLGA調(diào)整PLA與PGA比例控制藥物的最終釋放模式。圖1為海藻酸鈣-殼聚糖-乙交酯丙交酯共聚物三重復合微球的掃描電鏡圖。圖2為水洗法和醇洗法制備所得海藻酸鈣微球的收得率、包封率和載藥率比較。圖3為經(jīng)不同濃度殼聚糖孵育后制得的海藻酸-殼聚糖微球的釋放比較。圖4為不同pH條件下制得的海藻酸-殼聚糖微球在體外釋放比較。圖5為海藻酸-殼聚糖微球的粒徑和形態(tài)掃描電鏡圖。圖6為單純PLGA微球和三重復合微球中BSA的體外累積釋放圖。具體實施例方式實施例1本發(fā)明復合微球的一種制備方法(1)海藻酸鈣微囊制備以BSA作為模型藥物，將BSA用少量蒸餾水溶解后與1％海藻酸鈉溶液充分混勻，第一乳化劑為司盤80，溶于異辛烷的濃度為5％(w/v)，兩相體積比為1∶2，高速乳勻轉(zhuǎn)速為12000rpm，時間為3分鐘，然后加入第二乳化劑即吐溫80，濃度為30％(w/w)，用量為司盤80的45％，再乳勻3min，加入交聯(lián)劑氯化鈣溶液，濃度為8％(w/v)，再乳勻3分鐘，加入異丙醇以析出微囊的提取時間為2分鐘。離心后制得海藻酸鈣微囊。(2)海藻酸鈣-殼聚糖微球制備將上述制的得海藻酸鈣微囊，用1.0％pH4殼聚糖溶液孵育10～40分鐘，離心收集微囊，再用同樣的殼聚糖溶液清洗1次，用水清洗2次(或3次均用水清洗)，冷凍干燥得到＜5μm大小，粒徑均勻、形態(tài)圓整的海藻酸鈣-殼聚糖微囊。(3)三層復合微球制備將上述微囊以1.2％(w/w)濃度分散至3.5～4.0g二氯甲烷中，探頭式超聲儀200w，40秒超聲，再稱取PLGA，DL-PLGA及L-PLA(按40∶54∶6比例)共1g加入上述混懸液中，渦旋使溶解作為油相；另配制0.2％羧甲基纖維素鈉溶液8ml作為水相。將油相加至水相，1800rpm攪拌下乳勻5分鐘，隨后，將其逐滴加入150ml，0.5％PVA溶液中，600rpm下乳勻2分鐘后提高轉(zhuǎn)速至1200rpm繼續(xù)攪拌3分鐘，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去二氯甲烷，離心收集復合微球，蒸餾水洗滌后冷凍干燥即可，制得的復合微球粒徑為35μm，微球粒徑參見圖1。通過本發(fā)明方法制得的復合微球，可明顯減少突釋現(xiàn)象，而且，可通過改變外層PLGA的組成比調(diào)節(jié)藥物的釋放模式。本發(fā)明首先將水溶性蛋白或多肽類疫苗溶解在一定濃度的海藻酸鈉溶液中，形成初始的保護，利用乳化-離子交聯(lián)法制得海藻酸鈣微囊[9]，醇洗法提高藥物包封率，并在殼聚糖溶液中孵育形成雙層復合微囊，從而使海藻酸鈣微囊的結(jié)構(gòu)更為致密，減少包囊藥物的突釋，并提供給藥物雙重的親水性聚合物的保護，產(chǎn)生一個合適的親水性微環(huán)境。而且，由于PLGA的初始降解速度較快，產(chǎn)生的酸性成分有利于殼聚糖的溶解及藥物的首次釋放，在減少或消除藥物突釋的前提下又不影響藥物的第一次釋放，甚至可以帶走大部分因PLGA降解而產(chǎn)生的H+。使蛋白的穩(wěn)定性問題及突釋問題得以解決。此外，海藻酸-殼聚糖微膠囊對模型蛋白BSA的包封效率可高達97％，第二次PLGA包囊亦可大于90％，因此可使藥物包封率大大提高。由于進一步用殼聚糖包裹海藻酸鈉微囊，也使海藻酸微囊對水溶性藥物的泄漏和快速釋放得以阻滯，減少藥物的突釋，從而更好地控制藥物的釋放模式。第二次包囊亦采用W/O乳化法，其中一種方法參考文獻中PLGA相圖及聚合物合金理論[10]。同時，藥物的不同釋放模式可通過改變PLGA中PLA與PGA的比例，從50∶50到100∶0的范圍或混合不同比例的PLGA微球加以控制。這種復合微球的制備不僅給予蛋白、多肽類藥物以海藻酸凝膠親水性微環(huán)境作為第一層保護，而殼聚糖的加入使藥物的突釋大為減少，并進一步地穩(wěn)定蛋白，最外層的PLGA，通過本身PLA與PGA比例的調(diào)整使藥物的最終控釋成為可能。因此，對解決蛋白類疫苗制劑的瓶頸問題有重大的意義。實施例2本發(fā)明復合微球的第2種制備方法第一步中兩相高速乳勻轉(zhuǎn)速為5000rpm；第二步得到的雙層復合微囊粒徑＜8μm；第三步得到的微球粒徑＜50μm；其余步驟同實施例1。實施例3本發(fā)明復合微球的第3種制備方法第一步中兩相高速乳勻轉(zhuǎn)速為20000rpm，第二步得到的雙層復合微囊粒徑＜2μm，第三步得到的微球粒徑＜30μm，其余步驟同實施例1。實施例4本發(fā)明復合微球的第4種制備方法交聯(lián)劑為氯化鋅溶液，第二步得到的雙層復合微囊粒徑＜5μm，第三步得到的微球粒徑＜40μm，其余步驟同實施例1。實施例5本發(fā)明復合微球的第5種制備方法交聯(lián)劑為氯化鋇溶液，第二步得到的雙層復合微囊粒徑＜5μm，第三步得到的微球粒徑＜40μm，其余步驟同實施例1。實施例6本發(fā)明復合微球的第6種制備方法步驟基本同實施例1，但采用1％pH6殼聚糖溶液孵育，得到復合微囊粒徑和形態(tài)相同。實施例7本發(fā)明復合微球的第7種制備方法步驟基本同實施例1，但第三步采用0.1％羧甲基纖維素鈉溶液，得到復合微囊粒徑＜30μm。實施例8本發(fā)明復合微球的第8種制備方法步驟基本同實施例1，但第三步采用0.5％羧甲基纖維素鈉溶液，得到復合微囊粒徑＜50μm。實施例9本發(fā)明復合微球的第9種制備方法步驟基本同實施例1，但第三步提高轉(zhuǎn)速至2000rpm，得到復合微囊粒徑＜30μm。實施例10本發(fā)明復合微球的第9種制備方法模型藥物為超氧化物歧化酶(SOD)，其余制備方法同實施例1，制得的復合微球粒徑、形態(tài)及釋放特征同實施例1的BSA。實施例11本發(fā)明復合微球的第11種制備方法第一步和第二步采用與實施例1相同的方法。第三步方法為將海藻酸鈣-殼聚糖微囊以0.86％(w/v)濃度分散至乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)的乙腈溶液中(微囊∶PLGA＝1∶6)，探頭式超聲儀200w，20秒超聲后作為混懸水相，司盤80按6.67％(w/v)溶于花生油作為油相。油相在600rpm攪拌下緩慢滴入上述混懸液，隨后，提高轉(zhuǎn)速至1200rpm并繼續(xù)攪拌2分鐘，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙腈，離心收集復合微球。石油醚洗滌后37℃揮干或真空干燥即可，制得的復合微球粒徑為30.1μm，微球粒徑參見圖1。本發(fā)明方法利用親水性生物可降解材料海藻酸鈉與鈣離子這種溫和的交聯(lián)方法提供水溶性多肽、蛋白類疫苗以穩(wěn)定的親水性微環(huán)境，然后采用另一親水性生物可降解聚合物殼聚糖溶液孵育，通過陰、陽離子靜電作用產(chǎn)生的雙層海藻酸-殼聚糖微囊結(jié)構(gòu)更為致密，使蛋白藥物進一步免受或少受有機溶劑及隨PLGA生物降解產(chǎn)生pH下降所致的活性損失，從而很好地保護蛋白藥物，同時提高藥物包封率，大大減少藥物的突釋，將上述雙層微囊進一步分散于PLGA微球中制成三重復合微球，并最終得到緩釋制劑，而且，通過最外層的PLGA本身聚乳酸(PLA)與聚羥乙醇酸(PGA)比例的調(diào)整控制藥物的釋放在要求的時間內(nèi)。實施例12水洗法和醇洗法制備所得海藻酸鈣微囊的收得率、包封率和載藥率比較由于BSA在水中溶解度大，通過W/O乳化，鈣離子交聯(lián)固化制備海藻酸鈣微囊時采用水洗法制得的微囊包封率為18.83％±0.11％，遠遠低于醇洗法的99.95％±0.06％。同時，水洗法所得微囊的量為醇洗法的49.43％，結(jié)果參見附圖2。實施例13經(jīng)不同濃度殼聚糖孵育后制得的海藻酸-殼聚糖微囊在生理鹽水中的釋放比較蛋白的釋放隨著包裹海藻酸鈣微球的殼聚糖濃度上升而漸受抑制，藥物用量為20％的海藻酸(1％)微球，用0％、0.1％、0.5％殼聚糖包裹，在生理鹽水中48h蛋白釋放率分別為99.50％±0.01％，93.20％±0.42％，44.19％±0.11％，繼續(xù)提高至1.0％則無更大的延緩作用，為54.00±0.85％，結(jié)果參見附圖3。實施例14海藻酸-殼聚糖微囊的體外釋放比較將1％海藻酸微囊分別經(jīng)pH4和pH6的1％殼聚糖溶液孵育后制得的海藻酸-殼聚糖微囊，經(jīng)體外釋放比較，表明1％，pH4的殼聚糖溶液較pH6溶液阻滯蛋白釋放作用更強。前者48h蛋白釋放率為20.35±1.07％，后者為55.96％±3.00％。雙層復合微囊中蛋白在生理鹽水中釋放均可從48h延緩至7d以上，結(jié)果參見附圖4。實施例15復合微囊的粒徑和形態(tài)電鏡掃描將用醇洗法制得的海藻酸微囊經(jīng)pH為4，濃度在0.2％～0.5％范圍的殼聚糖溶液包裹后大小均一，呈球形，表面光滑，在生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中分散性好，平均粒徑在1～2μm，包封率大于85％，電鏡掃描結(jié)果參見附圖5，體均粒徑為1.15±0.21μm。實施例16單純PLGA微球和三重復合微球中BSA的體外累積釋放比較精密稱取單純PLGA微球30mg或三重復合微球150mg至eppendorf管，分別加入3.0ml生理鹽水作為釋放介質(zhì)，渦旋分散后置37℃恒溫振蕩器，在700rpm下進行釋放試驗。間隔一定時間將樣品液1,2000rpm(PLGA微球)或4000rpm(三重復合微球)，15min高速離心，取1.0ml上清夜用微量BCA試劑盒測定釋出蛋白的含量，沉淀用1.0ml新鮮介質(zhì)補足，分散后繼續(xù)振蕩。計算累積釋藥量，以各實驗點的累積釋藥量與微球中所含蛋白總量的百分比為縱坐標，各實驗取樣點為橫坐標作釋放曲線。通過本發(fā)明方法制得的復合微球，可明顯減少突釋現(xiàn)象，而且可通過改變外層PLGA的組成比調(diào)節(jié)藥物的釋放模式，與BSA的PLGA微球的體外釋放作比較參見附圖6。本發(fā)明涉及的部分參考文獻1.O′HaganDT，SinghM，GuptaRK.Poly(lactide-co-glycolide)microparticlesforthedevelopmentofsingle-dosecontrolled-releasevaccines.AdvancedDrugDeliveryReviews1998；32225-2462.DiwanM，ParkTG.PegylationenhancesproteinstabilitystabilityduringencapsulationinPLGAmicrospheres.JControlledRelease2001；73233-2443.KinamP.Anewmicroencapsulationprocessforproteindrugs.NewProjectX(2000)4.何應，柳林，魏樹禮等。破傷風類毒素聚乳酸微球中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究。中國藥學雜志2001；36(6)391-3945.KangJ，SchwendemanSP.ComparisonoftheeffectsofMg(OH)2andsucroseonthestabilityofbovineserumalbuminencapsulatedininjectablepoly(d，l-lactide-co-glycolide)implants.Biomaterials2002；23(1)239-2456.WangN，WuXS.Anovelapproachtostabilizationofproteindrugsinpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheresusingagarosehydrogel.InternationalJPharm1998；1661-147.李巖，孫殿甲，畢殿洲。聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物微球的制備及體外釋放影響因素研究進展。中國現(xiàn)代應用藥學2002；19(4)281-2848.趙鋒，高永良。乳化分散法制備聚乳酸微球的研究進展。中國新藥雜志200211(2)123-1269.LemoineD，WautersF，Bouchend’hommeS，etal.，Preparationandcharacterizationofalginatemicrospherescontainingamodelantigen.IntJPharm1998；1769-1910.MatsumotoA，MatsukawaY，SuzukiT，etal.Thepolymer-alloysmethodasanewpreparationmethodofbiodegradablemicrospheresprincipleandapplicationtocisplatin-loadedmicrospheres.JControlledRelease1997；48(1)19-27在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應用，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。此外，前面的優(yōu)選具體實施方案應被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.三重復合微球制劑及其制備方法，其特征是采用W/O乳化、異丙醇洗滌制備小粒徑海藻酸鈣微囊，并以殼聚糖進一步包裹海藻酸鈣微囊，形成結(jié)構(gòu)更為致密的海藻酸-殼聚糖雙層微囊，再采用乳化-溶劑揮發(fā)法將海藻酸-殼聚糖雙層微囊包裹入乙交酯丙交酯共聚物內(nèi)形成三層復合微球。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重復合微球制劑，其特征是制劑的主要組成為模型藥物3％、海藻酸鈣10％、殼聚糖2％、乙交酯丙交酯共聚物85％。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重復合微球制備方法，其特征是主要通過以下方案實現(xiàn)(1)海藻酸鈣微囊制備將模型藥物溶于0.5％～2％(w/v)海藻酸鈉溶液中為水相，另取第一乳化劑，按4％～6％(w/v)濃度溶于異辛烷作為油相，兩相體積比為1∶2，高速乳勻轉(zhuǎn)速為5000～20000rpm，兩相高速乳勻1～5分鐘后滴加第二乳化劑，再乳勻1～5分鐘，逐滴加入1％～10％(w/v)交聯(lián)劑后依然乳勻1～5分鐘，加入異丙醇在相同轉(zhuǎn)速下最后乳勻1～3分鐘。離心后制得海藻酸鈣微囊。(2)海藻酸鈣-殼聚糖雙層微囊制備用0.1％～2.0％、pH4～6的殼聚糖溶液孵育海藻酸鈣微囊10～40分鐘，離心、收集微囊后用殼聚糖溶液和/或水清洗，冷凍干燥得到粒徑均勻、形態(tài)圓整的海藻酸鈣-殼聚糖雙層微囊。(3)三層復合微球制備將上述雙層微囊以1％～1.5％(w/w)濃度分散至3.5～4.0g二氯甲烷中，探頭式超聲儀50～200w，10～40秒超聲，再稱取乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)、消旋PLGA(DL-PLGA)及左旋PLA(L-PLA)(按40∶54∶6比例)共1g加入上述混懸液中，渦旋使溶解作為油相，另配制0.1％～0.5％羧甲基纖維素鈉溶液5～10ml作為水相，將油相加至水相，1200～2000rpm攪拌下乳勻3～5分鐘，隨后，將其逐滴加入50～200ml，0.5％～1％聚乙烯醇(PVA)溶液中，500～600rpm下乳勻1～2分鐘后提高轉(zhuǎn)速至800～2000rpm繼續(xù)攪拌1～3分鐘，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去二氯甲烷，離心收集復合微球，蒸餾水洗滌后冷凍干燥即得三重復合微球。4.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的三重復合微球制備方法，其特征是第三步三層復合微球的制備也可將海藻酸鈣-殼聚糖雙層微囊以≤1.2％(w/v)濃度分散至乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)的乙腈溶液中(微囊∶PLGA＝1∶4～1∶10)，探頭式超聲儀50～200w，5～30秒超聲后作為混懸水相，司盤80按4％～8％(w/v)溶于花生油作為油相，油相在500～600rpm攪拌下緩慢滴入上述混懸液，隨后，提高轉(zhuǎn)速至800～2000rpm并繼續(xù)攪拌1～2分鐘，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙腈，離心收集復合微球，石油醚洗滌后37℃揮干或真空干燥即得三重復合微球。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三重復合微球制劑，其特征是模型藥物主要包括多肽類、蛋白類藥物。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是第二乳化劑用量為第一乳化劑用量的15％～49％，第一乳化劑優(yōu)選司盤80，第二乳化劑優(yōu)選吐溫80。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是海藻酸鈣-殼聚糖微囊的粒徑為1～5μm，三重復合微球粒徑為20μm～50μm。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三重復合微球制備方法，其特征是所用的PLGA，其PLA與PGA的比為50～100∶50～0。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重復合微球制劑，其特征是制劑形式包括注射劑型和口服劑型。全文摘要本發(fā)明提供的一種三重復合微球制劑及其制備方法，制劑的主要組成為有模型藥物、海藻酸鈣、殼聚糖、乙交酯丙交酯共聚物，制備方法是采用W/O乳化、異丙醇洗滌制備小粒徑海藻酸鈣微囊，并以殼聚糖進一步包裹海藻酸鈣微囊，形成結(jié)構(gòu)更為致密的海藻酸－殼聚糖雙層微囊，再采用乳化－溶劑揮發(fā)法將海藻酸－殼聚糖雙層微囊包裹入乙交酯丙交酯共聚物內(nèi)形成三層復合微球。本發(fā)明提供的復合微球可使蛋白類及多肽類藥物在親水性的海藻酸鈉－殼聚糖微囊環(huán)境中得到很好的保護并明顯減少突釋現(xiàn)象，減少不完全釋放，可達到藥物長時間的釋放，并可通過改變PLGA組成調(diào)節(jié)藥物的釋放模式。本發(fā)明的三層復合微球制劑的制劑形式包括注射劑型和口服劑型。文檔編號A61K9/62GK1557283SQ20041001606公開日2004年12月29日申請日期2004年1月18日優(yōu)先權(quán)日2004年1月18日發(fā)明者梁文權(quán),鄭彩虹申請人:浙江大學