專利名稱：Sars冠狀病毒全病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子流行病學(xué)領(lǐng)域，具體是針對嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒的疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
2003年我國和世界上許多國家遭到了一次大規(guī)模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵襲，由非典型肺炎引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已經(jīng)在22個國家和地區(qū)發(fā)生。世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organization，WHO)在疫情發(fā)生后迅速建立起由全球10個國家的13個實驗室組成的協(xié)作研究和監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。4月16日，WHO正式確認(rèn)SARS的病原體是一種新型冠狀病毒，這是一種單鏈RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些發(fā)病區(qū)其死亡率達到15％，給人民群眾帶來了極大的恐慌。醫(yī)務(wù)工作者和生物學(xué)領(lǐng)域的研究人員及時開展SARS冠狀病毒的病原學(xué)以及預(yù)防、診斷和治療的研究，并且對于該病毒的變異過程和各階段的毒性和傳染力的特點都有了一定的了解。但是目前對于SARS病毒疫苗的工作仍然沒有顯著的進展。
目前報道的疫苗候選株，一般都是來自于SARS危重病人的毒株。由于SARS病毒的危險性強，實驗條件要求高，以及在人身上實驗的困難，SARS病毒的疫苗很難研究開發(fā)。
雖然還有人開發(fā)預(yù)防和治療SARS的DNA疫苗和基因工程亞單位疫苗，但是歷史經(jīng)驗表明，只要安全性得以保證，全病毒疫苗一直是一種非常有效的疫苗。因此開發(fā)全病毒疫苗一直是抗SARS疫苗的研究重點。
然而，人們在體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，流行病中晚期的SARS病毒較容易在體外培養(yǎng)從而獲得病毒顆粒，而來自于果子貍的SARS病毒顆粒較難在體外培養(yǎng)，因此在制備滅活疫苗和減毒疫苗時，大多采用中晚期的SARS病毒株。
目前已經(jīng)嘗試的用于制備疫苗的SARS病毒株包括BJ-01，02和03(GenBank登錄號AY278488、AY278487和AY278490)。國外可能正在嘗試的是與TOR2(GenBank登錄號AY27419)同類的毒株。由于這些病毒都是中晚期的SARS病毒，毒性強，傳染能力強，具有非常高的危險性。而且由于實驗動物猴子本身對SARS病毒并不敏感，雖然疫苗在猴體內(nèi)產(chǎn)生的反應(yīng)很小，但不等于對中晚期SARS全病毒疫苗的安全性進行了有效的驗證。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能夠既可有效產(chǎn)生抗SARS病毒免疫力，又具有安全性的疫苗，尤其是全病毒疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種既可有效產(chǎn)生抗SARS病毒免疫力，又具有安全性的SARS全病毒疫苗。
因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了一種疫苗組合物，其特征在于，該疫苗組合物含有早期SARS病毒的全病毒顆粒和生理學(xué)上可接受的載體。
在該方面的一個優(yōu)選例中，該SARS病毒的核苷酸序列中具有至少一個選自下組的核苷酸減毒變異SEQ ID NO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其組合。
在該方面的另一個優(yōu)選例中，該SARS病毒的蛋白具有氨基酸突變，所述的氨基酸突變對應(yīng)于的選自下組的核苷酸減毒變異SEQ ID NO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其組合。
在該方面的另一個優(yōu)選例中，該SARS病毒是GZ-02病毒株，具有GenBank登錄號為AY390556的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，該SARS病毒是滅活的。
在本發(fā)明的還有一個優(yōu)選例中，該疫苗組合物所含的生物學(xué)上可接受的載體是佐劑。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了上述疫苗組合物用于制備抗SARS的抗體的用途。
在本發(fā)明的還有一個方面，提供了上述疫苗組合物用于制備預(yù)防SARS病毒感染的藥物的用途


圖1描述了60種SARS冠狀病毒基因組序列的鄰近關(guān)系，顯示了各病毒株的變異來源的樹狀圖。從下至上為早期、中期、晚期的變異。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，雖然中晚期的SARS易于培養(yǎng)從而便于獲得大量病毒顆粒，但是其毒性太強，傳染能力強，具有非常高的危險性，因此安全性難以得到保障。相反，果子貍SARS病毒雖然體外培養(yǎng)較為困難，但是由于毒性較低，傳染能力較低，因此預(yù)期安全性好。人類早期SARS病毒，可以體外培養(yǎng)，但是，毒性和傳染力較弱，因此，是疫苗的較好的候選毒株。此外，研究還證實了，早期SARS全病毒足以產(chǎn)生抗早、中、晚等各個時期的SARS的免疫力，因此用早期SARS病毒制得的全病毒疫苗具有非常好的安全性和保護性免疫力。
本發(fā)明中使用的具有減毒突變的SARS病毒(GZ02)序列(Genbank的登錄號AY390556)是申請人從廣州分離到的SARS病毒早期病毒株，其基因序列保藏在GenBank，具有登錄號AY390556。與加拿大分離到的SARS病毒株TOR2的基因序列(Genbank的登錄號AY274119)相比，具有一系列突變差異，可能與毒性或傳染力相關(guān)，特別是選自9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其組合的減毒突變。
從流行病學(xué)分析可見，該突變屬于SARS早期的突變，在原始的果子貍序列(SZ16，GenBank登錄號AY304488)以及早期病人(GZ02，AY390556)分離到的病毒序列中都具有這些突變。根據(jù)臨床觀察，GZ02這種早期的SARS病毒在人體內(nèi)毒性小，感染力弱。雖然該GZ02株分離得自一位老年患者的尸檢材料，但是，其他早期病人均具有同類的突變，且病情較弱。這表明，用早期病毒進行免疫，會比現(xiàn)在使用的中晚期病毒具有更好的保護性免疫力和更低的毒性。
在本發(fā)明之前，有三個依據(jù)說明本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的是中晚期病毒制備疫苗。首先，從流行病史和地域上可見，該地域在SARS傳播的路線上已經(jīng)屬于中晚期，因此，這些地區(qū)的研究人員所能夠獲得的SARS病毒的來源是有限的，鑒于運輸上的危險性，以及當(dāng)時并未確定SARS病毒的臨床基因變異，這些地域的研究人員只能用當(dāng)?shù)厥占牟《具M行研究。圖1是SARS病毒各病毒株變異的樹狀圖，其中可見中晚期的病毒與早期病毒相比經(jīng)過了多次變異。而且，其中的基因序列也有了很大的不同，下文的表1顯示了幾種有代表性的SARS病毒核苷酸序列上幾個主要位點的變化。
表1 SARS病毒單核苷酸變異的重要位點

其次，如發(fā)明背景中所述，中期和晚期的病毒由于感染效力強，在Vero細胞內(nèi)復(fù)制增殖的能力強，因此易于培養(yǎng)。雖然在研究中具有一定的危險性，這依然是最快獲得大量病毒顆粒的有效途徑。
第三，果子貍和早期的病毒由于感染能力弱，難于培養(yǎng)，因此收集困難。使得研究人員暫時不考慮用其制備疫苗。
本發(fā)明的發(fā)明人通過對中國SARS流行病學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)早期病人的SARS病毒分離株與果子貍的冠狀病毒非常相似，而且通過培養(yǎng)收集了足以制備疫苗的病毒株，克服了原始的果子貍冠狀病毒在目前尚不能培養(yǎng)的困難。將這些減毒的病毒(對于中晚期的SARS病毒來說，該病毒已經(jīng)屬于減毒形式)制備成疫苗，或優(yōu)選使用其滅活形式制備疫苗，用于免疫動物，產(chǎn)生抗血清。這些抗血清能夠和中晚期的SARS病毒結(jié)合產(chǎn)生中和反應(yīng)，說明產(chǎn)生了保護性免疫力。
與感染人和動物宿主的中晚期病毒，例如TOR2和BJ01相比，本發(fā)明的早期GZ02減毒病毒表現(xiàn)出毒力顯著減弱。減毒程度達到在大多數(shù)接受免疫的個體中僅出現(xiàn)輕微的感染癥狀，傳染性非常小并能引發(fā)所需的免疫應(yīng)答類型。
可用該SARS病毒來配制疫苗。為此，將減毒病毒調(diào)節(jié)到合適的濃度并用合適的疫苗佐劑、稀釋劑或載體配制?？蓪⑸韺W(xué)上可接受的介質(zhì)用作載體。它們包括但不限于合適的等滲液、磷酸鹽緩沖液等等。
佐劑可用多種方法分類(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。廣義而言有兩大類，顆粒狀或非顆粒狀佐劑。在顆粒狀佐劑中有鋁鹽、鈣鹽、油包水乳液、水包油乳液、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)和ISCOM基質(zhì)、脂質(zhì)體、納米和微米顆粒、蛋白質(zhì)體、病毒顆粒、硬酯酰酪氨酸和-菊粉。非顆粒佐劑包括胞壁酰二肽(MDP)和衍生物(如蘇氨酰MDP、胞壁肽等)、非離子嵌段共聚物、皂苷(如Quil A和QS21)、脂類A或其衍生物4′一磷酯酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖脂(TDM)、各種細胞因子(包括γ-干擾素和白細胞介素2或4)、糖類聚合物、衍生的多糖(如二乙基氨基乙基葡萄糖)等。現(xiàn)代佐劑制劑常常設(shè)計成各種成分的組合以產(chǎn)生最大的特異性免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使用減毒病毒或滅活疫苗制備疫苗組合物。減毒病毒可與冷凍防護添加劑或穩(wěn)定劑混合，例如蛋白質(zhì)(如白蛋白、明膠)、糖(如蔗糖、乳糖、山梨糖醇)、氨基酸(如谷氨酸鈉)、鹽水或其它保護劑。將這種混合物維持在液體狀態(tài)，或然后干燥或凍干以便運輸和保存，在使用前再臨時與水混合。
包含本發(fā)明減毒病毒的制劑可以用來免疫人或動物，以誘導(dǎo)抵抗減毒病毒的相應(yīng)野生型病毒感染的保護力。
為了激發(fā)免疫應(yīng)答，必須給予個體以合適次數(shù)的足量疫苗。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能容易地確定該用量和劑次。給藥可以通過任一常規(guī)有效方式，例如皮下注射，鼻內(nèi)、腸胃外、經(jīng)口或局部施用于粘膜表面，例如通過氣溶膠噴霧。較佳的給藥方式是腸胃外給藥。
在優(yōu)選例中，可對早期SARS病毒進行進一步滅活后，制備滅活疫苗。目前對病毒滅活的方法有輻照、臭氧、甲醛滅活，高溫滅活等。這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
此外，本發(fā)明還提供了用早期SARS全病毒制備抗SARS的抗體的方法。例如，可以用SARS全病毒免疫動物，然后獲得抗血清。此外，還可將免疫動物的(如猴)的脾細胞與其它細胞融合，形成雜交瘤，從而制備SARS病毒的單克隆抗體。
為使更好地理解本發(fā)明，給出以下實施例。實施例只是為了描述本發(fā)明，不能將其理解成限制本發(fā)明的范圍。
實施例標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)按照Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryMannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989使用。
實施例1用SARS早期病毒制備疫苗本實施例使用的SARS早期病毒為GZ-02病毒株，其序列保藏在GenBank，登錄號為AY39556。該病毒株購自中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)。
該病毒株與TOR2相比，其核苷酸序列主要具有六個減毒突變9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C。
在臨床上，感染該病毒株的病人表現(xiàn)癥狀輕微。同時，傳染力低。因此，該病毒具有作為減毒疫苗的良好特性。
將該病毒株在Vero中培養(yǎng)，取上清液，通過免疫親和層析技術(shù)獲得純化的病毒。將其與常規(guī)的佐劑配制成疫苗。
實施例2用SARS早期病毒疫苗免疫動物的評價按照常規(guī)免疫方法用實施例1制備的疫苗免疫了恒河猴。
實驗所采用的動物是恒河猴，恒河猴實驗在哈爾濱畜牧獸醫(yī)研究所進行。
將實施例1配制的疫苗靜脈注射到恒河猴體內(nèi)，注射次數(shù)和劑量由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照常規(guī)而定。免疫過程中，恒河猴沒有明顯的病毒攻擊癥狀，如發(fā)熱、肺部感染、咳嗽等癥狀。免疫結(jié)束后，對每只恒河猴取血，血清分析抗體應(yīng)答。用中晚期的病毒顆粒，例如TOR2和BJ-01病毒(購自中國疾病預(yù)防控制中心)作為包被抗原，以間接ELISA試驗檢測了能與它們結(jié)合的抗體。用蝕斑減少中和試驗(PRNT)測試了中和抗體，測定與對照相比，導(dǎo)致蝕斑數(shù)量至少減少80％時的最高血清稀釋度。
ELISA實驗的結(jié)果表明，用GZ-02全病毒產(chǎn)生的抗血清能夠和中晚期的TOR2和BJ-01病毒的S蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合。
蝕斑減少中和試驗表明，大量的SARS中晚期病毒被中和?？寡逯锌筍ARS病毒抗體的滴度非常高。
用TOR2和BJ-01病毒攻擊經(jīng)免疫后的恒河猴，均無SARS感染癥狀。X光片檢測未檢測出肺部感染，基本上無發(fā)熱、咳嗽癥狀。
從上述試驗可見，用早期SARS病毒免疫恒河猴具有良好的免疫原性和安全性，能夠產(chǎn)生高保護性免疫應(yīng)答。
還用試驗用果子貍進行了相同的實驗，實驗用果子貍也來自哈爾濱畜牧獸醫(yī)研究所。獲得了相同的實驗結(jié)果。
因此，我們認(rèn)為，用早期SARS病毒能夠產(chǎn)生良好的免疫原性和安全性，以及高保護性免疫應(yīng)答，有良好的應(yīng)用前景。
序列表<110>國家人類基因組南方研究中心廣東省疾病預(yù)防控制中心<120>SARS冠狀病毒全病毒疫苗<130>040486<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29751<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>1atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac120gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct180tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc240gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca300cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg360gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt420ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa480cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg540gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc600gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt660ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat720cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa780ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc840ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg900tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt960gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag 1020acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag 1080tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag 1140actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt 1200aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag 1260acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa 1320ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc 1380tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac 1440attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc 1500tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc 1560tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag 1620atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag 1680gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag 1740agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc 1800aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca 1860ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt 1920gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt 1980atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc 2040aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg 2100ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag 2160gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc 2220attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag 2280gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa 2340gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa 2400
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1.一種疫苗組合物，其特征在于，該疫苗組合物含有早期SARS病毒的全病毒顆粒和生理學(xué)上可接受的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的SARS病毒的核苷酸序列中具有至少一個選自下組的核苷酸減毒變異SEQ ID NO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其組合。
3.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的SARS病毒的蛋白具有氨基酸突變，所述的氨基酸突變對應(yīng)于的選自下組的核苷酸減毒變異SEQ IDNO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其組合。
4.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述SARS病毒是GZ-02病毒株，具有GenBank登錄號為AY390556的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的SARS病毒是滅活的。
6.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述生物學(xué)上可接受的載體是佐劑。
7.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物的用途，其特征在于，該疫苗組合物用于制備抗SARS的抗體。
8.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物的用途，其特征在于，該疫苗組合物用于制備預(yù)防SARS病毒感染的藥物。
全文摘要
公開了一種疫苗組合物，該疫苗組合物含有早期SARS病毒的全病毒顆粒和生理學(xué)上可接受的載體；以及該疫苗組合物用于制備抗SARS的抗體和預(yù)防SARS病毒感染的藥物的用途。
文檔編號A61P11/00GK1647823SQ20041001606
公開日2005年8月3日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月29日
發(fā)明者趙國屏, 林錦炎, 宋懷東, 鄭煥英, 王升躍, 何劍峰, 任雙喜, 鄢心革, 李亦學(xué), 萬卓越, 孔祥銀, 許銳恒, 郝沛, 吳新偉, 顧伯偉, 侯金林, 陳竺, 閔軍, 繆有剛, 徐軍, 傅剛, 陸家海, 張樹義, 王小寧 申請人:國家人類基因組南方研究中心, 廣東省疾病預(yù)防控制中心