專利名稱：水溶性粘結(jié)劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及材料領域，更具體地涉及可用于制備組織工程三維支架的水溶性粘結(jié)劑及其用途。
背景技術：
生物可降解細胞支架材料是組織工程研究的重要領域之一[Grande D.A，evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts，JBiomed Mater Res，1997，34211]，是組織工程的重要組成部分。作為種植細胞的生物可降解三維細胞支架，是對于細胞外基質(zhì)的仿生，是保證組織工程化組織形成的前提。
組織工程用細胞支架除了必須具有生物可降解性和生物相容性外，支架的物理性質(zhì)也非常重要，如支架必須具有足夠大的表面積，以利于細胞的粘附、分化和增殖；具有足夠大的孔隙，以利于細胞的遷移；具有良好的孔隙間連通性，以利于營養(yǎng)物的進入和細胞分泌的廢物擴散排出；具有足夠的體積，以利于將來臨床修復組織或器官的缺損。然而支架的物理性質(zhì)與制備支架的技術密切相關[Mikos，A G.，Bao，Y.，Cima，L G.，Ingber D E，Vacati，J P，and Langer，R，Preparation of Poly(glycolic acid)bonded fiber structures for cell attachment andtransplantation.J Biomed Mat Res，1993，27183-189；Mikos，A G.，Thorsen，A J，Czerwonka，L A，Bao，Y.，Langer，R，Winslow，D N，and Vacati，J P，Preparationand characterization of poly(L-lactic acid)foams，Polymer，1994，351068-1077；Mooney，D J，Baldwin，D F，Suh，N P，Vacanti，J P，and Langer，R，Noval approachto fabricate porous sponges of poly(D，L-lcatic-co-glycolic acid)without the use oforganic solvents，Biomaterials，1996，171417-1422；Nam，Y S，and Park，T G，Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phaseseparation，J Biomed Mat Res，1999，478-17；Nam Y S，Yoon J J and Park T G，A novel fabrication method of macroporous biodegradable polymer scaffolds usinggas foaming salt as a porogen additive，J Biomed Mat Res(AppliedBiomaterials)，2000，531-7]。
常用的三維細胞支架制備方法包括(a)纖維粘結(jié)法這是最早使用的一種方法，利用熱處理或溶液粘結(jié)無紡纖維網(wǎng)狀物形成三維多孔支架[Mikos，A G.，Bao，Y.，Cima，L G.，Ingber D E，Vacati，J P，and Langer，R，Preparation of Poly(glycolic acid)bonded fiberstructures for cell attachment and transplantation.J Biomed Mat Res，1993，27183-189；Freed，L E，Marquis，J C，Nohria A，Emmanual，J，Mikos，A G andLanger R，Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured onsynthetic biodegradable polymers，J Biomed Mat Res，1993，2711-23；Mooney D J，Mazzoni C L，Breuer C，McNamara，K，Hem D and Vacanti J P，Stablizedpolyglycolic acid fiber-based tubes for tissue engineering，Biomaterials，1996，17115-124]。該支架的孔隙率可高達81％，孔徑達到500μm，孔隙間連通性良好，但是機械強度低、孔隙形態(tài)難控制而限制了其應用范圍。
(b)溶液澆鑄/顆粒瀝取法將聚合物溶液與NaCl等水溶性致孔劑顆?；旌虾螅瑵茶T于模具中，待有機溶劑揮發(fā)后，用水溶解出聚合物/顆粒復合物中的顆粒，即可獲得多孔聚合物支架[Mikos A G，Sarakinos G，Vacanti J P，Langer R S，Cima L G，US5514378；Levene H B，Lhommeau C M，Kohn J B，US6103255；Mikos A G，Sarakinos，G，Leite S M，Vacanti J P，and Langer R，Laminated three-dimensional biodegradable foams for use in tissueengineering，biomaterials，1993，14323-330；Mikos，A G.，Thorsen，A J，Czerwonka，L A，Bao，Y.，Langer，R，Winslow，D N，and Vacati，J P，Preparationand characterization of poly(L-lactic acid)foams，Polymer，1994，351068-1077；]。顆粒瀝取法的優(yōu)點是可以根據(jù)所用鹽粒的顆粒尺寸控制支架的孔隙大小，但是孔隙之間的連通性較差、鹽會保留在支架中、孔隙的形態(tài)粗糙，不利于細胞的生長。
(c)氣體發(fā)泡技術利用高壓二氧化碳發(fā)泡技術[Mooney，D J，Baldwin，D F，Suh，N P，Vacanti，J P，and Langer，R，Noval approach to fabricate porous spongesof poly(D，L-lcatic-co-glycolic acid)without the use of organic solvents，Biomaterials，1996，171417-1422；]和氣體致孔劑技術[伊準鎮(zhèn)，樸泰寬，CN1297042A；Nam Y S，YoonJ J and Park T G，A novel fabrication method ofmacroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt as a porogenadditive，J Biomed Mat Res(Applied Biomaterials)，2000，531-7]，該方法能制備出大體積的多孔支架，孔隙率高達90％以上。其中，高壓二氧化碳發(fā)泡技術獲得的孔徑為100μm以下，但是大多數(shù)孔隙不連通；氣體致孔劑技術獲得的孔徑為200-500μm，具有較高的孔隙間連通性，但是，封閉孔隙中的致孔劑不能完全去除，不能控制孔隙間連通通道形態(tài)和尺寸。
(d)液-液相分離技術。利用熱動力學原理，在聚合物溶液中形成聚合物富相和貧相，通過升華等方式去掉聚合物貧相后，即可獲得多孔的聚合物支架[LoH，Kadiyala，S，Guggino S E，and Leong K W，Poly(L-lactic acid)foams with cellseeding and controlled-release capacity，J Biomed Mat Res，1996，30475-484；LoH，Ponticiello M S，and Leong K W，fabrication of controlled releasebiodegradable foams by phase separation，Tissue Engineering，1995，115-28；Schugens C，Maquet V，Grandfils C，Jerome R and Teyssie P，Polylactidemacroporous biodegradable implants for cell transplantation II Preparation ofpolylactide foams for liquid-liquid phase separation，J Biomed Mat Res1996，30449-461；Nam Y S and Park T G，Biodegradable polymeric microcellularfoams by modified thermally induced phase separation method，Biomaterials，1999，201783-1790；Nam Y S and Park T G，Porous biodegradablepolymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation，J Biomed MatRes 1999，478-17]獲得的支架孔隙率高達90％，但是孔徑在100μm以下，并且孔隙形態(tài)、孔徑分布、連通性與聚合物濃度、冷凍速度和方式、溶劑/非溶劑比例以及表面活性劑存在與否有關，孔隙間的連通性不夠，孔隙形態(tài)和結(jié)構難以控制。
(e)快速成型技術快速成型技術是一種非常有前途的技術，可以加工內(nèi)部結(jié)構十分復雜的制件，有著其它傳統(tǒng)工藝不可比擬的優(yōu)勢[Vozzi G，Previti A，De Rossi D，and Ahluwalia A.Microsyring-Based deposition of two-dimensionaland three-dimensional polymer scaffolds with well-defined geometry forapplication to tissue engineering.Tissue Engineering，8(6)1089-1098，2002]，但是，快速成型技術在組織工程細胞支架制備方面尚存在一定的缺陷[Yang S，Leong K F，Du Z，Chua C K.The design of scaffolds for use in tissue engineering.Part 2，Rapid prototyping techniques.Tissue Engineering，8(1)1-11，2002]，如1)每一類快速成型技術都是基于所加工的材料的特殊性質(zhì)，沒有通用性；2)現(xiàn)有的商業(yè)化快速成型設備不能加工組織工程需要的生物可降解和生物相容性材料；3)加工過程可能導致組織工程常用材料的降解；4)尚不能滿足組織工程要求三維支架既具有足夠大體積，有具有精確的微觀結(jié)構。
上述各方法中，溶液澆鑄/顆粒瀝取法是最簡便和研究最廣泛的技術之一。經(jīng)典的制備過程是通過篩分獲得需要尺寸(氯化鈉、糖類晶體等不溶于有機溶劑)的致孔劑顆粒；將致孔劑顆粒均勻地分散在PLLA的氯仿溶液中，然后澆鑄在適當?shù)哪＞咧?，待大量氯仿?lián)]發(fā)后，真空干燥去除混合物中的殘余溶劑，即可獲得干燥的PLLA/致孔劑復合物。用去離子水浸出復合物中的水溶性致孔劑，真空干燥后，即可獲得不同PLLA多孔細胞支架。用該技術可以制備出孔隙率高達93％，孔隙相互通透的多孔膜。其孔隙率可以通過致孔劑與聚合物溶液的比例調(diào)節(jié)，而孔隙的大小由致孔劑的幾何尺寸控制，比表面積由膜的孔隙率和致孔劑的幾何尺寸調(diào)節(jié)。經(jīng)典的溶液澆鑄/粒子瀝濾技術也有明顯的不足，如不能直接制備出多孔大體積三維細胞支架(只能制備出厚度不超過2mm的多孔膜)；孔隙為粗糙的立方體狀；孔隙間的相互連通程度不高，并且連通通道大小和形態(tài)不規(guī)則、不可控制；有機溶劑殘余可能影響細胞的生長。
為了制備出孔隙相互連通的大體積三維細胞支架，各國科學家對溶液澆鑄/粒子瀝濾技術作了大量的改進，開發(fā)出溶劑澆鑄/粒子瀝濾改進技術。早期，有人利用多層多孔膜重疊大體積三維細胞支架[Mikos A G，Sarakinos G，Leite SM，Vacanti J P，and Langer R.Laminated three-dimensional biodegradable foamsfor use in tissue engineering.Biomaterials，14323-330，1993；Mooney D J，Kaufmann P M，Sano K，et al.Transplantation of hepatocytes using porousbiodegradable sponges.Transplant Proc，26，3425-3426，1994]，膜與膜之間的粘結(jié)區(qū)與膜內(nèi)部結(jié)構有顯著差異，且根本無法保證孔隙間的連通性。Shastri等人[Shastri V P，Martin I and Langer R.Macroporous polymer foams by hydrocarbontemplating.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，97(5)1970-1975，2000]則利用固態(tài)烴類致孔劑與PLLA或PLGA的溶液(二氯甲烷或三氯甲烷溶液)制備成均勻的混合物，利用正戊烷或正己烷等有機溶劑(能夠與二氯甲烷或三氯甲烷混溶，而不溶解PLLA或PLGA)浸溶出固態(tài)烴類致孔劑，同時使混合物中的PLLA或PLGA沉積固化，形成厚度可達2.5cm多孔三維支架。但是，實驗中很難保證將烴類致孔劑從支架中完全去除，也很難保證所有孔隙有適當?shù)倪B通通道。
此外，還有一些改進方法，例如，溶劑混合/粒子瀝濾技術[Liao C J，ChenJ H，Chiang S F，et al.Fabrication of porous biodegradable polymer scaffoldsusing a solvent merging/particulate leaching method.J Biomed Mater Res，59(4)676-81，2002]、相分離技術結(jié)合溶劑澆鑄/粒子瀝濾技術[Levene H B，Lhommeau C M，Kohn J B.Porous polymer scaffolds for tissue engineering.US6103255，2000；Chen G，Ushida T，Tateishi T.Preparation of and poly(DL-lactic-co-glycolic acid)foams by use ice microparticulates.Biomaterials，22(18)2563-7，2001；De Groot J H，Zijlstra F M，Kuipers H W，et al.Meniscaltissue regeneration in porous 50/50 copoly(L-lactic/ε-caprolactone)implants.Biomaterials，18613-622，1997]、溶劑澆鑄/粒子瀝濾結(jié)合氣體發(fā)泡技術[Nam YS，Yoon J J，Park T G. A novel fabrication method of macroporous biodegradablrpolymer scaffolds using gas foaming salt as a porogen additive.J Biomed MaterRes，531-7，2000；尹準鎮(zhèn)，樸泰寬。生物相容的支架的制備方法及由該方法制備的支架。CN1297042A，2001]。但是，這類方法的共同缺點是三維支架的孔隙間不完全連通、致孔劑不能夠完全被去除，以及三維支架結(jié)構的均勻性差，更無法控制連通通道的形態(tài)和大小。
研究孔隙間連通尺寸可控的全連通多孔細胞支架制備技術，為細胞提供適當?shù)倪w移和營養(yǎng)成分以及分泌物傳遞空間，是組織工程用三維細胞支架制備技術的又一難題。有人[Ma P X，Choi J W.Biodegradable polymer scaffolds withwell-defined interconnected spherical pore network.Tissue Engineering，7(1)23-33，2001，Ma，Peter X.Reverse fabrication of porous materials，United States Patent，Application number20020005600]利用石蠟微球致孔劑的熱粘結(jié)性質(zhì)，在33-34℃的烘箱中，將石蠟微球粘結(jié)成型，澆鑄PLLA的吡啶溶液，真空干燥后，用環(huán)己烷和正己烷浸取出石蠟，獲得空隙率高達96％、孔隙間相互連通、且連通通道尺寸可人為控制的三維支架。但是，石蠟顆粒為非水溶性致孔劑，限制了高聚物的溶劑選擇范圍，而且實驗中采用了氣味讓人難以接受的吡啶作為高聚物的溶劑。吸潮性鹽類在高濕度下溶解，造成支架孔隙直徑在空間分布不均勻。另一方面，熱熔粘結(jié)方法中存在溫度梯度、吸潮粘結(jié)方法中存在濕度梯度，兩者均會使致孔劑粘結(jié)程度在空間分布上的不均勻，即支架孔隙的連同通道尺寸在空間分布不均勻；當制備的三維支架體積增大時，支架內(nèi)部結(jié)構不均勻性尤為突出。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的致孔劑粘結(jié)劑，以及支架制備方法，以便制備出孔隙間完全連通的，內(nèi)部結(jié)構均勻、可控的大體積三維細胞支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種致孔劑粘結(jié)劑，該粘結(jié)劑用于制備孔隙間完全連通的、內(nèi)部結(jié)構均勻的、可控的大體積三維細胞支架。
本發(fā)明的另一目的是提供所述粘結(jié)劑和三維支架的制備方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種一種用于制備組織工程三維支架的粘結(jié)劑，它含有水和溶解于水的以下成分(a)5-600克/升(較佳地10-500克/升)粘結(jié)成分，所述的粘結(jié)成分選自下組明膠、糊精、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、或其組合；(b)飽和濃度的致孔劑保護成分，所述的致孔劑保護成分選自下組氯酸鈉、氯酸鉀、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀(c)飽和濃度的膠體破壞成分，所述的膠體破壞成分選自下組氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、硝酸鉀、氯酸鈉、或其組合。
在另一優(yōu)選例中，粘結(jié)成分是明膠，含量50-600克/升，更佳地為100-500克/升。
在另一優(yōu)選例中，粘結(jié)成分是羧甲基纖維素鈉，含量5-40克/升，更佳地為10-30克/升。
在另一優(yōu)選例中，粘結(jié)成分是糊精，含量50-500克/升，更佳地為100-400克/升。
在另一優(yōu)選例中，致孔劑保護成分是氯酸鈉，而所述的膠體破壞成分是氯酸鈉。
在另一優(yōu)選例中，致孔劑保護成分是丁二酰亞胺，且所述的膠體破壞成分是氯化鈉、氯化鉀、或其組合。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于制備組織工程三維支架的試劑盒，它包含(a)本發(fā)明所述的用于制備組織工程三維支架的粘結(jié)劑；以及(b)選自下組的致孔劑氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物，
附加條件是粘結(jié)劑中的致孔劑保護成分與致孔劑相同。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述的粘結(jié)劑的用途，它被用于制備組織工程三維支架。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種組織工程三維支架的制備方法，包括以下步驟(a)將球形致孔劑顆粒與本發(fā)明所述的粘結(jié)劑混合均勻，形成致孔劑顆粒與粘結(jié)劑的混合物，然后將混合物置于底部有孔的模具中，其中孔徑小于致孔劑顆粒平均直徑，致孔劑成分選自下組氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物，并且粘結(jié)劑中的致孔劑保護成分與致孔劑相同；(b)將盛有混合物的模具，在20-1500g(更佳地100-1500g)離心力作用下，離心去除多余的粘結(jié)劑；(c)干燥離心后的混合物，獲得致孔劑粘結(jié)塊；(d)用溶液澆鑄法將聚合物溶液澆鑄到致孔劑粘結(jié)塊上，所述的聚合物溶液由有機溶劑和溶解于有機溶劑中的聚合物構成，其中所述的聚合物選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內(nèi)酯、聚β-羥基丁酯、聚二氧六環(huán)酮及其組合，然后揮發(fā)去除有機溶劑，形成致孔劑粘結(jié)塊-聚合物構成的復合物；(d)切去復合物表層后，將復合物浸泡于水中，從而溶解去除致孔劑；(e)干燥，獲得結(jié)構可控的大體積三維組織工程支架。
在另一優(yōu)選例中，制得的所述的三維組織工程支架的體積為5立方毫米-500立方厘米，更佳地為10立方毫米-100立方厘米。


圖1是大體積粘結(jié)塊及觀測斷面(粘結(jié)劑40％，離心力161g)。
圖2是各斷面的粘結(jié)情況顯微照片，顯示各斷面粘結(jié)程度均勻(粘結(jié)劑40％，離心力161g)。
圖3顯示了大體積三維細胞支架(粘結(jié)劑40％，離心力161g；12.5％PDLLD溶液澆注三次)。
圖4是三維支架孔隙結(jié)構的顯微照片，顯示了致孔劑的球形孔隙和球形孔隙間的連通性。其中圖4A粘結(jié)劑40％，離心力161g；圖4B粘結(jié)劑40％，離心力40g。
圖5是三維支架孔隙結(jié)構的掃描電鏡照片，顯示了致孔劑的球形孔隙和球形孔隙間的圓形連通通道(粘結(jié)劑20％，離心力161g)。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，開發(fā)了水溶性致孔劑。并針對這些新型的水溶性致孔劑，開發(fā)了新的水溶性粘結(jié)劑。利用本發(fā)明人發(fā)明的水溶性粘結(jié)劑和球形致孔劑，建立了一種制備內(nèi)部孔隙結(jié)構可控的大體積生物可降解組織工程用細胞支架的方法。
球形致孔劑適用于本發(fā)明的致孔劑沒有特別限制，然而優(yōu)選的致孔劑是球形水溶性致孔劑。尤其是發(fā)明名稱為“水溶性球形致孔劑及其制法和用途”，申請?zhí)枮镃N02158989.5，申請日為2002年12月27日的專利申請中所述的球形水溶性致孔劑。這種水溶性球形致孔劑的直徑大小為100-1000微米(較佳地100-600微米)，且由選自下組的組分構成氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物。
通常，球形水溶性致孔劑制備方法包括如下步驟(a)將致孔劑原料加入到分散劑中可用于本發(fā)明的致孔劑原料的選擇標準是致孔劑原料具有結(jié)晶性質(zhì)、良好的水溶性、適當?shù)奈毙?、適當?shù)娜埸c(最好低于260度)、無毒性或低毒性、來源廣泛、成本低廉、不溶于有機溶劑、化學性質(zhì)比較穩(wěn)定。合適的致孔劑原料是選自下組的化合物氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物。致孔劑原料的熔點為T1。
可用于本發(fā)明的分散劑是閃點T2比致孔劑熔點T1高出50-100℃(或更高)的有機溶劑，較佳地T2高于300℃的有機溶劑，代表性的例子包括(但并不限于)甲基硅油、硅油、硅酮。
(b)形成液態(tài)微球通常，將步驟(a)的混合物，在攪拌下加熱至大于T1且小于T2的溫度范圍；例如，當分散劑為甲基硅油，致孔劑原料為氯酸鈉時，加熱至260-270℃，時間約30±10分鐘；當分散劑為甲基硅油，致孔劑原料為丁二酰亞胺時，加熱至130-140℃，時間約20±10分鐘；當分散劑為甲基硅油，致孔劑原料為硫氰酸鉀時，加熱至180-190℃，時間約20±10分鐘。
(c)形成固態(tài)微球在攪拌下，將用冰-水冷卻的分散劑，傾入步驟(b)的液態(tài)微球與分散劑的混合液中，使混合物迅速降溫至T1溫度之下，形成固態(tài)微球；(d)分離獲得球形致孔劑用常規(guī)方法(抽濾等)，分離出步驟(d)的固態(tài)微球，洗滌、干燥后得到球形致孔劑。
(e)篩分不同大小的球形致孔劑用不同孔徑的分樣篩進行篩分，即可獲得不同大小的球形致孔劑。
水溶性粘結(jié)劑本發(fā)明用于制備組織工程三維支架的粘結(jié)劑含有水(或水性溶劑)和溶解于水的以下成分(a)5-600克/升粘結(jié)成分，所述的粘結(jié)成分選自下組明膠、糊精、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、或其組合；(b)飽和濃度的致孔劑保護成分，所述的致孔劑保護成分選自下組氯酸鈉、氯酸鉀、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀；(c)飽和濃度的膠體破壞成分，所述的膠體破壞成分選自下組氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、硝酸鉀、氯酸鈉、或其組合。
就粘合成分而言，其作用是將致孔劑顆粒粘在一起?？梢圆捎贸Ｓ玫囊恍┱辰Y(jié)成分，然而優(yōu)選例子如下粘結(jié)成分是明膠，含量為50-600克/升，更佳地為200-500克/升。
粘結(jié)成分是羧甲基纖維素鈉，含量為5-40克/升，更佳地為1-30克/升。
粘結(jié)成分是糊精，含量為50-500克/升，更佳地為100-400克/升。
通常，致孔劑保護成分與致孔劑的成分相同。
就致孔劑保護成分而言，其通常與致孔劑相同。例如，當致孔劑是氯酸鈉時，致孔劑保護成分也宜是氯酸鈉；當致孔劑是丁二酰亞胺時，致孔劑保護成分也宜是丁二酰亞胺。
就膠體破壞成分而言，其作用是防止粘結(jié)成分形成膠體。強電解質(zhì)諸如氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、硝酸鉀、氯酸鈉等都可用于防止形成膠體。一些優(yōu)選的例子如下(a)當致孔劑保護成分是氯酸鈉，所述的膠體破壞成分是氯酸鈉。(b)當致孔劑保護成分是丁二酰亞胺，且所述的膠體破壞成分是氯化鈉、氯化鉀、或其組合。
水溶性粘結(jié)劑的制備方法很簡便，將致孔劑保護成分和膠體破壞成分溶解于水中，形成飽和溶液，然后將粘合成分溶解于該飽和溶液即可。
三維支架制備本發(fā)明還提供了三維支架制備方法，它包括以下步驟1)水溶性粘結(jié)劑的配制，2)將球形致孔劑顆粒與水溶性粘結(jié)劑混合均勻，并置于底部有微孔的模具中；3)利用離心力，將混合物中多余的粘結(jié)劑從模具底部的微孔中排除，使致孔劑顆粒相互接觸發(fā)生粘結(jié)。離心力大小以可以去除多余粘結(jié)劑為準，通常為20-1500g，更佳地為100-1500g；4)干燥離心后的混合物，獲得致孔劑粘結(jié)塊；5)在一種有機溶劑中溶解一種聚合物以制備聚合物溶液；6)利用溶液澆鑄技術將聚合物溶液澆鑄到粘結(jié)好的致孔劑上，待有機溶劑揮發(fā)后；7)用刀片切去表層后，將其浸泡于去離子水中，待致孔劑完全溶解后，去離子水洗滌、真空干燥即可獲得結(jié)構可控的大體積三維組織工程。
可用于制備組織工程三維支架的生物可降解材料材料沒有特別限制。常用的生物可降解材料包括(但并不限于)聚乳酸(PLLA，PDLLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚β-羥基丁酯、聚二氧六環(huán)酮等。
用于形成的生物可降解材料溶液的溶劑沒有特別限制。代表性的例子包括(但并不限于)二氯甲烷、氯仿、丙酮、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六環(huán)、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮等。
利用本發(fā)明的粘結(jié)劑和離心粘結(jié)方法，獲得的大體積致孔劑粘結(jié)塊，具有粘結(jié)時間短、粘結(jié)程度均勻、粘結(jié)強度高、容易獲得大體積粘結(jié)塊的優(yōu)良性能；并且粘結(jié)程度隨離心力增大而降低，隨粘結(jié)劑濃度的升高而增大，即具有粘結(jié)程度可控的性質(zhì)。應用該致孔劑粘結(jié)塊制備的三維細胞支架，具有孔隙完全連通、結(jié)構均勻的特點；其孔徑由致孔劑直徑?jīng)Q定，孔隙間連通通道大小由粘結(jié)塊的粘結(jié)程度決定。如直徑為450-600μm的致孔劑，粘結(jié)劑濃度為20％，161g離心力作用下，其粘結(jié)直徑為上表面151.51±28.09(45)，中央155.08±30.26(42)，下表面152.77±26.06(87)；粘結(jié)劑濃度為40％，161g離心力作用下，粘結(jié)直徑為上表面176.93±27.16(66)，中央177.24±34.52(82)，下表面181.00±32.17(174)；粘結(jié)劑濃度為40％，1449g離心力作用下，粘結(jié)直徑為上表面130.38±31.19(47)，中央130.73±17.77(37)，下表面128.68±27.41(51)。因此，本發(fā)明涉及的水溶性粘結(jié)劑和離心粘結(jié)技術，是制備內(nèi)部結(jié)構可控的大體積細胞支架的優(yōu)良技術之一。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1實驗材料與方法一、主要實驗試劑1.甲基硅油(methyl siloxane fluid)，H-201，杭州師范學院附屬廠2.乙醚(diethyl ether)AR中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司3.氯酸鈉(sodium chlorate)AR中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司4.三氯甲烷(chloroform)AR中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司5.氯化鈉(sodium chloride)6.明膠(gelatin)Sigma公司7.聚乳酸(poly(D，L-lactide))(PDLA)Sigma公司(重均分子量90,000-120,000)二、主要儀器設備1.DW-2型多功能電動攪拌器，河南省鞏義市英峪豫華儀器廠2.真空干燥箱DZF-6000型，上海一恒科技有限公司3.顯微鏡Nikon ECLIPSE E600W，JAPAN4.XZ型旋片式真空泵，河南省鞏義市宏達精密儀器廠
5.分樣篩浙江上虞市華美儀器紗篩廠6.電子天平PB303-S型，METTLER TOLDO，瑞士7.離心機ALC，PK110，ALC international srl，EC制造8.掃描電子顯微鏡scanning electron microscope，hitachi s-520，日本9.純水裝置Millipore，milli-Q型，法國實驗方法一、球形致孔劑的制備利用[CN02158989.5]中所述的方法制備致孔劑，即在攪拌下，將少量氯酸鈉置于硅油中，攪拌下，慢慢加熱甲基硅油，使氯酸鈉呈液態(tài)微球；維持攪拌速度不變情況下，傾入大量冷硅油使球形氯酸鈉凝固，過濾、洗滌、篩分，即可獲得球形致孔劑。
二、致孔劑的粘結(jié)1.粘結(jié)劑的配制在去離子水中加入過量的膠體破壞成分，如強電解質(zhì)氯化鈉(用氯酸鈉為致孔劑時，不需要氯化鈉)，制備常溫飽和電解質(zhì)溶液；再用致孔劑保護成分(致孔劑原料)飽和此電解質(zhì)飽和溶液；最后，應用此飽和溶液溶解明膠形成不同濃度的粘結(jié)劑溶液。
2.致孔劑的粘結(jié)以致孔劑/粘結(jié)劑為2∶1(體積/體積)，將球形致孔劑與粘結(jié)劑混合均勻，將混合物置于底部有微孔的模具中，常溫下，在不同的離心力下離心10分鐘后，在干燥器內(nèi)常溫充分干燥，待用。
三、大體積三維細胞支架制備1.PDLA溶液配制(如12.5％的三氯甲烷溶液)取2.50g PDLA置于磨口三角瓶內(nèi)，用移液管加入20ml三氯甲烷，蓋好磨口玻璃塞，室穩(wěn)下靜置溶解即可。
2.三維支架制備用滴管吸取PDLA的三氯甲烷溶液，逐滴滴加到致孔劑粘結(jié)塊上，至溶液剛好超過致孔劑表面，干燥12小時后，再次滴加PDLA的三氯甲烷溶液，共滴加三次。待三氯甲烷揮發(fā)完全后，置于真空干燥箱內(nèi)充分干燥；從模具中取出澆鑄了PDLA的致孔劑粘結(jié)塊，用刀片切去上、下表面后，置于去離子水中，攪拌下溶解致孔劑，并用去離子水漂洗3次，真空干燥箱內(nèi)充分干燥后，即可獲得孔隙結(jié)構可控的三維PDLA支架。
四、粘結(jié)塊和支架的表征1.微觀結(jié)構觀測干燥后的粘結(jié)塊，用刀片截取不同斷面，在顯微鏡下觀察其粘結(jié)均勻性，并測定致孔劑微球之間粘結(jié)面的直徑，即粘結(jié)程度。
干燥后的三維PDLA支架，用顯微鏡觀察孔隙結(jié)構；真空噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察三維支架的結(jié)構。
實驗結(jié)果一、粘結(jié)劑性狀表1粘結(jié)劑的組成和性狀

使用的對照粘結(jié)劑如下

由粘結(jié)劑性狀變化表明，膠體破壞成分的存在，可以保證粘結(jié)劑不會成為凝膠；而致孔劑保護成分的存在，可以保證致孔劑顆粒不會在粘結(jié)過程中發(fā)生形態(tài)和大小的明顯變化。
二、致孔劑的粘結(jié)1.致孔劑大體觀察和粘結(jié)均勻性粘結(jié)塊的大體圖片和觀察粘結(jié)均勻性的取樣斷面如圖1所示；各粘結(jié)斷面的顯微結(jié)構如圖2。
由圖可見，利用粘結(jié)劑離心粘結(jié)技術可以方便地獲得大體積的致孔劑粘結(jié)塊；且致孔劑形態(tài)保持不變、粘結(jié)塊整體結(jié)構均勻。而且用粘合劑a-h所獲得的結(jié)果基本上完全相同。
2.粘結(jié)程度及其控制條件表2粘結(jié)的均勻度和粘結(jié)程度統(tǒng)計表

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，在同一粘結(jié)實驗條件下，各粘結(jié)面的致孔劑之間的粘結(jié)程度不存在統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；而不同實驗條件之間，致孔劑之間的粘結(jié)程度有顯著差異(P＜0.05)。當粘結(jié)劑濃度相同時，離心力越大，粘結(jié)程度越小(表3中B和C)；當離心力相同時，粘結(jié)劑濃度增大，粘結(jié)程度增加(表3中A和B)。即離心粘結(jié)技術能獲得粘結(jié)程度均勻的大體積粘結(jié)塊，并通過改變粘結(jié)劑濃度或離心力大小，能方便地控制致孔劑的粘結(jié)程度，即三維支架的孔隙之間連通通道尺寸。
三、支架結(jié)構1.支架外觀圖3顯示的是一種直徑約25mm，高約15mm大體積三維支架；即利用本發(fā)明技術，可以方便地制備出大體積三維細胞支架。
2.支架顯微鏡圖4為三維支架的顯微照片。照片中可以看出，由致孔劑微球所形成的球形大孔，各個大孔之間相互連通，且大孔之間由于致孔劑粘結(jié)形成的圓形連通通道。具備了理性細胞支架的結(jié)構特征。
3.支架掃描電鏡圖5為三維支架的的掃描電子顯微鏡圖片。從圖片中可以非常清晰的看到，由致孔劑微球所形成的球形大孔，以及各個大孔之間的圓形連通通道，且圓形通道大小均勻；具備了理性細胞支架的結(jié)構特征。
討論三維細胞支架的孔隙為細胞提供粘附的表面，其孔隙率越高，支架能為細胞提供的粘附表面更大，越有利于細胞粘附、生長、細胞外基質(zhì)沉積、營養(yǎng)和氧氣進入及代謝產(chǎn)物交換，也有利于血管和神經(jīng)的長入。因此，制備高孔隙率的三維細胞支架，成為組織工程用細胞支架的目標之一。另一方面，臨床上缺損的組織、器官通常具有一定的形態(tài)和體積，應用組織工程技術修復這類缺損，需要相應的、具有一定形態(tài)和體積的三維細胞支架。所以，研究和開發(fā)易于工業(yè)化生產(chǎn)，且內(nèi)部結(jié)構可控的大體積三維細胞支架制備技術，具有非常重大的意義。
致孔劑粘結(jié)與溶液澆注/瀝濾技術結(jié)合，是制備組織工程用三維細胞支架的優(yōu)良方法之一。該技術可以方便地利用致孔劑的形態(tài)和大小，控制支架孔隙形態(tài)和孔隙尺寸；利用致孔劑粘結(jié)和粘結(jié)程度，實現(xiàn)支架孔隙間完全連通、控制孔隙間通道的尺寸。目前的幾種致孔劑粘結(jié)技術[Murphy W L，Dennis R G，Kileny J L，Mooney D J.Salt fusionan approach to improve poreinterconnectivity within tissue engineering scaffolds.TissueEngineering，8(1)43-52，2002；曹誼林，陳際達，崔磊，劉偉。水溶性球形致孔劑及其制法和用途，申請?zhí)?2158989.5，2002.12.27；Ma P X，Choi JW.Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnectedspherical pore network.Tissue Engineering，7(1)23-33，2001，Ma，PeterX.Reverse fabrication of porous materials，United States Patent，Application number20020005600]，可以在一定程度上控制支架的孔隙連通性和通道尺寸，但是，根本無法制備出結(jié)構均勻的大體積三維支架，也難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。其根本原因是，無法實現(xiàn)大體積致孔劑的均勻粘結(jié)。如利用致孔劑吸潮性質(zhì)的粘結(jié)技術，由于環(huán)境中的濕度向致孔劑內(nèi)部逐漸擴散，表面致孔劑比內(nèi)部致孔劑接觸濕空氣更早、吸潮更高，導致表面致孔劑粘結(jié)、溶蝕比中央致孔劑更快，使表面致孔劑形態(tài)和尺寸發(fā)生變化更顯著，顯然不能獲得均勻的大體積粘結(jié)塊，也無法獲得大體積的三維細胞支架。利用熱傳導使石蠟致孔劑熔融粘結(jié)的方法，因熱傳導在致孔劑內(nèi)部形成溫度梯度，使表面致孔劑比中央致孔劑接觸的溫度更高，熔融粘結(jié)的程度也高，并且，隨致孔劑體積增加，粘結(jié)的不均勻性更顯著。本發(fā)明則根據(jù)，在恒定的溫度下，粘結(jié)劑在致孔劑表面的剩余量(即粘結(jié)程度控制部分)與離心力和粘結(jié)劑濃度(粘結(jié)劑粘度)相關，而與其它因素(如致孔劑體積)無關；通過控制粘結(jié)劑濃度和離心力，實現(xiàn)內(nèi)部結(jié)構可控的、結(jié)構均勻的大體積三維支架制備。
圖1～圖5，直觀上完全證實了，大體積致孔劑粘結(jié)的均勻性和結(jié)構可控性，以及由此制備的大體積三維細胞支架的結(jié)構均勻性、孔隙連通性和孔隙結(jié)構可控性。表2則用統(tǒng)計的結(jié)構顯示了大體積致孔劑粘結(jié)的均勻性和結(jié)構可控性，即致孔劑粒徑為450-600μm范圍，粘結(jié)劑濃度為20％、離心力為161g時，粘結(jié)塊各斷面的粘結(jié)程度無顯著差異，其總體粘結(jié)程度為153.00±27.51(174)；粘結(jié)劑濃度為40％、離心力為161g時，粘結(jié)塊各斷面的粘結(jié)程度無顯著差異，其總體粘結(jié)程度為179.21±31.81(322)；粘結(jié)劑濃度為40％、離心力為1449g時，粘結(jié)塊各斷面的粘結(jié)程度無顯著差異，其總體粘結(jié)程度為129.83±26.46(135)。而不同條件下，粘結(jié)程度有非常顯著的差異。表明利用粘結(jié)離心技術能獲得粘結(jié)程度均勻的大體積粘結(jié)塊，并通過改變粘結(jié)劑濃度或離心力大小，能方便地控制致孔劑的粘結(jié)程度，即三維支架的孔隙之間連通通道尺寸。
粘結(jié)劑的組成和性質(zhì)可見(表1)，膠體破壞成分(強電解質(zhì))的存在，可以保證粘結(jié)劑不會成為凝膠，有利于提高粘結(jié)劑的濃度，增加粘結(jié)劑在致孔劑表面的附著量，即增大致孔劑之間的粘結(jié)程度；而致孔劑保護成分的存在，可以保證致孔劑顆粒不會在粘結(jié)過程中發(fā)生形態(tài)和大小的明顯變化，有利于控制大體積三維細胞支架的孔隙大小、形態(tài)和連通結(jié)構。因此，該粘結(jié)劑的組成和配方，完全區(qū)別于一般用途的粘結(jié)劑，是專用于致孔劑粘結(jié)的一種試劑。
粘結(jié)劑與致孔劑混合/離心操作方式，具有操作簡便、快速、重復性好、設備簡便等優(yōu)點，具有大工業(yè)化生產(chǎn)的潛在能力，是其它致孔劑粘結(jié)劑技術無法比擬的。因此，本發(fā)明既解決了內(nèi)部結(jié)構可控的大體積三維細胞支架制備技術，又具有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，對于促進組織工程產(chǎn)業(yè)化具有重要的意義。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種用于制備組織工程三維支架的粘結(jié)劑，其特征在于，它含有水和溶解于水的以下成分(a)5-600克/升粘結(jié)成分，所述的粘結(jié)成分選自下組明膠、糊精、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、或其組合；(b)飽和濃度的致孔劑保護成分，所述的致孔劑保護成分選自下組氯酸鈉、氯酸鉀、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀；(c)飽和濃度的膠體破壞成分，所述的膠體破壞成分選自下組氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、硝酸鉀、氯酸鈉、或其組合。
2.如權利要求1所述的粘結(jié)劑，其特征在于，粘結(jié)成分是明膠，含量50-600克/升。
3.如權利要求1所述的粘結(jié)劑，其特征在于，粘結(jié)成分是羧甲基纖維素鈉，含量5-40克/升。
4.如權利要求1所述的粘結(jié)劑，其特征在于，粘結(jié)成分是糊精，含量50-500克/升。
5.如權利要求1所述的粘結(jié)劑，其特征在于，致孔劑保護成分是氯酸鈉，而所述的膠體破壞成分是氯酸鈉。
6.如權利要求1所述的粘結(jié)劑，其特征在于，致孔劑保護成分是丁二酰亞胺，且所述的膠體破壞成分是氯化鈉、氯化鉀、或其組合。
7.一種用于制備組織工程三維支架的試劑盒，其特征在于，它包含(a)權利要求1所述的用于制備組織工程三維支架的粘結(jié)劑；以及(b)選自下組的致孔劑氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物，附加條件是粘結(jié)劑中的致孔劑保護成分與致孔劑相同。
8.權利要求1所述的粘結(jié)劑的用途，其特征在于，用于制備組織工程三維支架。
9.一種組織工程三維支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將球形致孔劑顆粒與權利要求1所述的粘結(jié)劑混合均勻，形成致孔劑顆粒與粘結(jié)劑的混合物，然后將混合物置于底部有孔的模具中，其中孔徑小于致孔劑顆粒平均直徑，致孔劑成分選自下組氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物，并且粘結(jié)劑中的致孔劑保護成分與致孔劑相同；(b)將盛有混合物的模具，在20-1500g離心力作用下，離心去除多余的粘結(jié)劑；(c)干燥離心后的混合物，獲得致孔劑粘結(jié)塊；(d)用溶液澆鑄法將聚合物溶液澆鑄到致孔劑粘結(jié)塊上，所述的聚合物溶液由有機溶劑和溶解于有機溶劑中的聚合物構成，其中所述的聚合物選自下組聚乳酸、聚羥基乙酸、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)、聚己內(nèi)酯、聚β-羥基丁酯、聚二氧六環(huán)酮及其組合，然后揮發(fā)去除有機溶劑，形成致孔劑粘結(jié)塊-聚合物構成的復合物；(d)切去復合物表層后，將復合物浸泡于水中，從而溶解去除致孔劑；(e)干燥，獲得結(jié)構可控的三維組織工程支架。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的三維組織工程支架的體積為5立方毫米-500立方厘米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于制備組織工程三維支架的粘結(jié)劑和支架制備方法，所述的粘結(jié)劑含有水和溶解于水的以下成分(a)5－600克/升粘結(jié)成分，(b)飽和濃度的致孔劑保護成分，和(c)飽和濃度的膠體破壞成分。利用本發(fā)明的粘結(jié)劑和支架制備方法，可以簡便高效地制得結(jié)構可控的大體積三維組織工程支架。
文檔編號A61L24/00GK1651099SQ20041001613
公開日2005年8月10日 申請日期2004年2月6日 優(yōu)先權日2004年2月6日
發(fā)明者曹誼林, 陳際達, 崔磊, 劉偉 申請人:上海組織工程研究與開發(fā)中心