本申請是申請日為2012年09月12日，申請?zhí)枮?01280045391.8，發(fā)明名稱為“g形夾用于改進(jìn)的等位基因特異性pcr的用途”的發(fā)明專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增領(lǐng)域且具體地涉及等位基因特異性擴(kuò)增領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：核酸的等位基因特異性擴(kuò)增允許靶序列的同時擴(kuò)散和分析。在懷疑靶核酸在其序列中具有一個或多個具有變異(多態(tài)性)的亞群時，通常使用等位基因特異性擴(kuò)增。dna多態(tài)性用于dna概況分析(法醫(yī)取證、親權(quán)認(rèn)定、用于器官移植的組織分型)、遺傳作圖以及罕見突變的檢測，所述罕見突變例如在具有正常dna的細(xì)胞背景中的癌細(xì)胞中出現(xiàn)的那些。在成功的等位基因特異性擴(kuò)增中，靶核酸的所需變體被擴(kuò)增，而其他變體則未被擴(kuò)增，至少未擴(kuò)增到可檢測水平。一般的等位基因特異性擴(kuò)增測定涉及聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，其中至少一條引物與具有可疑多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)。等位基因特異性引物的設(shè)計使得引物延伸僅在存在多態(tài)性的某一變體時才發(fā)生。以其最簡單的形式，等位基因特異性引物具有與靶中的多態(tài)性核苷酸的所需變體互補(bǔ)的3'末端核苷酸。通常在引物3'末端處的單個錯配足以排除靶序列的不需要變體的擴(kuò)增。然而，擴(kuò)增的特異性在不同3'末端序列中變化極大：一些錯配有效阻斷通過聚合酶的延伸，而其他則不會，參見美國專利號5,639,611。等位基因鑒別的成功取決于dna聚合酶延伸錯配引物的無能性(inability)。dna聚合酶的這種無能性可以通過調(diào)整反應(yīng)條件來進(jìn)行調(diào)節(jié)以達(dá)到最大選擇性。然而，對于許多多態(tài)性序列而言，等位基因特異性pcr低選擇性仍是個問題。增加特異性的一種方法涉及改造具有一個或多個內(nèi)部錯配核苷酸的擴(kuò)增引物。這種方法在一些系統(tǒng)中證明是成功的，參見美國專利5,137,806。增加特異性的另一種方法涉及引物的化學(xué)修飾。例如，發(fā)現(xiàn)引物中的一些核苷酸的脫氧核糖的某些2'-c和4'-c修飾增強(qiáng)通過聚合酶的等位基因鑒別，參見gaster，j.和marx，a.(2005)chem.eur.j.11:1861-1870。在另一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)等位基因鑒別通過在引物的核苷酸之一中使用非天然嘧啶堿基得到增強(qiáng)，特別是在嘧啶環(huán)的6位置中具有多個取代基的假異胞苷(pseudoisocytidine)，參見美國專利號7,408,051。在實(shí)時等位基因特異性pcr的背景下，測定的選擇性可以測量為匹配和錯配模板之間的閾值循環(huán)數(shù)目(ct)中的差異。更大的差異指示錯配模板擴(kuò)增中的更大延遲和因此等位基因之間的更大區(qū)別。經(jīng)修飾的脫氧核糖已顯示導(dǎo)致在1-14個循環(huán)的ct差異。假異胞苷的使用導(dǎo)致錯配模板的擴(kuò)增中7個循環(huán)的延遲。這種鑒別程度對于許多應(yīng)用(其中樣品含有均競爭擴(kuò)增的模板的幾種變體)而言是不足夠的。通常錯配模板以比匹配模板大得多的量存在。例如，在組織樣品中，僅小部分細(xì)胞可以是惡性的且攜帶由等位基因特異性擴(kuò)增測定靶向的突變(“匹配模板”)。在正常細(xì)胞中存在的模板可能以更低的效率被擴(kuò)增，但極大數(shù)目的正常細(xì)胞將克服擴(kuò)增中的任何延遲且消除突變型模板的任何優(yōu)勢。為了在野生型模板的存在下檢測罕見突變，等位基因特異性擴(kuò)增測定的特異性需要得到改進(jìn)。已提出了增強(qiáng)引物的等位基因特異性的許多方法。然而，對于許多臨床上相關(guān)的核酸靶，pcr特異性的缺乏仍是問題。因此，設(shè)計等位基因特異性引物的新方法是必需的。g形夾(g-clamp)是圖1中所示的三環(huán)氨基乙氧基-吩噁嗪-2'-脫氧胞苷，其是胞嘧啶類似物。當(dāng)摻入寡核苷酸內(nèi)時，g形夾同時識別螺旋內(nèi)的互補(bǔ)鳥嘌呤的watson-crick面和hoogsteen面。因此，當(dāng)與互補(bǔ)dna和rna鏈雜交時，含g形夾寡核苷酸充分增強(qiáng)螺旋熱穩(wěn)定性和錯配區(qū)別。這些增強(qiáng)的親和力和特異性的性質(zhì)在基于核酸的診斷學(xué)和通過反義方法的rna序列特異性靶向領(lǐng)域中是有利的。g形夾和相關(guān)嘧啶衍生物的進(jìn)一步特征公開于美國專利號6,414,127、美國專利號6,951,931、美國專利號7,511,125和美國專利號re39,324中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在第一個方面，本發(fā)明涉及靶序列變體的等位基因特異性擴(kuò)增的方法，該靶以幾種變體序列的形式存在，該方法包括(a)使第一和第二寡核苷酸與靶序列的至少一種變體雜交；其中第一寡核苷酸與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)，并且第二寡核苷酸與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)，并且具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的至少一個選擇性核苷酸；其中第二寡核苷酸摻入至少一個“g形夾”核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸，其中當(dāng)?shù)诙押塑账崤c和至少一個選擇性核苷酸互補(bǔ)的靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠有效延伸第二寡核苷酸，并且當(dāng)?shù)诙押塑账崤c和至少一個選擇性核苷酸不互補(bǔ)的靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低。在第二個方面，本發(fā)明涉及用于靶序列的等位基因特異性擴(kuò)增的試劑盒，該靶以幾種變體序列的形式存在，該試劑盒包含：(a)第一寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)；和(b)第二寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)，并具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的至少一個選擇性核苷酸；其中第二寡核苷酸摻入至少一個“g形夾”核苷酸。在第三個方面，本發(fā)明涉及用于進(jìn)行靶序列的等位基因特異性擴(kuò)增的寡核苷酸，該靶以幾種變體序列的形式存在，該寡核苷酸包含：(a)與所述靶序列的一種或多種變體的部分至少部分互補(bǔ)的序列；(b)與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的至少一個選擇性核苷酸；(c)至少一個“g形夾”核苷酸。在第四個方面，本發(fā)明涉及用于靶序列的等位基因特異性擴(kuò)增的反應(yīng)混合物，該靶以幾種變體序列的形式存在，該混合物包含：(a)第一寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)；和(b)第二寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)，但具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的至少一個選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“g形夾”核苷酸。附圖說明圖1顯示了脫氧鳥嘌呤和脫氧胞苷之間(a)以及脫氧鳥嘌呤和g形夾之間(b)的氫鍵相互作用。圖2(a-c)顯示了野生型人egfr基因(seqidno:1)的編碼序列。發(fā)明詳述定義除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。在描述和請求保護(hù)本發(fā)明中，將使用下述定義。術(shù)語“核酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等)聚合物，并且包含脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、dna-rna雜交物、寡核苷酸、多核苷酸、適體、肽核酸(pna)、pna-dna綴合物、pna-rna綴合物等，其包含以線性(linear)或分支(branched)方式共價連接在一起的核苷酸。核酸一般是單鏈或雙鏈的，并且一般含有磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，包括可以具有替代骨架的核酸類似物，包括例如磷酰胺(beaucage等人(1993)tetrahedron49(10):1925)；硫代磷酸酯(mag等人(1991)nucleicacidsres.19:1437；和美國專利號5,644,048)、二硫代磷酸酯(briu等人(1989)j.am.chem.soc.111:2321)、o-甲基亞磷酰胺連接(參見eckstein，oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach，oxforduniversitypress(1992))、和肽核酸骨架和連接(參見egholm(1992)j.am.chem.soc.114:1895)。其他類似物核酸包括具有帶正電荷骨架的類似物核酸(denpcy等人(1995)proc.natl.acad.sci.usa92:6097)；非離子骨架的類似物核酸(美國專利號5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863)和非核糖骨架的類似物核酸，包括在美國專利號5,235,033和5,034,506中描述的類似物核酸。含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義內(nèi)(參見jenkins等人(1995)chem.soc.rev.第169-176頁)，并且類似物還在例如rawls，c&enewsjun.2，1997，第35頁中描述?？梢酝瓿闪姿岷颂枪羌艿倪@些修飾，以促進(jìn)另外部分例如標(biāo)記的添加，或改變此類分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。除了一般在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外，核苷酸類似物也可以包括非天然存在的雜環(huán)堿基，例如在seela等人(1999)helv.chim.acta82:1640中所述的那些。在核苷酸類似物中使用的某些堿基充當(dāng)解鏈溫度(tm)改性劑。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dn(例如丙炔基-du、丙炔基-dc等)等，參見例如美國專利號5,990,303。其他代表性雜環(huán)堿基包括例如次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤；以下堿基的8-氮雜衍生物：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；以下堿基的7-脫氮-8-氮雜衍生物：腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；6-氮雜胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等?！昂塑铡敝赴c糖部分(核糖或脫氧核糖)、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物(例如碳環(huán))共價連接的堿基或堿性基團(tuán)(包含至少一個同素環(huán)、至少一個雜環(huán)、至少一個芳基，等等(and/orthelike))的核酸組分。例如，當(dāng)核苷包括糖部分時，堿基一般連接至該糖部分的1'-位置。如上所述，堿基可以是天然存在的堿基或非天然存在的堿基。示例性核苷包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、雙脫氧核糖核苷和碳環(huán)核苷?！昂塑账帷敝负塑盏孽?，例如核苷的磷酸酯，其具有共價連接至核苷糖部分的5'位置的一個、兩個、三個或更多個磷酸基。“嘌呤核苷酸”指包含嘌呤堿基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指包含嘧啶堿基的核苷酸?！癵形夾”核苷酸指胞嘧啶類似物，9-(氨基乙氧基)-吩噁嗪-2'-脫氧胞苷，并且公開于us6,414,127中?！肮押塑账帷敝赴ㄖ辽賰蓚€，但一般為5-50個核苷酸且更一般為15-35個核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的確切大小通常取決于多種因素，包括寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法進(jìn)行制備，包括例如合適序列的克隆和限制性消化，或通過諸如下述方法的直接化學(xué)合成：narang等人(1979)meth.enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；brown等人(1979)meth.enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；beaucage等人(1981)tetrahedronlett.22:1859-1862的二乙基亞磷酰胺法；matteucci等人(1981)j.am.chem.soc.103:3185-3191的三酯法；自動合成法；美國專利號4,458,066的固體載體法或本領(lǐng)域已知的任何其他化學(xué)方法?！耙锖怂帷被颉耙铩笔强梢耘c模板核酸雜交且允許使用核苷酸摻入生物催化劑的鏈延伸或延長的寡核苷酸。盡管有時利用其他引物長度，但引物一般范圍為15-35個核苷酸。短引物核酸一般利用更冷的溫度，以與模板核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。與模板核酸的子序列至少部分互補(bǔ)的引物核酸一般足以與模板核酸雜交以發(fā)生延伸。然而，延伸的成功通常需要在引物的3'端處更大的互補(bǔ)性(即與模板的更少錯配)。需要時，引物核酸可以通過摻入標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記可通過放射學(xué)、光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)技術(shù)檢測?！把由斓囊铩敝敢粋€或多個另外的核苷酸已加入其中的引物?！耙镅由臁笔橇硗獾暮塑账嵬ㄟ^其加入引物中的酶的作用。“模板核酸”、“模板”或“靶”指引物核酸在合適條件下可以與之雜交且延伸的核酸。在核酸擴(kuò)增的背景下，“靶”優(yōu)選是雙鏈核酸的區(qū)域，由與至少兩條引物序列至少部分互補(bǔ)的序列及間插序列組成。靶還可以是單鏈核酸，由與一條引物至少部分互補(bǔ)的序列和與第二條引物部分相同的序列組成。模板核酸可以作為分離的核酸片段存在或可以是大核酸片段的部分。靶核酸可以衍生自或分離自基本上任何來源，例如培養(yǎng)的微生物、未培養(yǎng)的微生物、復(fù)雜的生物混合物、組織、血清、古老的或保存的組織或樣品、環(huán)境分離物等。進(jìn)一步地，模板核酸任選包括或來源于cdna、rna、基因組dna、克隆的基因組dna、基因組dna文庫、酶促斷裂的dna或rna、化學(xué)斷裂的dna或rna、物理斷裂的dna或rna等。模板核酸還可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)化學(xué)合成。如本文使用的，“基因”指與生物功能相關(guān)的dna的任何區(qū)段。因此，基因包括編碼序列并任選包括編碼序列表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列。當(dāng)另外的核苷酸例如通過核苷酸摻入生物催化劑在核酸的3'端處摻入核酸內(nèi)時，核酸被“延伸”或“延長”?！安糠帧被颉盎鶊F(tuán)”指某些事物例如分子分裂成的部分之一(例如官能團(tuán)、取代基等)。例如，核苷酸一般包含堿基基團(tuán)(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或類似物)、糖部分、和一個或多個磷酸基?！暗任换蛱禺愋砸铩笔沁@樣的引物，其可以與模板核酸的幾種變體雜交，但當(dāng)與模板核酸的僅一些變體雜交時，則允許通過聚合酶的延長。對于模板核酸的其他變體，引物-模板雜交物可能不延伸或由聚合酶以更低效率延伸。當(dāng)另外的核苷酸例如通過核苷酸摻入生物催化劑在核酸的3'端處摻入核酸內(nèi)時，核酸被“延伸”或“延長”。如果擴(kuò)增測定獲得一種產(chǎn)物超過其他可能產(chǎn)物的優(yōu)勢(即大多數(shù)但小于100%)，則它是“選擇性的”或“等位基因選擇性的”。只要靶序列的不需要(錯配)變體的擴(kuò)增是可檢測的，測定就描述為“等位基因選擇性的”。如果可能產(chǎn)物之一唯一形成，則使用關(guān)于擴(kuò)增測定的術(shù)語“特異性的”或“等位基因特異性的”。將其中不需要的靶的擴(kuò)增是無法檢測的測定稱為“等位基因特異性的”。然而，應(yīng)當(dāng)理解隨著檢測方法變得更靈敏，先前已知為等位基因特異性的一些測定變成等位基因選擇性的，即靶的不需要變體的一些擴(kuò)增變得可檢測。因此，在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“等位基因特異性的”意在包含嚴(yán)格地等位基因特異性的以及等位基因選擇性的擴(kuò)增?！盎蛐汀敝讣?xì)胞或個體或者細(xì)胞或個體的組的全部或部分遺傳組成。例如，基因型包括存在于給定基因座上或分布在基因組中的特定突變和/或等位基因(例如多態(tài)性，例如單核苷酸多態(tài)性(snp)等)?！昂怂峋酆厦浮敝复呋塑账釗饺牒怂醿?nèi)的酶。示例性核酸聚合酶包括dna聚合酶、rna聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒末端轉(zhuǎn)移酶等?！盁岱€(wěn)定酶”指當(dāng)將其置于高溫下所選的時間段時是穩(wěn)定的(即抵抗斷裂或變性)且保留足夠催化活性的酶。例如，當(dāng)將其置于高溫下雙鏈核酸變性所需的時間時，熱穩(wěn)定聚合酶保留實(shí)現(xiàn)隨后的引物延伸反應(yīng)的足夠活性。核酸變性所需的加熱條件是本領(lǐng)域眾所周知的且在美國專利號4,683,202和4,683,195中例示。如本文使用的，熱穩(wěn)定聚合酶一般適合于在溫度循環(huán)反應(yīng)例如聚合酶鏈反應(yīng)(“pcr”)中使用。熱穩(wěn)定核酸聚合酶的實(shí)例包括水生棲熱菌(thermusaquaticus)taqdna聚合酶、棲熱菌屬物種(thermussp.)z05聚合酶、黃棲熱菌(thermusflavus)聚合酶、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)聚合酶例如tma-25和tma-30聚合酶、tthdna聚合酶等?！敖?jīng)修飾的”酶指包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一個單體不同于參考序列，例如酶的天然或野生型形式或酶的另一種修飾形式。示例性修飾包括單體插入、缺失和取代。經(jīng)修飾的酶還包括具有來源于兩個或更多個親本的可鑒定組分序列(例如結(jié)構(gòu)或功能結(jié)構(gòu)域等)的嵌合酶。在經(jīng)修飾的酶的定義內(nèi)還包括的是包含參考序列的化學(xué)修飾的那些。經(jīng)修飾的聚合酶的實(shí)例包括g46ee678gcs5dna聚合酶、g46el329ae678gcs5dna聚合酶、g46el329ad640gs671fcs5dna聚合酶、g46el329ad640gs671fe678gcs5dna聚合酶、g46ee678gcs6dna聚合酶、z05dna聚合酶、δz05聚合酶、δz05-gold聚合酶、δz05r聚合酶、e615gtaqdna聚合酶、e678gtma-25聚合酶、e678gtma-30聚合酶等。術(shù)語“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”指一般與核酸鏈合成相關(guān)的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5'端去除，例如大腸桿菌dna聚合酶i具有這種活性，而klenow片段則沒有?！盎旧先狈?'-3'核酸酶活性”的聚合酶指具有taqdna聚合酶的50%或更低的(例如<25%、<20%、<15%、<10%)5'-3'核酸酶活性的聚合酶。測量5'-3'核酸酶活性的方法和用于測量的條件是本領(lǐng)域眾所周知的，參見例如美國專利號5,466,591?；旧先狈?'到3'核酸酶活性的dna聚合酶的實(shí)例包括大腸桿菌dna聚合酶i的klenow片段；缺乏n末端235個氨基酸的水生棲熱菌dna聚合酶(taq)(例如如美國專利號5,616,494中描述的且在本領(lǐng)域中通常被稱為“stoffel片段”)。其他實(shí)例包括具有足夠缺失(例如n末端缺失)、突變或修飾以消除或失活負(fù)責(zé)5'-3'核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定dna聚合酶，參見例如美國專利號5,795,762。術(shù)語“3'至5'核酸酶活性”或“3'-5'核酸酶活性”或“校正活性”指核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的3'端去除。例如，大腸桿菌dna聚合酶iii具有這種活性，而水生棲熱菌(taq)dna聚合酶則沒有。“保真度”或“復(fù)制保真度”是核酸聚合酶在模板依賴性聚合過程中摻入正確核苷酸的能力。在復(fù)制保真度的背景下，在新生核苷酸鏈上的“正確核苷酸”是經(jīng)由watson-crick堿基配對與模板核苷酸配對的核苷酸。特定聚合酶的復(fù)制保真度產(chǎn)生于摻入正確核苷酸和經(jīng)由聚合酶的3'-5'核酸酶活性從新生核苷酸鏈的3'末端去除不正確核苷酸的組合。測量核苷酸聚合酶的保真度的多種方法在tindall等人(1988)"fidelityofdnasynthesisbythethermusaquaticusdnapolymerase"，biochemistry，27:6008-6013中綜述。一般，具有3'-5'核酸酶(校正)能力的聚合酶比無校正活性的聚合酶具有更高的保真度?！皹?biāo)記”指(共價或非共價)連接至分子且能夠提供關(guān)于分子的信息的部分。示例性標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、比色法標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、質(zhì)量修飾基團(tuán)、抗體、抗原、生物素、半抗原和酶(包括過氧化物酶、磷酸酶等)。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的背景下，“熱啟動”指其中至少一種關(guān)鍵試劑從反應(yīng)混合物中被扣留(或如果存在于反應(yīng)混合物中，則試劑保持無活性)，直至溫度足夠升高以提供一種或多種引物的必需雜交特異性的方案?！盁釂用浮笔悄軌蛟跓釂臃桨钢谐洚?dāng)“扣留”或無活性試劑的酶，一般為核酸聚合酶?！皐atson-crick堿基配對”或簡寫的“堿基配對”指在雙鏈核酸分子內(nèi)的“常規(guī)的”氫鍵成鍵。watson-crick堿基配對是腺嘌呤和胸腺嘧啶之間、鳥嘌呤和胞嘧啶之間、腺嘌呤和尿嘧啶之間、以及這些堿基的類似物之間的氫鍵成鍵?！斑x擇性核苷酸”是對引物賦予等位基因選擇性的等位基因特異性引物中的核苷酸。選擇性核苷酸與靶核酸的所需變體中的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)，但不與靶核酸的不需要變體中的核苷酸互補(bǔ)。在引物中，多于一個核苷酸可以與靶核酸的所需變體中的核苷酸互補(bǔ)，但不與靶核酸的不需要變體中的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)。然而，選擇性核苷酸位于引物內(nèi)影響引物特異性的位置處。選擇性核苷酸允許靶核酸的有效或無效擴(kuò)增，這取決于它在靶核酸中是否發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)配偶體。引物可以含有多于一個選擇性核苷酸。表達(dá)“其中當(dāng)所述第二寡核苷酸與和至少一個選擇性核苷酸互補(bǔ)的靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠有效延伸所述第二寡核苷酸，并且當(dāng)所述第二寡核苷酸與和至少一個選擇性核苷酸不互補(bǔ)的靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低”意指第二寡核苷酸通過聚合酶的延伸在選擇性核苷酸與靶形成堿基對時比所述選擇性核苷酸不與靶形成堿基對時更有效。如上所述，在一個方面，本發(fā)明涉及等位基因特異性擴(kuò)增的方法，其包括(a)提供可能含有靶序列的至少一種變體的樣品；(b)提供第一寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補(bǔ)；(c)提供第二寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)，具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“g形夾”核苷酸；(d)提供適合于所述第一和第二寡核苷酸與靶序列的至少一種變體雜交的條件；(e)提供適合于通過核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的條件；其中當(dāng)所述第二寡核苷酸與對其它具有所述互補(bǔ)選擇性核苷酸的靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠延伸所述第二寡核苷酸，并且當(dāng)所述第二寡核苷酸與對其它具有非互補(bǔ)選擇性核苷酸的靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低。與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)，并具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的選擇性核苷酸的第二寡核苷酸被稱為“選擇性寡核苷酸”、“選擇性引物”或“等位基因選擇性引物”。本發(fā)明的選擇性寡核苷酸包含10-50、更優(yōu)選15-35個核苷酸，它們的大多數(shù)與靶序列的多于一種變體中的序列互補(bǔ)。寡核苷酸的選擇性核苷酸與待擴(kuò)增的靶序列變體互補(bǔ)，并且不與其他變體互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，選擇性核苷酸是3'末端核苷酸。本發(fā)明的選擇性寡核苷酸包括一個或多個“g形夾”核苷酸。在一些實(shí)施方案中，“g形夾”核苷酸在3'末端核苷酸處出現(xiàn)。在其他實(shí)施方案中，“g形夾”核苷酸在3'末端核苷酸上游的1-5個核苷酸處出現(xiàn)。在其他實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的堿基核苷酸是3'末端核苷酸。在一些實(shí)施方案中，“g形夾”核苷酸在3'末端處和在寡核苷酸內(nèi)的其他地方的至少再一個位置處出現(xiàn)。本發(fā)明的等位基因特異性引物可以摻入本領(lǐng)域已知的引物設(shè)計的多個方面。例如，引物可以采取稱為“蝎形(scorpion)”且在whitcombe等人(1999)"detectionofpcrproductsusingself-probingampliconsandfluorescence"，naturebiotech.17:804-807中所述的單分子引物-探針組合的形式。根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的蝎形引物摻入蝎形的一般元件，即探針部分、莖環(huán)部分和引物部分。進(jìn)一步地，在根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的蝎形中，引物部分具有與變體位置互補(bǔ)的3'端。在根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的蝎形中的引物部分含有如本文描述的一個或多個“g形夾”核苷酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增涉及聚合酶鏈反應(yīng)，即模板變性、寡核苷酸引物與模板退火(雜交)、和通過核酸聚合酶的引物延伸的重復(fù)循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，退火和延伸在相同的溫度步驟中發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)涉及熱啟動方案。在等位基因特異性擴(kuò)增的背景下，等位基因特異性引物關(guān)于錯配靶的選擇性可以通過使用熱啟動方案得到增強(qiáng)。許多熱啟動方案是本領(lǐng)域已知的，例如蠟的使用，將關(guān)鍵試劑與反應(yīng)混合物的剩余部分分離(美國專利號5,411,876)，通過抗體可逆失活的核酸聚合酶的使用(美國專利號5,338,671)，通過設(shè)計為特異性結(jié)合其活性位點(diǎn)的寡核苷酸可逆失活的核酸聚合酶，或具有可逆化學(xué)修飾的核酸聚合酶的使用，如例如美國專利號5,677,152和5,773,528中描述的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，等位基因特異性擴(kuò)增測定是實(shí)時pcr測定。在實(shí)時pcr測定中，擴(kuò)增的測量標(biāo)準(zhǔn)是“達(dá)到閾值的循環(huán)(cyclestothreshold)”或ct值。更早的ct值反映閾值水平的快速實(shí)現(xiàn)且因此更有效的擴(kuò)增。更晚的ct值可以反映效率低的或受抑制的擴(kuò)增。在等位基因特異性實(shí)時pcr測定的背景下，匹配和錯配模板之間的ct值中的差異是等位基因之間的鑒別或測定選擇性的測量標(biāo)準(zhǔn)。等位基因特異性擴(kuò)增測定可以采用本領(lǐng)域已知的任何合適的核酸聚合酶。對于等位基因特異性pcr測定，可以使用任何熱穩(wěn)定的核酸聚合酶。有時希望使用無校正(3'-5'-外切核酸酶)活性的酶，例如如taqdna聚合酶。還可能希望使用基本上或完全缺乏5'-3'核酸酶活性的酶，例如美國專利號5,795,762中所述的。此類酶的一個實(shí)例是δz05聚合酶。有時可能希望具有“熱啟動”能力的酶，例如美國專利號5,677,152和5,773,528中所述的可逆修飾的酶。熱啟動酶的一個實(shí)例是δz05-gold聚合酶。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法完成。這些方法包括標(biāo)記引物和探針以及多種核酸結(jié)合染料的使用。檢測方法可以對于靶序列的一種變體是特異性的，或可以對于靶序列的所有變體或甚至對于所有雙鏈dna是非特異性的(generic)。當(dāng)不需要的靶變體的擴(kuò)增是最低限度的且預(yù)期會落入方法的檢測限之下時，可以使用非特異性檢測方法。擴(kuò)增產(chǎn)物可以在擴(kuò)增已完成后例如通過未標(biāo)記產(chǎn)物的凝膠電泳和用核酸結(jié)合染料染色凝膠進(jìn)行檢測?；蛘撸捎谠诤铣蛇^程中的摻入或由于是標(biāo)記引物的延伸產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物可以攜帶放射性或化學(xué)標(biāo)記。在電泳后或電泳過程中，標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物可以用本領(lǐng)域已知的合適放射學(xué)或化學(xué)工具進(jìn)行檢測。在電泳后，產(chǎn)物還可以用通過本領(lǐng)域已知的方法的任何一種標(biāo)記的靶特異性探針進(jìn)行檢測。標(biāo)記探針還可以無需電泳即在“斑點(diǎn)印跡”測定等中應(yīng)用于靶。在其他實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物的存在可以在同質(zhì)測定(homogeneousassay)中進(jìn)行檢測，所述同質(zhì)測定即這樣的測定，其中在擴(kuò)增循環(huán)過程中或至少在同一未打開的管中檢測新生產(chǎn)物，并且不需要擴(kuò)增后處理。同質(zhì)擴(kuò)增測定已例如在美國專利號5,210,015中得到描述。使用核酸嵌入染料的同質(zhì)擴(kuò)增測定已例如在美國專利號5,871,908和6,569,627中得到描述。同質(zhì)測定還可以采用由兩種相互作用的熒光團(tuán)標(biāo)記的熒光探針，例如“分子信標(biāo)”探針(tyagi等人(1996)nat.biotechnol.，14:303-308)或熒光標(biāo)記的核酸酶探針(livak等人(1995)pcrmeth.appl.，4:357-362)。在這些技術(shù)的某些變化中，擴(kuò)增產(chǎn)物還可以由于其區(qū)別性的解鏈溫度進(jìn)行鑒定，參見美國專利號5,871,908和6,569,627。擴(kuò)增產(chǎn)物還可以使用稱為“蝎形”的單分子引物-探針組合進(jìn)行檢測。whitcombe等人(1999)"detectionofpcrproductsusingself-probingampliconsandfluorescence"，naturebiotech.17:804-807。蝎形寡核苷酸的引物部分可以是根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的等位基因特異性引物。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于特異性或選擇性擴(kuò)增靶序列的所選變體的反應(yīng)混合物，其包含第一寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補(bǔ)；第二寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補(bǔ)，但具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的選擇性核苷酸，其中所述第二寡核苷酸包括至少一個“g形夾”核苷酸和已知以多于一種序列變體存在的靶核酸。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含核酸擴(kuò)增通常所需的試劑和溶液，包括核酸聚合酶、核酸前體即核苷三磷酸、以及適合于支持核酸聚合酶活性的有機(jī)和無機(jī)離子。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的等位基因特異性擴(kuò)增的試劑盒。試劑盒通常包括測定特異性組分以及進(jìn)行dna擴(kuò)增測定通常所需的組分。作為測定特異性組分，本發(fā)明的等位基因特異性擴(kuò)增試劑盒一般包括第一寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補(bǔ)；和第二寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補(bǔ)，具有與靶序列的僅一種變體互補(bǔ)的選擇性核苷酸，并且還具有至少一個“g形夾”核苷酸；和任選的對照核酸序列，其包含一些與試劑盒中裝有的寡核苷酸至少部分互補(bǔ)的對照靶序列的至少一種變體。在一些實(shí)施方案中，可以裝有對照核酸序列的多于一種變體。在某些實(shí)施方案中，在試劑盒中裝有的對照核酸序列的幾種變體中，至少一種變體與等位基因選擇性寡核苷酸的選擇性核苷酸互補(bǔ)。作為核酸擴(kuò)增通常所需的組分，本發(fā)明的試劑盒一般包括下述中的一種或多種：核酸聚合酶、核酸前體例如核苷三磷酸(脫氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸)、任選的用于使核酸的焦磷酸解降到最低的焦磷酸酶、用于保護(hù)不受擴(kuò)增反應(yīng)的攜帶污染(carry-overcontamination)的尿嘧啶n-糖基化酶(ung)、擴(kuò)增反應(yīng)和檢測所需的預(yù)制試劑和緩沖液、和用于進(jìn)行本發(fā)明的等位基因特異性擴(kuò)增的一套說明書。在另外一個方面，本發(fā)明提供了用于等位基因特異性pcr的寡核苷酸。用于本發(fā)明的等位基因特異性pcr的一般寡核苷酸包含10-50、更優(yōu)選15-35個核苷酸，它們的大多數(shù)與靶序列的多于一種變體中的序列互補(bǔ)。然而，寡核苷酸的選擇性核苷酸與靶序列的一種變體互補(bǔ)，并且與其他變體不互補(bǔ)。進(jìn)一步地，本發(fā)明的寡核苷酸包括一個或多個“g形夾”核苷酸。在一些實(shí)施方案中，“g形夾”核苷酸在3'末端核苷酸處出現(xiàn)。在其他實(shí)施方案中，“g形夾”核苷酸在3'末端核苷酸上游的1-5個或例如1、2或3個核苷酸處出現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，“g形夾”核苷酸在3'末端處以及在寡核苷酸內(nèi)的其他地方出現(xiàn)。提供下述實(shí)施例和附圖以幫助本發(fā)明的理解，本發(fā)明的真實(shí)范圍在附加的權(quán)利要求中闡述。具體實(shí)施方式實(shí)施例1用于檢測人egfr基因中的突變l858r的引物這個突變產(chǎn)生于野生型egfr基因(seqidno:1)中的核苷酸變化2573t->g。用于檢測野生型和突變型egfr基因(seqidno:2)的引物和探針顯示于表1中。每個擴(kuò)增引物對中的一條引物在3'末端處與突變型變體匹配且與野生型變體錯配。剩余引物和探針對于突變型和野生型靶是共同的。表1。對于每個擴(kuò)增反應(yīng)，野生型基因組dna(k562)以每個反應(yīng)104拷貝存在。線性化突變型質(zhì)粒dna也以每個反應(yīng)104拷貝存在。突變型質(zhì)粒通過插入500bp至puc19載體(作為來自idt的小基因提供；seqidnos:15和16)內(nèi)進(jìn)行制備。每個反應(yīng)擴(kuò)增突變型或野生型靶的104拷貝(以104拷貝輸入)。匹配變體是具有摻入egfrl858r突變型序列的插入片段的質(zhì)粒dna，而錯配變體是k562gdna。匹配引物是未經(jīng)修飾的或在3'末端處或在距離3'末端的位置n-1或n-2處g形夾修飾的。每12μl反應(yīng)含有2.98%甘油，50mmtris-hcl(ph8.0)，80mmkcl，200μm每種datp、dctp和dgtp，400μmdutp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，0.05μm檢測探針，2.5%dmso，0.02%piercetween20，0.036%疊氮化鈉，0.1mmedta，0.2u/μl尿嘧啶-n-糖基化酶(ung)，200nmntq21-46a適體，40nmz05突變型聚合酶和2.5mm乙酸鎂(含0.09%疊氮化鈉)。擴(kuò)增和分析使用rochelightcycler480儀器完成。對反應(yīng)實(shí)施下述溫度概況：50℃5分鐘(ung步驟)，隨后為95℃10秒和62℃30秒的2個循環(huán)，以及93℃10秒和62℃30秒的60個循環(huán)。在最后60個循環(huán)的每個62℃步驟結(jié)束時收集熒光數(shù)據(jù)。一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于表2上。擴(kuò)增結(jié)果表示為在450-500nm或540-580nm波長間隔中的熒光中的變化。擴(kuò)增的選擇性通過匹配和錯配靶之間的ct值中的差異(δct)進(jìn)行測量。關(guān)于每次實(shí)驗(yàn)的δct在表2上指出。數(shù)據(jù)顯示靶的匹配(突變型)變體相對于錯配(野生型)變體被選擇性擴(kuò)增。選擇性通過引物中核苷酸的g形夾修飾得到增強(qiáng)。表2引物平均l858rct平均wtctδct(wt-l858r)seqidno:336.721.6-15.1seqidno:422.124.32.2seqidno:523.826.22.4seqidno:622.526.64.1seqidno:722.529.46.9實(shí)施例2用于檢測在pik3ca基因處的突變的引物每個擴(kuò)增引物對中的一條引物在3'末端處與突變型變體匹配且與野生型變體錯配。剩余引物和探針對于突變型和野生型靶是共同的。野生型基因組dna(k562)以每個反應(yīng)104拷貝存在。線性化突變型質(zhì)粒dna以每個反應(yīng)104拷貝存在。突變型質(zhì)粒通過插入500bp至puc19載體(作為來自idt的小基因提供)內(nèi)進(jìn)行制備。引物是未經(jīng)修飾的或在從n-1到n-2的任何堿基位置處g形夾修飾的。在一些設(shè)計中，在g形夾修飾位點(diǎn)處或其附近的引物序列中引入另外的錯配。每一12μl反應(yīng)含有2.98%甘油，50mmtris-hcl(ph8.0)，80mmkcl，200μm每種datp、dctp和dgtp，400μmdutp，0.1μm正向引物，0.1μm反向引物，0.05μm檢測探針，2.5%dmso，0.02%piercetween20，0.036%疊氮化鈉，0.1mmedta，0.2u/μl尿嘧啶-n-糖基化酶(ung)，200nmntq21-46a適體，40nmz05突變型聚合酶和2.5mm乙酸鎂(含0.09%疊氮化鈉)。擴(kuò)增和分析使用rochelightcycler480儀器完成。對反應(yīng)實(shí)施下述溫度概況：50℃5分鐘(ung步驟)，隨后為95℃10秒和62℃30秒的2個循環(huán)，以及93℃10秒和62℃30秒的60個循環(huán)。在最后60個循環(huán)的每個62℃步驟結(jié)束時收集熒光數(shù)據(jù)。一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于表3上。擴(kuò)增結(jié)果表示為在450-500nm或540-580nm波長間隔中的熒光中的變化。擴(kuò)增的選擇性通過匹配和錯配靶之間的ct值中的差異(δct)進(jìn)行測量。關(guān)于每次實(shí)驗(yàn)的δct在表3上指出。數(shù)據(jù)顯示對于未經(jīng)修飾的突變型引物，靶的匹配(突變型)變體相對于錯配(野生型)變體被選擇性擴(kuò)增。選擇性通過突變型引物中的核苷酸的g形夾修飾得到增強(qiáng)。表3平均突變型ct平均wtctδct(wt–突變型)野生型引物24.521.2-3.3未經(jīng)修飾的突變型引物22.633.611.0g形夾突變型引物27.651.523.9序列表<110>rochediagnosticsgmbhf.hoffmann-larocheag<120>g形夾用于改進(jìn)的等位基因特異性pcr的用途<130>27369wo<150>61/538,650<151>2011-09-23<160>16<170>patentin版本3.5<210>1<211>3633<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>尚未歸類的特征<223>egfr野生型基因<400>1atgcgaccctccgggacggccggggcagcgctcctggcgctgctggctgcgctctgcccg60gcgagtcgggctctggaggaaaagaaagtttgccaaggcacgagtaacaagctcacgcag120ttgggcacttttgaagatcattttctcagcctccagaggatgttcaataactgtgaggtg180gtccttgggaatttggaaattacctatgtgcagaggaattatgatctttccttcttaaag240accatccaggaggtggctggttatgtcctcattgccctcaacacagtggagcgaattcct300ttggaaaacctgcagatcatcagaggaaatatgtactacgaaaattcctatgccttagca360gtcttatctaactatgatgcaaataaaaccggactgaaggagctgcccatgagaaattta420caggaaatcctgcatggcgccgtgcggttcagcaacaaccctgccctgtgcaacgtggag480agcatccagtggcgggacatagtcagcagtgactttctcagcaacatgtcgatggacttc540cagaaccacctgggcagctgccaaaagtgtgatccaagctgtcccaatgggagctgctgg600ggtgcaggagaggagaactgccagaaactgaccaaaatcatctgtgcccagcagtgctcc660gggcgctgccgtggcaagtcccccagtgactgctgccacaaccagtgtgctgcaggctgc720acaggcccccgggagagcgactgcctggtctgccgcaaattccgagacgaagccacgtgc780aaggacacctgccccccactcatgctctacaaccccaccacgtaccagatggatgtgaac840cccgagggcaaatacagctttggtgccacctgcgtgaagaagtgtccccgtaattatgtg900gtgacagatcacggctcgtgcgtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaa960gacggcgtccgcaagtgtaagaagtgcgaagggccttgccgcaaagtgtgtaacggaata1020ggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaa1080aactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactcc1140ttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaa1200atcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgccttt1260gagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtc1320gtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagat1380gtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactg1440tttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaag1500gccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagccc1560agggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaac1620cttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccaccca1680gagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatc1740cagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatg1800ggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgc1860catccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatggg1920cctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtg1980gccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcgg2040aggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaac2100caagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgggctcc2160ggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaatt2220cccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctc2280gatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatc2340tgcctcacctccaccgtgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggac2400tatgtccgggaacacaaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcag2460atcgcaaagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagcc2520aggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaa2580ctgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtgcctatcaagtgg2640atggcattggaatcaattttacacagaatctatacccaccagagtgatgtctggagctac2700ggggtgactgtttgggagttgatgacctttggatccaagccatatgacggaatccctgcc2760agcgagatctcctccatcctggagaaaggagaacgcctccctcagccacccatatgtacc2820atcgatgtctacatgatcatggtcaagtgctggatgatagacgcagatagtcgcccaaag2880ttccgtgagttgatcatcgaattctccaaaatggcccgagacccccagcgctaccttgtc2940attcagggggatgaaagaatgcatttgccaagtcctacagactccaacttctaccgtgcc3000ctgatggatgaagaagacatggacgacgtggtggatgccgacgagtacctcatcccacag3060cagggcttcttcagcagcccctccacgtcacggactcccctcctgagctctctgagtgca3120accagcaacaattccaccgtggcttgcattgatagaaatgggctgcaaagctgtcccatc3180aaggaagacagcttcttgcagcgatacagctcagaccccacaggcgccttgactgaggac3240agcatagacgacaccttcctcccagtgcctgaatacataaaccagtccgttcccaaaagg3300cccgctggctctgtgcagaatcctgtctatcacaatcagcctctgaaccccgcgcccagc3360agagacccacactaccaggacccccacagcactgcagtgggcaaccccgagtatctcaac3420actgtccagcccacctgtgtcaacagcacattcgacagccctgcccactgggcccagaaa3480ggcagccaccaaattagcctggacaaccctgactaccagcaggacttctttcccaaggaa3540gccaagccaaatggcatctttaagggctccacagctgaaaatgcagaatacctaagggtc3600gcgccacaaagcagtgaatttattggagcatga3633<210>2<211>3633<212>dna<213>智人<220><221>尚未歸類的特征<223>egfr2573t>g突變型基因<400>2atgcgaccctccgggacggccggggcagcgctcctggcgctgctggctgcgctctgcccg60gcgagtcgggctctggaggaaaagaaagtttgccaaggcacgagtaacaagctcacgcag120ttgggcacttttgaagatcattttctcagcctccagaggatgttcaataactgtgaggtg180gtccttgggaatttggaaattacctatgtgcagaggaattatgatctttccttcttaaag240accatccaggaggtggctggttatgtcctcattgccctcaacacagtggagcgaattcct300ttggaaaacctgcagatcatcagaggaaatatgtactacgaaaattcctatgccttagca360gtcttatctaactatgatgcaaataaaaccggactgaaggagctgcccatgagaaattta420caggaaatcctgcatggcgccgtgcggttcagcaacaaccctgccctgtgcaacgtggag480agcatccagtggcgggacatagtcagcagtgactttctcagcaacatgtcgatggacttc540cagaaccacctgggcagctgccaaaagtgtgatccaagctgtcccaatgggagctgctgg600ggtgcaggagaggagaactgccagaaactgaccaaaatcatctgtgcccagcagtgctcc660gggcgctgccgtggcaagtcccccagtgactgctgccacaaccagtgtgctgcaggctgc720acaggcccccgggagagcgactgcctggtctgccgcaaattccgagacgaagccacgtgc780aaggacacctgccccccactcatgctctacaaccccaccacgtaccagatggatgtgaac840cccgagggcaaatacagctttggtgccacctgcgtgaagaagtgtccccgtaattatgtg900gtgacagatcacggctcgtgcgtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaa960gacggcgtccgcaagtgtaagaagtgcgaagggccttgccgcaaagtgtgtaacggaata1020ggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaa1080aactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactcc1140ttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaa1200atcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgccttt1260gagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtc1320gtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagat1380gtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactg1440tttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaag1500gccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagccc1560agggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaac1620cttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccaccca1680gagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatc1740cagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatg1800ggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgc1860catccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatggg1920cctaagatcccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtg1980gccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcgg2040aggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaac2100caagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgggctcc2160ggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaatt2220cccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctc2280gatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatc2340tgcctcacctccaccgtgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggac2400tatgtccgggaacacaaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcag2460atcgcaaagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagcc2520aggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaa2580ctgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtgcctatcaagtgg2640atggcattggaatcaattttacacagaatctatacccaccagagtgatgtctggagctac2700ggggtgactgtttgggagttgatgacctttggatccaagccatatgacggaatccctgcc2760agcgagatctcctccatcctggagaaaggagaacgcctccctcagccacccatatgtacc2820atcgatgtctacatgatcatggtcaagtgctggatgatagacgcagatagtcgcccaaag2880ttccgtgagttgatcatcgaattctccaaaatggcccgagacccccagcgctaccttgtc2940attcagggggatgaaagaatgcatttgccaagtcctacagactccaacttctaccgtgcc3000ctgatggatgaagaagacatggacgacgtggtggatgccgacgagtacctcatcccacag3060cagggcttcttcagcagcccctccacgtcacggactcccctcctgagctctctgagtgca3120accagcaacaattccaccgtggcttgcattgatagaaatgggctgcaaagctgtcccatc3180aaggaagacagcttcttgcagcgatacagctcagaccccacaggcgccttgactgaggac3240agcatagacgacaccttcctcccagtgcctgaatacataaaccagtccgttcccaaaagg3300cccgctggctctgtgcagaatcctgtctatcacaatcagcctctgaaccccgcgcccagc3360agagacccacactaccaggacccccacagcactgcagtgggcaaccccgagtatctcaac3420actgtccagcccacctgtgtcaacagcacattcgacagccctgcccactgggcccagaaa3480ggcagccaccaaattagcctggacaaccctgactaccagcaggacttctttcccaaggaa3540gccaagccaaatggcatctttaagggctccacagctgaaaatgcagaatacctaagggtc3600gcgccacaaagcagtgaatttattggagcatga3633<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>野生型引物<400>3gcacccagcagtttggcca19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型引物<400>4gcgcccagcagtttggccc19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型引物<220><221>修飾的堿基<222>(19)..(19)<223>g形夾<400>5gcgcccagcagtttggccc19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型引物<220><221>修飾的堿基<222>(18)..(18)<223>g形夾<400>6gcgcccagcagtttggccc19<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型引物<220><221>修飾的堿基<222>(17)..(17)<223>g形夾<400>7gcgcccagcagtttggccc19<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>共同引物<400>8gtcttctctgtttcagggcatgaac25<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>探針<400>9tactggtgaaaacaccgcagcatgt25<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>野生型引物<400>10atgtcaagatcacagattttgggct25<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型引物<400>11atgtcaagatcacagattttgggcg25<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>突變型引物<220><221>修飾的堿基<222>(24)..(24)<223>g形夾<400>12atgtcaagatcacagattttgggcg25<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>共同引物<400>13ctggtccctggtgtcaggaaaa22<210>14<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>探針<400>14taccatgcagaaggaggcaaagtaaggag29<210>15<211>500<212>dna<213>智人<220><221>尚未歸類的特征<223>egfr野生型小基因<400>15tcttctttcatgcgcctttccattctttggatcagtagtcactaacgttcgccagccata60agtcctcgacgtggagaggctcagagcctggcatgaacatgaccctgaattcggatgcag120agcttcttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaa180ctacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaa240aacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaaga300gaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattt360tcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcagggg420aggatgctctccagacattctgggtgagctcgcagcagctgctgctggcagctgggtcca480gccagggtctcctggtagtg500<210>16<211>500<212>dna<213>智人<220><221>尚未歸類的特征<223>egfr2573t>g突變型小基因<400>16tcttctttcatgcgcctttccattctttggatcagtagtcactaacgttcgccagccata60agtcctcgacgtggagaggctcagagcctggcatgaacatgaccctgaattcggatgcag120agcttcttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagggcatgaa180ctacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaa240aacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaaga300gaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattt360tcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgtttaacacatgcagggg420aggatgctctccagacattctgggtgagctcgcagcagctgctgctggcagctgggtcca480gccagggtctcctggtagtg500當(dāng)前第1頁12